非洲豬瘟檢測技術(shù)研究進展

摘 要：非洲豬瘟是一種外來疫病，在我國存在輸入性風險。本文介紹了非洲豬瘟幾種診斷方法的研究進展，為該病的診斷和有效防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；鑒別診斷；檢測技術(shù)

中圖分類號：S828.28 文獻標識碼：A 文章編號：1001-0769（2016）01-0048-02

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）又稱非洲豬瘟疫，是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的一種嚴重危害豬及野豬的動物傳染病，其病程短，死亡率高達100 %。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織（OIE）要求報告的動物疫病，在我國動物病原微生物名錄中列為一類動物疫病[1-3]。我國目前尚未有發(fā)生本病的報道，但由于我國是以農(nóng)業(yè)為主的養(yǎng)豬大國，國際貿(mào)易往來頻繁，存在輸入性風險。因此，掌握ASF診斷方法，對防止ASF的傳入具有重要意義。

1 非洲豬瘟的診斷

非洲豬瘟綜合癥狀復雜，在臨床上難以和豬瘟區(qū)別診斷。豬感染ASFV后雖可產(chǎn)生特異性抗體，但這些抗體沒有中和作用，也缺乏有效的保護性。耐過豬對同型毒株的有抵抗力，但對異源毒株極為敏感，至今仍沒有可預防的疫苗?？鼓?、脾和淋巴結(jié)等是用于診斷非洲豬瘟的常用材料。送檢樣本時應盡量冷藏或浸于甘油鹽水中。根據(jù)流行病學、臨診癥狀和病理剖解可對ASF做初步診斷，確診可通過病原學檢測、血清學檢測和分子生物學檢測[4，5]。

1.1 非洲豬瘟的臨床癥狀

豬感染ASFV后的潛伏期一般為5 d～15 d，根據(jù)感染毒株毒力的不同，臨床癥狀可分為最急性、急性、亞急性和慢性四種類型。最急性型由強毒株感染引起，常無臨床癥狀突然死亡，死亡率高達100 %。急性型病豬體溫40.5 ℃～42 ℃，以高熱、出血和高死亡率為特征，精神沉郁，食欲減退，運動失調(diào)，局部皮膚發(fā)紅或發(fā)藍、可視黏膜潮紅、眼有分泌物、嘔吐、腹瀉、咳嗽、呼吸困難和懷孕母豬流產(chǎn)等癥狀，死亡率可達100 %。亞急性型由中等毒力毒株感染引起，癥狀較輕，病死率較低，間斷性發(fā)熱持續(xù)1個月之久，呼吸窘迫、關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，懷孕母豬常常流產(chǎn)。慢性型由低毒力毒株感染引起，除波狀熱、生長減慢、發(fā)育遲緩或瘦弱外，不表現(xiàn)明顯的癥狀。

1.2 非洲豬瘟實驗室檢測

1.2.1 非洲豬瘟的病原學檢測

非洲豬瘟病原學診斷主要包括病毒分離、熒光抗體試驗（FAT）、雙抗體夾心ELISA等診斷技術(shù)。

病毒分離：非洲豬瘟病毒的分離要在具有三級生物安全（BSL-3）以上的生物安全實驗室中進行，分離樣本可以是豬血液及器官組織，包括脾臟、肝臟、肺臟及心臟。豬外周血單核細胞是常用的初次分離病毒的細胞，感染ASFV時，單層豬外周血單核細胞具有血細胞吸附特性及細胞死亡，以此來指示分離的病毒呈陽性。

熒光抗體試驗（FAT）：非洲豬瘟抗原能夠與標記有熒光素的抗ASFV特異性抗

體相結(jié)合，用于野外可疑豬或?qū)嶒炇医臃N豬病變組織的ASFV抗原檢測，也可以用于鑒定無紅細胞吸附能力的毒株及區(qū)分非洲豬瘟病毒和偽狂犬病毒在細胞上形成的細胞病變。雖然該方法檢測快速、敏感性和特異性都高，但是由于實驗需要昂貴的熒光顯微鏡和高質(zhì)量的熒光標記抗體，再加上熒光素標記技術(shù)要求高，需要專業(yè)實驗員，目前該方法僅作為診斷ASFV的輔助檢測方法。

雙抗體夾心ELISA：特異性單克隆抗體包被酶標板，加入待檢樣本后，如果樣本中含有目的抗原，則抗原與單抗特異性結(jié)合，再加入抗原另一表位的酶標單抗，形成類似雙抗體夾心復合物，加入底物顯色后指示抗原的存在。Vidal等以抗非洲豬瘟病毒抗原性結(jié)構(gòu)蛋白VP73蛋白的特異單克隆抗體為基礎建立了夾心ELISA方法。INGENASA夾心ELISA試劑盒，以包被的P72（又稱P73）單抗檢測樣本中的病毒抗原，可以檢測血液及多種組織中的病毒抗原，特異性、敏感性均很好，是OIE指定的ASFV檢測試劑盒。

1.2.2 血清學檢測方法

血清學檢測方法有間接免疫熒光試驗、血凝試驗、競爭ELISA或阻斷ELISA等。

免疫熒光試驗的優(yōu)點是敏感性高和快速，但難以實現(xiàn)對樣本的大批量檢測，且自動化程度不高。FAT的優(yōu)點是簡單、特異，靈敏。但是熒光素存在非特異性染色的弊端，導致試驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性。所以FAT被OIE列為檢測ASF的輔助方法。

血凝試驗具備的優(yōu)點是靈敏度高，可以有效地降低假陽性率，可靠性強。缺點是費時，不易操作，對紅細胞的新鮮度有要求，實驗效果也受到細胞形態(tài)的直接影響，而且非血球吸附的毒株會導致假陰性，有一定的局限性，故該方法很難在ASF感染的早期做出檢測，只能作為輔助檢測。

競爭ELISA或阻斷ELISA：利用待檢血清樣本與特異酶標單抗同時或先后與包被抗原結(jié)合反應，如果待檢血清當中含有針對抗原的特異性抗體，將會抑制包被抗原與單抗的結(jié)合，樣本抑制率根據(jù)陰陽性樣本的OD值計算，從而評價陽性樣本抗體含量及結(jié)合力，與間接ELISA或夾心ELISA結(jié)果相反，顯色反應后陽性樣本檢測孔呈色淺，OD值低。該方法的出現(xiàn)為非洲豬瘟的診斷提供了一種無感染性的實驗室診斷方法，特別是對于還沒有發(fā)生非洲豬瘟疫情的國家來講更具有現(xiàn)實意義，INGENASA阻斷ELISA試劑盒，以VP73病毒蛋白為包被抗原檢測非洲豬瘟特異抗體，為OIE指定參考的非洲豬瘟診斷試劑盒。

1.2.3 分子生物學檢測方法

核酸檢測：基于多聚酶鏈式反應（PCR）的核酸檢測技術(shù)，具有易操作、敏感性高、特異性強、對樣本要求不高等優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)早期診斷，是非疫區(qū)檢測疫病的重要手段之一。根據(jù)ASFV基因組中含有的高度保守基因序列設計特異性引物進行擴增達到ASFV核酸的檢測目的。PCR技術(shù)不僅快速、靈敏，而且對檢測樣本來源要求較低，組織、血液、分泌物等都可以作為ASFV DNA的檢測樣本，能從出現(xiàn)臨床癥狀前病豬采集的樣本中檢測病毒DNA，實現(xiàn)早期診斷。

隨著分子生物學的發(fā)展，熒光定量PCR、多重PCR技術(shù)以及新興的環(huán)介導恒等溫核酸擴增技術(shù)（LAMP）等方法較普通PCR技術(shù)在ASFV核酸檢測方面顯示出了巨大的優(yōu)勢，并日益得到廣泛的應用。

目前，成熟的PCR檢測方法主要選取ASFV的P72基因作為目的基因，根據(jù)不同毒株P(guān)72基因的高度保守序列設計出引物，抽提樣本中病毒的DNA作為模板，建立的PCR方法能夠有效地檢測出脾臟等組織中的病毒。John McKillen等建立的PCR方法，可以鑒別診斷出ASF和古典豬瘟[6]。在此基礎上，Mckillen還建立了Real-time PCR，與普通PCR相比，其靈敏度和特異性更強，對樣本中的核酸可以做到實時定量檢測，同時可有效降低電泳過程中瓊脂糖凝膠對PCR結(jié)果的影響，結(jié)果更加直觀。國內(nèi)的蔣正軍、孫懷昌等也建立了Taq Man探針，取得了良好的效果。但該方法的缺點是定量PCR儀價格昂貴，成本較高，對試驗耗材要求高，偶爾會產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

Bastos等通過設計的兩對引物，建立了巢式PCR，再次從普通PCR檢出結(jié)果為陰性的60份樣本中，檢測出近20份陽性[7]。該方法也可用于檢測軟蜱體內(nèi)的ASFV，靈敏度良好。在靈敏度方面，相比于傳統(tǒng)的病毒分離法和OIE的PCR方法，Bastos等建立的巢式PCR更有優(yōu)勢。江彥增等建立了ASFV的等溫環(huán)介導擴增法，在爆發(fā)疫情的野外和不具備試驗條件的地區(qū)，該方法亦可對ASFV進行檢測[8]。

2 小結(jié)

隨著非洲豬瘟在我國周邊國家和地區(qū)的發(fā)生與流行，提示我們必須加強對非洲豬瘟的防控工作，對非洲豬瘟的診斷技術(shù)要不斷研究，盡快開發(fā)出可鑒別非洲豬瘟的快速、特異且敏感的診斷方法，這些對預防和控制非洲豬瘟在我國的流行具有十分重要的意義。

參考文獻：（10篇，略）