秈稻93-11輻射誘變突變體庫的創(chuàng)建及其篩選

龍湍　安保光　李新鵬　張維　李京琳　楊瑤華　曾翔　吳永忠黃培勁

(1海南波蓮水稻基因科技有限公司，?？?570125； 2海南神農(nóng)大豐種業(yè)科技股份有限公司，?？?570125；*通訊聯(lián)系人，E-mail：bolianrgt2015@aliyun.com)

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秈稻93-11輻射誘變突變體庫的創(chuàng)建及其篩選

龍湍1，2安保光1，2李新鵬1，2張維1，2李京琳1，2楊瑤華1，2曾翔1，2吳永忠1，2黃培勁1,2,*

(1海南波蓮水稻基因科技有限公司，?？?570125；2海南神農(nóng)大豐種業(yè)科技股份有限公司，?？?570125；*通訊聯(lián)系人，E-mail：bolianrgt2015@aliyun.com)

龍湍, 安保光, 李新鵬, 等. 秈稻93-11輻射誘變突變體庫的創(chuàng)建及其篩選. 中國水稻科學， 2016， 30(1)： 44-52.

摘要:人工誘變突變體庫是植物種質(zhì)資源創(chuàng)新和基因組功能分析的有力工具。本研究以具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀且已完成基因組測序的秈稻常規(guī)品種93-11(O. sativa ssp. indica cv. 93-11)為材料，創(chuàng)建了一個包含3617個家系的輻射誘變突變體庫。通過在M2和M3代各生育期的篩選，從該突變體庫中獲得308個表型穩(wěn)定的突變體。這些突變體的表型可以分成15類，包括株高、分蘗數(shù)、株型、穗型、小穗結(jié)構(gòu)、育性、葉色、葉型、抽穗期、苯達松抗性等，突變頻率為0.03%～2.74%。使用反向遺傳學策略，鑒定出了2個雄性不育突變體和2個苯達松敏感突變體中的基因突變位點。其中，2個雄性不育突變體的突變表型是由于CYP704B2分別在第3和第4外顯子發(fā)生堿基替換和片段缺失造成的，而2個苯達松敏感突變體的突變表型是由于CYP81A6中第1和第2外顯子分別缺失了一個7 bp和一個23 bp的片段造成的。4個突變體家系中野生型和突變體植株的分離比均符合3∶1，屬單基因隱性突變。這一秈稻突變體庫將有助于秈稻基因組的功能分析，并且為水稻遺傳改良提供了有價值的材料。

關(guān)鍵詞:秈稻； 輻射誘變； 突變體庫； 雄性不育； 苯達松敏感

水稻(Oryzasativa)是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國糧食生產(chǎn)和消費中占主導地位的口糧作物。同時，水稻還以其較小的基因組、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系、豐富的遺傳資源以及與其他禾本科作物較高的基因組共線性被選為禾本科作物基因組研究的模式植物，并成為第一個完成基因組測序的農(nóng)作物[1-3]。以粳稻品種日本晴(O.sativassp.japonicacv. Nipponbare)為參考，水稻基因組大小約為389 Mb，編碼超過50,000個基因，其中蛋白編碼基因超過39,000個[4-5]。譯解水稻基因組編碼的全部基因的功能不僅能闡明調(diào)控水稻生長發(fā)育的分子機制，也將為水稻的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

突變體是承載和表達遺傳變異的載體，通過創(chuàng)建突變體庫可以對水稻基因組進行系統(tǒng)的功能分析。創(chuàng)建水稻突變體庫的方法主要有插入突變以及物理和化學誘變兩類。插入突變是利用T-DNA、Ac/Ds、En/Spm、Tos17、nDART/aDART等水稻內(nèi)外源插入元件插入到基因組中，通過敲除或激活基因功能來創(chuàng)制突變體[6]。插入突變最大的優(yōu)勢在于插入元件的序列已知，可以便捷地通過分離和分析插入元件的側(cè)翼序列來確定插入位點和突變基因。目前，國內(nèi)外研究者已使用不同插入元件創(chuàng)建了多個水稻插入突變體庫[7-13]。這些突變體庫包含了約675,000個突變株系，從這些株系中76.9%的水稻蛋白編碼基因可以通過檢索側(cè)翼序列找到相應(yīng)突變體[14]。然而，由于插入突變體的產(chǎn)生一般要經(jīng)過組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因過程，現(xiàn)有主要插入突變體庫都選擇了粳稻品種建庫。因為組織培養(yǎng)造成了大量體細胞變異，真正由插入元件造成的突變只占到5%～10%，這降低了后續(xù)基因鑒定工作的效率[6, 14]。此外，大部分插入突變體因包含外源轉(zhuǎn)基因元件而涉及轉(zhuǎn)基因品種商業(yè)化問題，無法直接用作育種材料。

物理誘變主要是用快中子、γ射線、離子束照射植物干種子誘導突變；化學誘變則是用甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)、雙環(huán)氧丁烷(DEB)、疊氮化鈉(SA)等化學試劑浸泡植物種子誘導突變。物理和化學誘變都能在植物基因組中產(chǎn)生單堿基突變、DNA片段插入缺失、染色體重排等變異。用物理和化學誘變創(chuàng)建水稻突變體庫有兩大優(yōu)點：一是不需要轉(zhuǎn)基因步驟，操作簡便，不受秈粳基因型限制；二是能在基因組中造成隨機分布的多個突變，只需較小的群體就能完成基因組飽和突變。過去，利用物理和化學誘變突變體鑒定基因需要用費時費力的圖位克隆方法，極大限制了物理和化學誘變突變體的使用效率。但隨著定向誘導基因組局部突變(TILLING)、MutMap、MutMap+等高通量基因型鑒定技術(shù)的出現(xiàn)，這一限制已被有效解除[15-18]。目前已有多家研究單位建立起了物理和化學誘變突變體庫，并且突變體數(shù)量還在繼續(xù)增長[6, 14-16, 19]。但總體而言理化誘變突變體數(shù)量依然遠少于插入突變體，并且其中秈稻基因型的比例依然較低[14]。

在本研究中，我們使用了一個在我國具有廣泛適應(yīng)性且已完成基因組測序的優(yōu)良秈稻品種93-11(O.sativassp.indicacv. 93-11)來產(chǎn)生輻射誘變突變體庫[3]。通過對3617個突變家系的篩選共獲得了308個表型穩(wěn)定的突變體。我們進一步對其中的隱性核雄性不育突變體和苯達松敏感突變體進行了分子鑒定。該突變體庫為水稻基因組的功能分析和遺傳改良提供了有價值的秈稻突變體資源。

1材料與方法

1.1突變?nèi)后w的產(chǎn)生和種植

2013年6月在湖南省農(nóng)業(yè)科學院用鈷60對10 kg 93-11(O.sativassp.indicacv. 93-11)干種子進行輻射，輻射劑量250 GY。輻射后的種子于2013年7月播種獲得M1植株。M1分單株收種獲得M2。每個M2家系種植50株，隨機挑選6株分單株收種獲得M3。所有誘變材料均按正常大田條件種植于海南神農(nóng)大豐種業(yè)科技股份有限公司海南臨高育制種基地，單本插，株行距16.3 cm×19.8 cm。93-11干種子由湖南省水稻研究所提供。

1.2突變體篩選

在M2代全生育期目測篩選具有明顯表型變異的突變體。對其中可能的雄性不育突變體取成熟小穗用碘-碘化鉀溶液(0.6% KI，0.3% I2)進行花粉染色并鏡檢以確定花粉育性。隨機挑選1326個M2編號，取每個編號收獲的M3種子等量混合播種，種植100株，在苗期按100 mL/m2噴施1 g/L的苯達松溶液(常州精度生物科技有限公司)至葉片表面篩選苯達松敏感突變體。種植苯達松敏感突變體后代，在分蘗期按450 mL/m2噴施1 g/L的苯達松溶液至葉片表面對苯達松敏感表型進行驗證。

1.3DNA抽提和保存

DNA抽提參照CTAB法[20]，有所改動：取3 cm長的水稻葉片，在800 μL抽提緩沖液[15 g/L CTAB，1.05 mol/L NaCl，75 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15 mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一個1.5 mL離心管中。65℃水浴30 min，其間顛倒混勻。加入800 μL氯仿與異戊醇的混合液(V氯仿∶V異戊醇為24∶1)，顛倒混勻15 min。1 2000 r/min、室溫下離心10 min。吸上清450 μL，轉(zhuǎn)移到一個新的1.5 mL離心管中，加入2倍體積95%乙醇，混勻后-20℃下沉淀30 min。1 2000 r/min下離心15 min。倒掉95%乙醇，用75%乙醇洗沉淀。倒掉75%乙醇，干燥后加100 μL滅菌ddH2O溶解DNA。DNA溶解后編號裝入96孔板于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4CYP704B2和CYP81A6的測序與分析

根據(jù)CYP704B2(GenBank：NM_001055627.2)和CYP81A6(GenBank：DQ341412.1)的基因組序列設(shè)計PCR引物(表1)，并分別用來擴增無花粉型不育突變體、苯達松敏感突變體和野生型對照中的相應(yīng)基因。PCR反應(yīng)體系為2 ×Taq酶反應(yīng)母液(Sinobio)25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 40 ng，補ddH2O至50 μL。PCR程序如下：94℃下預(yù)變性10 min；94℃下變性30 s，57℃下退火30 s，72℃下延伸90 s，42個循環(huán)； 72℃下延伸10 min，16℃下10 min。PCR產(chǎn)物直接送深圳華大基因科技有限公司測序。序列返回后用DNAman 6.0進行分析。

1.5 CYP704B2和CYP81A6突變位點基因型檢測

在CYP704B2和CYP81A6突變位點兩側(cè)根據(jù)基因組序列設(shè)計引物(表1)用來鑒定相應(yīng)基因在野生型和突變體中的基因型。PCR反應(yīng)體系為10 × 反應(yīng)緩沖液1 μL，10 mmol/L dNTP 0.25 μL，10 μmol/L引物各0.25 μL，5 U/μLTaq酶(中科瑞泰)0.1 μL，模板DNA 40 ng，補ddH2O至10 μL。PCR程序為94℃下預(yù)變性3 min；94℃下變性20 s，55℃下退火20 s，72℃下延伸30 s，35個循環(huán)； 72℃下延伸7 min，16℃下10 min。CYP704B2和CYP81A6擴增產(chǎn)物分別在12%和6%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1突變體庫的創(chuàng)建和篩選

10 kg 93-11種子經(jīng)鈷60輻射后大田種植，共獲得M1植株8947株。M1植株成熟后分單株收種，從中選取有100粒以上種子的材料3617份種成M2株系，共種植約18萬株。從每個M2株系中隨機選取6個單株，分單株取葉片抽提DNA并收種，分別作為輻射誘變突變體庫的DNA池和種質(zhì)資源長期保存。

表1本研究使用的引物

Table 1. Primers used in this study.

引物Primer序列(5'-3')Sequence(5'-3')目的基因Targetlocus704B2-1FCAAAGATTGTCTCAAGGTTGGTAGCYP704B2704B2-1RGGTATTAGGCAAGGAATTCAGTTG704B2-2FTCGAAGGACAGGACGGTGACCYP704B2704B2-2RTTTGAGCAAGAGAGGAAGGATC704B2-3FGCAAGAACTAACCAAAATTCAGGCYP704B2704B2-3RGGTCAGACGGAGGTGGAGA81A6-F1CAAACTTCCAACTTTCCCGTCYP81A681A6-R1CTGACGCCTGAAACGCAG81A6-F2GCAACGGAGTGAGTAGAAGTAATCCYP81A681A6-R2CAGAAAGGTAAAACAGCAGAAGA81A6-F3GGGCGAGAAGAAGAGCATGCYP81A681A6-R3GGCACGACCTTGGGGAT81A6-F4GGTGCGACGGCAATCTCCYP81A681A6-R4GAGCAGAAAGCCCTTCCTC1907_FAGGTCGGGTTTGGGGTT1907株系中CYP704B2的突變位點1907_RGATGTTGGCAGCGTCGAACYP704B2intheline19072245_FAGCTTCGGGGACGACAAGA2245株系中CYP704B2的突變位點2245_RTGCGTCATCGCCATGTACGTCYP704B2intheline22453522-FATGAAATCTTAGTTCCACCCTCTTGCCG3522株系中CYP81A6的突變位點3522-RCTCCCTGACGATGCACTGGAGGTCYP81A6intheline35223622-FTGTTCGAGGTCTCCCTCAGCGTG3622株系中CYP81A6的突變位點3622-RCCTGCTTAAACTCCTGGGCTTCCACYP81A6intheline3622

A-單分蘗； B-矮化； C-遲抽穗； D-小穗變形； E-假病斑。左邊為突變體，右邊為野生型。

A, Monoculm; B, Dwarfism; C, Late heading; D, Malformed spikelet; E, Lesion mimic. Mutant plants or samples are on the left, and wild type plants or samples are on the right.

圖1M2家系中不同類型的突變體

Fig. 1. Different mutant phenotypes in M2families.

在M2代對突變體材料的株高、株型、分蘗數(shù)、穗型、小穗結(jié)構(gòu)、育性、葉色、葉型、抽穗期等性狀進行全生育期觀察篩選，在M3代對突變體材料的苯達松抗性進行篩選。結(jié)果共選中包括分蘗減少(圖1-A)、矮化(圖1-B)、遲抽穗(圖1-C)、小穗變形(圖1-D)、假病斑(圖1-E)等在內(nèi)的15種類型共308個突變家系，占被觀察家系總數(shù)的8.52%(表2)。如表2所示，育性相關(guān)突變出現(xiàn)的頻率最高，為2.74%(99個)，株型緊湊和早衰突變出現(xiàn)的頻率最低，均為0.03%(各1個)。其他類型突變出現(xiàn)的頻率除矮化和分蘗少高于1.00%以外，其余均低于1.00%(表2)。

2.2不育突變體的分子鑒定

為了進一步了解本突變體庫的質(zhì)量及其在水稻基因功能分析中的效用，我們以不育突變體和苯達松敏感突變體作材料開展了基因鑒定工作。水稻CYP704B2編碼一個細胞色素P450家族的蛋白，該基因缺失后導致水稻不能產(chǎn)生成熟花粉[21]。我們從99個育性突變體中挑選出11個無花粉型雄性不育突變體，用基因特異引物分別擴增這些無花粉型雄性不育突變體中的CYP704B2，將PCR產(chǎn)物測序后與野生型CYP704B2的基因組序列做比對。結(jié)果表明在1907(圖2-A，B)和2245(圖2-C，D)兩個家系的無花粉型雄性不育突變體(圖2-B，D)中，CYP704B2的基因組序列均發(fā)生了改變(圖2-E)。其中1907的突變體(1907m)在CYP704B2編碼區(qū)第794個堿基后的GGG被替換為T，造成了移碼突變和翻譯提前終止，導致野生型CYP704B2蛋白C端339個氨基酸被Tyr-Ala-Val-Thr所取代。而2245的突變體(2245m)在CYP704B2編碼區(qū)第1267個堿基后的GG發(fā)生缺失，也造成了移碼突變和翻譯提前終止，導致CYP704B2蛋白C端的220個氨基酸被丙氨酸(Ala)取代。

表2M2和M3家系中突變表型統(tǒng)計

Table 2. Summery of mutant phenotypes in M2and M3families.

表型Phenotype家系數(shù)Numberoflines頻率aFrequencya/%株高增加Increasedplantheight30.08矮化Dwarfism651.80株型緊湊Reducedtillerangle10.03分蘗少Reducedtillernumber521.44分蘗多Increasedtillernumber20.06穗型變異Malformedpanicle60.17小穗變異Malformedspikelet190.53育性Fertility992.74葉色Leafcolor20.06葉片變寬Broadleaf20.06假病斑Lesionmimic120.33早衰Prematuresenescence10.03早抽穗Earlyheading120.33遲抽穗Lateheading300.83苯達松敏感Bentazon-lethal20.15b總數(shù)Total3088.52

a突變家系在被篩選的3617個家系中出現(xiàn)的頻率；b苯達松敏感家系在被篩選的1326個家系中出現(xiàn)的頻率。

aMutation frequency in 3617 lines；bMutation frequency in 1326 lines.

為了進一步證實CYP704B2突變和表型的關(guān)系，我們分別根據(jù)1907m和2245m中的突變位點設(shè)計引物鑒定其M2家系植株的基因型。結(jié)果表明1907(圖2-F)和2245(圖2-G)家系的植株都可以分為3種基因型，其中野生基因型和突變基因型分別只能擴增出一條帶，并且前者大于后者，雜合基因型可以擴增出兩條帶，并且大小分別與野生基因型和突變基因型一致。育性調(diào)查表明所有野生和雜合基因型的植株都能正常結(jié)實，而所有突變基因型的植株均不育，即不育表型和突變基因型共分離。這表明兩個家系中的不育表型均由CYP704B2的突變造成。

對1907家系中CYP704B2突變位點雜合植株后代的遺傳分析表明，可育與不育株分別為94株和29株，符合3∶1分離(χ2= 0.07,P> 0.05)。2245家系中CYP704B2突變位點雜合植株后代中可育與不育株分別為110株和34株，也符合3∶1分離(χ2= 0.08,P> 0.05)。這說明兩個家系中的不育性狀僅由CYP704B2位點控制。

2.3苯達松敏感突變體的分子鑒定

CYP81A6編碼一個細胞色素P450家族的蛋白，該基因突變后導致水稻對苯達松敏感[22]。我們用特異引物分別擴增3522(圖3-A)和3622(圖3-B)兩個家系中苯達松敏感突變體(3522m和3622m)的CYP81A6，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與野生型CYP81A6的基因組序列進行比對。結(jié)果表明在3522m和3622m中，CYP81A6編碼區(qū)分別在第1747 bp和第586 bp后發(fā)生了23 bp和7 bp的堿基缺失(圖3-C)，兩種缺失都造成了移碼突變，導致翻譯提前終止。

為了驗證苯達松敏感表型是否由CYP81A6的突變造成，我們分別根據(jù)3522m和3622m中的突變位點設(shè)計引物鑒定兩家系M3植株的基因型。如圖3-D和3-E所示，3522和3622家系的植株都能分成野生、突變和雜合3種基因型，其中野生和突變基因型各有一條帶且前者大于后者，雜合基因型有兩條帶并分別與野生和突變基因型的帶一致。在3522和3622家系中所有野生和雜合基因型的植株都對苯達松不敏感，而所有突變基因型的植株均敏感，說明苯達松敏感表型與突變基因型共分離，表明苯達松敏感表型確是由CYP81A6的突變造成的。

挑選3522家系中CYP81A6突變位點雜合單株的后代進行遺傳分析，苯達松不敏感與敏感株分別為222株和79株，符合3∶1分離(χ2= 0.19,P> 0.05)。3622家系中CYP81A6突變位點雜合植株后代中苯達松不敏感與敏感株分別為233株和84株，也符合3∶1分離(χ2= 0.30,P> 0.05)。這說明兩個家系中的苯達松敏感表型僅由CYP81A6單基因控制。

A和B-1907家系中野生型(A)和無花粉型不育突變體(B)的花粉碘染，比例尺=100 μm；C和D-2245家系中野生型(C)和無花粉型不育突變體(D)的花粉碘染，比例尺=100 μm；E-CYP704B2的基因結(jié)構(gòu)。黑框代表編碼區(qū)；線條代表內(nèi)含子；三角指向突變位點，其中1907家系突變體(1907m)中CYP704B2第794個堿基之后的“GGG”被替換為“T”，而2245家系突變體(2245m)中CYP704B2第1267個堿基之后的“GG”缺失；F和G-1907(F)和2245(G)家系M2單株中CYP704B2突變位點的基因型檢測。圖片左邊顯示PCR產(chǎn)物大小。W-野生型；H-雜合型；M-突變型。

A and B, I2-KI staining of pollen grains of a wild type plant (A) and a mutant (B) in the line 1907, bar = 100 μm； C and D, I2-KI staining of pollen grains of a wild type plant (C) and a mutant (D) in the line 2245, bar = 100 μm； E, The structure ofCYP704B2. Black boxes represent the coding region; Lines represent introns; Triangles point to the mutation loci. “GGG” following the 794th nucleotide ofCYP704B2 is substituted by “T” in mutants of the line 1907 (1907m), and “GG” following the 1267th nucleotide ofCYP704B2 is deleted in mutants of the line 2245 (2245m)； F and G, Genotyping of theCYP704B2 loci in the lines 1907 (F) and 2245 (G). The sizes (bp) of the PCR products are shown on the left. W, Wild type; H, Heterozygote; M, Mutant.

圖2無花粉型雄性不育突變體及其分子鑒定

Fig. 2. Phenotypic and molecular characterization of two male-sterile mutants without pollen grains.

A和B-3522(A)和3622(B)家系中苯達松敏感突變體(左邊)和野生型(右邊)植株分蘗期噴施苯達松后的表型； C-CYP81A6的基因結(jié)構(gòu)。黑框代表編碼區(qū)；線條代表內(nèi)含子；三角指向突變位點，其中3522家系突變體(3522m)中CYP81A6編碼區(qū)第1747 bp后發(fā)生了23 bp缺失，而3622家系突變體(3622m)中CYP81A6編碼區(qū)第586 bp后發(fā)生了7 bp缺失；D和E-3522(D)和3622(E)家系M3單株中CYP81A6突變位點的基因型檢測。圖片左邊顯示PCR產(chǎn)物大小。W-野生型；H-雜合型；M-突變型。

A and B, Phenotypes of the bentazon-lethal mutants (left) and wild type (right) plants in the lines 3522 (A) and 3622 (B) after bentazon spraying at tillering stage； C, The structure ofCYP81A6. Black boxes represent the coding region; Lines represent introns; Triangles point to the mutation loci. A 23-bp deletion is found following the 1747th bp of the coding region ofCYP81A6 in mutants of the line 3522 (3522m), and a 7-bp deletion is found following the 586th bp of the coding region ofCYP81A6 in mutants of the line 3622 (3622m)； D and E, Genotyping of theCYP81A6 loci in the lines 3522 (D) and 3622 (E). The sizes (bp) of the PCR products are shown on the left. W, Wild type; H, Heterozygote; M, Mutant.

圖3 苯達松敏感突變體及其分子鑒定

Fig. 3. Phenotypic and molecular characterization of two bentazon-lethal mutants.

3討論

目前國內(nèi)外創(chuàng)建的水稻突變體庫大多數(shù)是粳稻遺傳背景，并多用轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生[6, 14]。本研究利用輻射誘變創(chuàng)建了一個包含3617個家系的秈稻品種93-11的突變體庫。從該庫中共篩選到308個突變家系，總突變頻率為8.52%。這些突變體可以分為包括育性和苯達松敏感在內(nèi)的15種類型，不同類型出現(xiàn)的頻率為0.03%～2.74%。我們從1326個家系中篩選到2個CYP81A6突變體，從3617個家系中篩選到2個CYP704B2突變體，提示在本突變體庫中篩選到單個目標基因突變體的概率應(yīng)該不低于0.055%～0.15%。造成CYP704B2和CYP81A6突變的原因是小片段缺失和核苷酸替換，這也是輻射誘變典型的突變類型[19]。我們的93-11突變體庫突變頻率高，突變類型豐富，增加了秈稻突變體資源并將促進秈稻基因組功能的解析。此外，93-11基因組序列已經(jīng)公布[3]，且其在我國水稻生產(chǎn)中表現(xiàn)出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適等特性，這有利于本突變體資源在水稻育種和生產(chǎn)中的直接利用。

雄性不育是水稻雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)，受到復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[23-24]。隱性核雄性不育是雄性不育的一種，可用于第三代雜交水稻技術(shù)和輪回育種群體改良技術(shù)[25-27]。CYP704B2突變后會產(chǎn)生無花粉型隱性核雄性不育突變體[21]，在上述兩個技術(shù)中均具有重大應(yīng)用潛力。目前已報道過的CYP704B2突變體是用粳稻品種9522經(jīng)鈷60輻射獲得。在該突變體中，一段包括CYP704B2大部及其上游基因一部在內(nèi)的3102 bp長的片段發(fā)生了缺失[21]。由于CYP704B2上游基因序列的刪除可能造成潛在的非目標性狀變異，這為其利用帶來不利影響。本研究鑒定了兩個新的CYP704B2突變體1907m和2245m。在這兩個突變體中CYP704B2的第3和第4外顯子分別比其野生型短2 bp，這不但避免了上下游其他基因變異可能造成的附加效應(yīng)，還能很容易地設(shè)計共顯性分子標記進行檢測，極大地方便了突變體的利用。

苯達松是一種苯并噻二唑類內(nèi)吸性稻田除草劑，能夠通過干擾光合作用中的希爾反應(yīng)殺死多種闊葉類和莎草科雜草。水稻可以通過CYP81A6編碼的細胞色素P450蛋白將苯達松羥基化而不受毒害[22]。水稻CYP81A6突變體對苯達松敏感，在雜交水稻的除雜保純和混植法制種中均具有極大的應(yīng)用潛力。農(nóng)林8號m和8077S是目前為止報道過的兩個CYP81A6突變體，其中秈稻來源的8077S對苯達松的敏感性不高，粳稻來源的農(nóng)林8號m的敏感程度明顯高于8077S。農(nóng)林8號m和8077S分別在CYP81A6的ATG起第507堿基缺失一個C和在第2058堿基缺失一個G[22]。由于上述兩個突變體中的CYP81A6都只有1 bp的缺失，因此難以用普通PCR和電泳方法進行檢測。本研究新鑒定了3622m和3522m兩個對苯達松高度敏感的突變體。在這兩個突變體中CYP81A6的第1和第2個外顯子分別缺失了一個7 bp和一個23 bp的片段，用普通的聚丙烯酰胺凝膠甚至瓊脂糖凝膠電泳就能檢測CYP81A6突變基因。此外，3622m和3522m與農(nóng)林8號m及8077S遺傳背景不同，為雜交水稻育種和生產(chǎn)提供了新的種質(zhì)資源。

謝辭：感謝馮玉濤、王露露、李秀琴、歐陽超、陳思蘭、王會進在突變體篩選方面給予的幫助。

參考文獻:

[1]Zhang Q, Li J, Xue Y, et al. Rice 2020: A call for an international coordinated effort in rice functional genomics.MolPlant, 2008, 1(5): 715-719.

[2]Goff S A, Ricke D, Lan T H, et al. A draft sequence of the rice genome (OryzasativaL. ssp.japonica).Science, 2002, 296(5565): 92-100.

[3]Yu J, Hu S, Wang J, et al. A draft sequence of the rice genome (OryzasativaL. ssp.indica).Science, 2002, 296(5565): 79-92.

[4]Kawahara Y, de la Bastide M, Hamilton J P, et al. Improvement of theOryzasativaNipponbare reference genome using next generation sequence and optical map data.Rice, 2013, 6(1): 4.

[5]IRGSP. The map-based sequence of the rice genome.Nature, 2005, 436(7052): 793-800.

[6]Wang N, Long T, Yao W, et al. Mutant resources for the functional analysis of the rice genome.MolPlant, 2013, 6(3): 596-604.

[7]Jeong D H, An S, Kang H G, et al. T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice.PlantPhysiol, 2002, 130: 1636-1644.

[8]Miyao A, Tanaka K, Murata K, et al. Target site specificity of theTos17 retrotransposon shows a preference for insertion within genes and against insertion in retrotransposon-rich regions of the genome.PlantCell, 2003, 15: 1771-1780.

[9]Wu C, Li X, Yuan W, et al. Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome.PlantJ, 2003, 35(3): 418-427.

[10]Kolesnik T, Szeverenyi I, Bachmann D, et al. Establishing an efficientAc/Dstagging system in rice: Large-scale analysis ofDsflanking sequences.PlantJ, 2004, 37(2): 301-314.

[11]Sallaud C, Gay C, Larmande P, et al. High throughput T-DNA insertion mutagenesis in rice: A first step towardsinsilicoreverse genetics.PlantJ, 2004, 39: 450-464.

[12]Hsing Y I, Chern C G, Fan M J, et al. A rice gene activation/knockout mutant resource for high throughput functional genomics.PlantMolBiol, 2007, 63: 351-364.

[13]Fu F F, Ye R, Xu S P, et al. Studies on rice seed quality through analysis of a large-scale T-DNA insertion population.CellRes, 2009, 19(3): 380-391.

[14]Wei F J, Droc G, Guiderdoni E, et al. International consortium of rice mutagenesis: Resources and beyond.Rice, 2013, 6(1): 39.

[15]Till B J, Cooper J, Tai T H, et al. Discovery of chemically induced mutations in rice by TILLING.BMCPlantBiol, 2007, 7: 19-30.

[16]Suzuki T, Eiguchi M, Kumamaru T, et al. MNU-induced mutant pools and high performance TILLING enable finding of any gene mutation in rice.MolGenetGenom, 2008, 279(3): 213-223.

[17]Abe A, Kosugi S, Yoshida K, et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap.NatBiotechnol, 2012, 30(2): 174-178.

[18]Fekih R, Takagi H, Tamiru M, et al. MutMap+: Genetic mapping and mutant identification without crossing in rice.PLoSOne, 2013, 8(7): e68529.

[19]Wu J L, Wu C, Lei C, et al. Chemical- and irradiation-induced mutants of indica rice IR64 for forward and reverse genetics.PlantMolBiol, 2005, 59(1): 85-97.

[20]Rogers S O， Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues.PlantMolBiol, 1985, 5(2): 69-76.

[21]Li H, Pinot F, Sauveplane V, et al. Cytochrome P450 family member CYP704B2 catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cutin biosynthesis and pollen exine formation in rice.PlantCell, 2010, 22(1): 173-190.

[22]張集文. 水稻苯達松敏感突變研究進展. 中國水稻科學, 2010, 24(5): 551-558.

Zhang J W. Progress on the study of the bentazon sensitive mutants in rice.ChinJRiceSci, 2010, 24(5): 551-558. (in Chinese with English abstract)

[23]Liu L， Fan X D. Tapetum: Regulation and role in sporopollenin biosynthesis inArabidopsis.PlantMolBiol, 2013, 83(3): 165-175.

[24]馬西青, 方才臣, 鄧聯(lián)武, 等. 水稻隱性核雄性不育基因研究進展及育種應(yīng)用探討. 中國水稻科學, 2012, 26(5): 511-520.

Ma X Q, Fang C C, Deng L W, et al. Research progress and breeding application of recessive genic male sterility genes in rice.ChinJRiceSci, 2012, 26(5): 511-520. (in Chinese with English abstract)

[25]鄧興旺, 王海洋, 唐曉艷, 等. 雜交水稻育種將迎來新時代. 中國科學：生命科學, 2013, 43(10): 864-868.

Deng X W, Wang H Y, Tang X Y, et al. Hybrid rice breeding welcomes a new era of molecular crop design.SciSinVitae, 2013, 43(10): 864-868. (in Chinese with English abstract)

[26]汪旭東, 周開達, 李仕貴, 等. 利用隱性核不育性進行水稻輪回育種初步研究. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2001, 14(3): 102-106.

Wang X D, Zhou K D, Li S G, et al. A preliminary study on rice recurrent breeding using recessive sterile material.SouthwestChinJAgriSci, 2001, 14(3): 102-106. (in Chinese with English abstract)

[27]Wu Y, Fox T W, Trimnell M R, et al. Development of a novel recessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maize and other cross-pollinating crops.PlantBiotechnolJ, 2015, doi: 10.1111/pbi.12477.

Construction and Screening of an Irradiation-induced Mutant Library of indica Rice 93-11

LONG Tuan1,2, AN Bao-guang1,2, LI Xin-peng1,2, ZHANG Wei1,2, LI Jing-lin1,2, YANG Yao-hua1,2,ZENG Xiang1,2, WU Yong-zhong1,2, HUANG Pei-jin1,2,*

(1Hainan Bolian Rice Gene Technology Co., Ltd., Haikou 570125, China;2Grand Agriseeds Technology, Inc., Haikou 570125, China;*Corresponding author, E-mail: bolianrgt2015@aliyun.com)

LONG Tuan, AN Baoguang, LI Xinpeng, et al. Construction and screening of an irradiation-induced mutant library of indica rice 93-11. Chin J Rice Sci, 2016, 30(1): 44-52.

Abstract:Mutant libraries are powerful tools for plant germplasm creation and functional analysis of genome. Using 93-11 (O. sativa ssp. indica cv. 93-11), an elite variety with complete genome sequences available, we established an irradiation-induced mutant library containing 3617 lines. Three hundred and eight mutant lines were obtained from M2 and M3 generations and classfied into 15 types of mutation, including plant height, tiller number, plant architecture, inflorescence architecture, spikelet architecture, fertility, leaf color, leaf shape, heading date, and bentazon resistance. The mutation frequencies ranged from 0.03% to 2.74%. Using reverse genetics approach, we found that CYP704B2 is the causal gene for two male sterile mutants and CYP81A6 is responsible for two bentazon-lethal mutations. For the two male sterile mutants, nucleotide substitution and deletion were detected in the third and fourth exons of CYP704B2, respectively. For the two bentazon-lethal mutants, a 7-bp and a 23-bp deletion were detected in the first and second exons of CYP81A6, respectively. Genetic studies revealed that wild-type plants and mutant plants segregated at 3∶1 ratio, suggesting that these mutant traits were controlled by single recessive genes. Our study showed that this mutant library is a useful resource for rice genome functional analysis and rice genetic improvement.

Key words:indica; mutagenesis by irradiation; mutant library; male sterility; bentazon-lethal

文章編號:1001-7216(2016)01-0044-09

中圖分類號:Q343.5; S511.0352

文獻標識碼:A

基金項目:海南省重大科技項目(ZDZX2013010)。

收稿日期:2015-08-18； 修改稿收到日期: 2015-10-27。