窄葉枇杷的莖尖離體培養(yǎng)探究

摘 要 實驗研究了窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑配比和環(huán)境條件。結(jié)果表明：在相對低溫18 ℃時，外植體涂凡士林有利于褐化抵制，提高成活率；在TDZ 0.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基條件下，窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的褐化率均為0，萌動率為100%，成苗率為100%。通過建立窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)技術體系，為其他野生枇杷莖尖離體培養(yǎng)提供理論和技術參考依據(jù)。

關鍵詞 窄葉枇杷；莖尖；離體培養(yǎng)；植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號：S667.3 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.23.047

枇杷屬植物（Eriobotrya），屬薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae），主要分布在我國南部或東南亞等國。世界枇杷屬植物約有30個種或變種，而我國的枇杷屬植物種質(zhì)資源十分豐富，約占世界野生枇杷資源的2/3，廣泛分布于長江流域及其以南的各個省區(qū)[1]。普通枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.）Lindl.]是唯一栽培種，遺傳多樣性相當狹窄。野生枇杷種質(zhì)資源具有遺傳多樣性，有很高的利用價值。例如，野生枇杷具有栽培枇杷品種改良的稀缺性狀如抗病蟲、抗逆、抗倒伏等[2]；同時，野生枇杷實生苗可作為栽培枇杷的嫁接砧木[3]，且野生枇杷葉片提取物熊果酸等對癌細胞有明顯的抑制作用[4，5]。但近幾年走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于人類活動導致野生枇杷資源逐漸減少[6]，加強野生枇杷種質(zhì)資源的調(diào)查、保護和利用，是當前和未來枇杷科學研究與產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要任務。

近年，對枇杷種質(zhì)資源的相關研究，有了新突破，一些研究已經(jīng)初步建立了野生與栽培枇杷莖尖離體培養(yǎng)體系[7-9]。窄葉枇杷（Eriobotrya henryi Nakai）是野生枇杷中的一種，本實驗主要是以窄葉枇杷作為研究對象，系統(tǒng)地研究了植物生長調(diào)節(jié)劑種類與濃度的配比、培養(yǎng)環(huán)境等因素對窄葉莖尖離體培養(yǎng)和褐化的影響，目的是建立窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)技術體系，為其他野生枇杷莖尖離體培養(yǎng)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

窄葉枇杷，保存于華南農(nóng)業(yè)大學枇杷屬植物種質(zhì)資源圃。

1.2 取材與接種方法

取剛抽梢萌發(fā)，長約1.5 cm的莖尖，并及時置于25 mg/L的Vc水溶液中，帶回實驗室，去掉葉片，自來水沖洗30 min。在超凈工作臺上用無菌水沖洗3遍；再用75%（v/v）酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3遍；再用0.1%（w/v）HgCl2浸泡

7 min，然后用無菌水沖洗4遍。用刀片切掉莖尖基部褐化部分，或切口涂上凡士林，接種在相應培養(yǎng)基上，以上操作應嚴格控制在2 h以內(nèi)完成。每個處理接種40個芽。

1.3 其他培養(yǎng)條件及統(tǒng)計方法

培養(yǎng)基主要成分：MS 4.43 g/L；瓊脂 5 g/L；蔗糖 30 g/L。培養(yǎng)條件：溫度18±1 ℃，濕度65%～70%，光照24 h/d。

1.4 統(tǒng)計方法：統(tǒng)計時間為接種后第20天

褐化率（%）=褐化莖尖數(shù)/接種總數(shù)×100%

相對萌動率（%）=芽萌動數(shù)/（接種總數(shù)—褐化莖尖數(shù)）×100%

成苗率（%）=長成植株數(shù)/芽萌動數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和外植體切口涂凡士林對窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)的褐化影響

本試驗在KT 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L組合中，做了不同培養(yǎng)溫度和在同種溫度下莖尖切口涂與不涂凡士林對窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)的褐化影響。

結(jié)果如表1所示，3個不同溫度下的處理對窄葉枇杷離體培養(yǎng)的褐化程度有很大的差異。實驗表明，培養(yǎng)環(huán)境溫度越高褐化越嚴重，當溫度達到29 ℃或超越該溫度時，無論是有涂凡士林的，還是沒涂的莖尖褐化率達到100%；而培養(yǎng)溫度越低，抗褐化效果越好，當溫度降到18 ℃時，切口涂凡士林的莖尖褐化率降到9.38%，沒有涂凡士林的降到11.1%。實驗說明，溫度對窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)成功與否是一個關鍵條件。

在莖尖切口涂凡士林的處理的實驗中，實驗發(fā)現(xiàn)有涂凡士林的莖尖的褐化率比沒有涂的要低，如在18 ℃下，涂凡士林的處理褐化率為9.38%，未涂的為11.1%；25 ℃下涂凡士林的處理褐化率為27.78%，而未涂的達到40%，涂凡士林的處理效果差異明顯。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度對窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的抗褐化影響

表2顯示，在窄葉枇杷離體培養(yǎng)中，使用KT和NAA組合的褐化率很低；但在生長調(diào)節(jié)劑為KT和NAA的條件下，都無法成苗。在6-BA和NAA組合中，褐化率比KT和NAA的組合要高達到25%，相對萌動率為75%，但成苗率為0%。說明KT與6-BA相比，對窄葉枇杷抗褐化效果要好些，但莖尖的啟動萌發(fā)沒有6-BA的效果好。無論是KT或6-BA，當它們單獨使用時，都難以讓萌發(fā)的莖尖繼續(xù)生長。

在TDZ、KT、6-BA和NAA的組合中實驗中，發(fā)現(xiàn)TDZ和NAA的組合處理，褐化率為6.67%；而該組合當分別添加0.5 mg/L KT和0.5 mg/L 6-BA 時均未見褐化，且相對萌動率及成苗率均達到100%。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度對窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)葉片生長的影響

為了觀察TDZ與KT、6-BA、NAA的組合條件下，初代培養(yǎng)的生長效果，對2.2的試驗中，把編號為3～5處理的窄葉莖尖培養(yǎng)萌發(fā)葉片的長勢在第20天進行觀察統(tǒng)計分析，隨機設計2次重復。如表3所示。

從表3統(tǒng)計得出，6-BA、TDZ和NAA的組合，萌發(fā)葉片數(shù)是最多，平均達到2.89片葉，且生長勢最好。而不添加6-BA或KT的TDZ、NAA組合，葉片少，長勢弱。但方差分析結(jié)果得出，各種組合之間的差異性不大。

通過上述實驗，基本上掌握了窄葉枇杷的莖尖離體培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑條件，初步確定在6-BA

0.5 mg/L、TDZ0.5 mg/L和NAA 0.1 mg/L的組合下可以達到最佳離體培養(yǎng)效果。

3 討論

本研究通過枇杷屬植物離體培養(yǎng)的外部條件探索，得出野生枇杷種在相對低溫（18 ℃）下莖尖培養(yǎng)，對抑制褐化效果明顯。接種時，莖尖切口涂上凡士林，除了有效抵制褐化，也有利于提高萌動率。窄葉枇杷莖尖離體培養(yǎng)的試驗中，TDZ是一個不可或缺的激素，無論是莖尖的抗褐化、還是相對萌動率和成苗率，效果都很顯著，而在沒有TDZ下，使用其他植物生長調(diào)節(jié)劑只能降低褐化率和提高相對萌動率，但卻無法成苗或隨后衰亡。通過對環(huán)境條件和接種技術的試驗摸索，得到窄葉枇杷莖尖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)和生長調(diào)節(jié)劑組合，為以后其他野生枇杷屬植物的莖尖離體培養(yǎng)提供有益參考。

參考文獻

[1]林順權，楊向暉，劉成明，等.中國枇杷屬植物的自然地理分布[J].園藝學報，2004（5）：569-573.

[2]丁長奎，陳其峰，孫田林，等.中國枇杷種質(zhì)資源與枇杷的品種改良[J].中國種業(yè)，1993（4）：8-10.

[3]劉曉慧，張海嵐，林順權.枇杷若干種間嫁接組合的生長結(jié)實情況觀察（摘要）[A].中國園藝學會枇杷分會.第六屆全國枇杷學術研討會論文（摘要）集[C].中國園藝學會枇杷分會，2013.

[4]YUAN Yuan， GAO Yongshun ，SONG Gang ， et al. Ursolic acid and oleanolic acid from eriobotrya fragrans inhibited the viability of A549 cells[J]. Nat Prod Commun， 2015（10）：239-242

[5]原遠，宋剛，林順權.枇杷葉熊果酸和齊墩果酸誘導人肺癌細胞凋亡的研究[A].中國園藝學會枇杷分會.第六屆全國枇杷學術研討會論文（摘要）集[C].中國園藝學會枇杷分會，2013.

[6]王云生，胡又厘，何小龍，等.中國部分野生普通枇杷資源調(diào)查分析[J].東南園藝，2012（4）：11-15.

[7]楊鳳玲，林順權.枇杷莖尖組織培養(yǎng)初代培養(yǎng)物的建立[J].中國南方果樹，2005，34（6）：36-38.

[8]張志珂，陳彬，楊鳳玲，等.枇杷野生種的種質(zhì)資源離體保存初探[J].東南園藝，2008（3）：28-32.

[9]劉義存，岑偉儀，黃天啟，等.枇杷屬植物莖尖離體培養(yǎng)及褐化抑制研究[J].果樹學報，2014（3）：415-422.

（責任編輯：劉昀）