黃酮類化合物對沙門氏菌的體外抑制

◎ 李程野，杜繼紅，廖慧芬，富冠豪，李梓銘

（廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510663）

在各種的食物中毒中，沙門氏菌性食物中毒常居首位或第二位。沙門氏菌屬（Salmonella）為腸桿菌科的一個(gè)屬，廣泛分布于土壤、水、動物糞便、動物體等環(huán)境中，可通過各種途徑污染食品，如引起魚、肉類、蛋類腐敗，并使其表面變紅和變黏，導(dǎo)致食物中毒，并引發(fā)人類的傷寒、副傷寒等沙門氏菌病[1]。

沙門氏菌性食物中毒一般認(rèn)為是進(jìn)食大量活菌（105～109CFU/g）和毒素的協(xié)同作用所造成。潛伏期很短，活菌進(jìn)入腸道后繁殖，繼而侵襲腸黏膜及腸黏膜下層，引起發(fā)炎，水腫，充血和出血，可造成菌血癥和釋放內(nèi)毒素[2]。部分含VI抗原的細(xì)菌還能在吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖，據(jù)認(rèn)為VI抗原能防止細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的破壞。毒素包括內(nèi)毒素和腸毒素。內(nèi)毒素可引起發(fā)燒并增加消化道蠕動而發(fā)生嘔吐和腹瀉。由于蠕動加快，腸道內(nèi)致病菌被迅速排出體外，患者在短期內(nèi)多可恢復(fù)。腸道素能使細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶活性增高，使細(xì)胞的氯離子分泌亢進(jìn)和對離子吸收的抑制，從而引起小腸過度分泌水分和電解質(zhì)，產(chǎn)生腹瀉，因此認(rèn)為腸毒素是導(dǎo)致腹瀉的因素。

沙門氏菌除甲、乙、丙型傷寒桿菌僅對人類致病外，多種菌是動物和人類的共同致病菌；也有的對動物是致病菌，對人類是條件致病菌。由感染沙門氏菌引起的疾病統(tǒng)稱沙門氏菌病，在人類主要為傷寒、副傷寒、食物中毒和敗血癥等[3]。潛伏期平均4～12 h，最短2 h，長者達(dá)2～5 d。起病急，體溫可升高至38～40 ℃左右，伴嘔吐、腹痛、腹瀉（多為水樣便）等癥狀[4]。病情輕重程度不一，有時(shí)可出現(xiàn)傷寒或霍亂樣癥狀。一般病程短，預(yù)后較好，但嚴(yán)重者也可引起死亡。

黃酮類化合物（Flavonoid）是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類黃色色素。以C6-C3-C6為基本碳架，包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物。黃酮類化合物常應(yīng)用于植物研究領(lǐng)域，在植物體內(nèi)以苷類或碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基[5]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對類黃酮的研究集中在分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、清除自由基、藥理作用、抗輻射作用、抗癌和抗腫瘤等方面。與此同時(shí)，類黃酮對微生物的抑制和殺滅作用使類黃酮的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。國內(nèi)外對黃酮類化合物抑菌作用的研究，主要涉及抗菌能力的測定，具有抗菌能力的黃酮體種類和抑菌作用的構(gòu)效關(guān)系等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

（1）主要試驗(yàn)材料。槲皮素、蘆丁、柚皮素三種黃酮類化合物，由廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校食品化妝品教研組提供；沙門氏菌（Salmonella），由廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

（2）培養(yǎng)基。①固體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4、121 ℃高壓滅菌30 min。②液體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2～7.4、121 ℃高壓滅菌30 min。

（3）試驗(yàn)儀器。立式壓力蒸汽滅菌器YM型，上海三申醫(yī)療器械有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-500型，上海一恒科技有限公司；雙人凈化工作臺SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子恒溫水浴鍋HH-S28S型，江蘇金壇市大地自動化儀器廠；電子分析天平FA2204，上海上平儀器有限公司。試管、培養(yǎng)皿、吸管、酒精燈、接種環(huán)、三角瓶、燒杯、玻璃刮鏟、1 000 mL刻度搪瓷杯、小鋁鍋、托盤天平、分裝漏斗、漏斗架、紗布、棉塞、牛皮紙、橡皮圈、電爐。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）沙門氏菌的培養(yǎng)。配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 mL，從沙門氏菌菌種斜面挑取一環(huán)于盛有20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，放入生化培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃，培養(yǎng)24 h后，再轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱冷藏保存，備用。

（2）黃酮類化合物溶液的配制。分別稱取100 mg槲皮素、蘆丁、柚皮素，溶解于10 mL無水乙醇中，配制成濃度為10.000 mg/mL的原液，備用。

（3）不同黃酮類化合物抑菌效果測試。利用瓊脂擴(kuò)散法，取濃度為106CFU/mL的沙門氏菌菌懸液1 mL，加入100 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，吸取15 mL置無菌平皿制備含菌牛肉膏蛋白胨瓊脂平板，待凝固后，按梅花花瓣?duì)顚?只牛津杯放置于培養(yǎng)基平板表面，其中3杯分別加入濃度為10.000 mg/mL槲皮素、蘆丁、柚皮素溶液，用無水乙醇作為陰性對照，用慶大霉素針劑作為陽性對照，每組分別設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。然后再將平皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后取出觀察[6]。用游標(biāo)卡尺測量形成的抑菌圈直徑并比較其抑菌效果。每種抑菌液的排列如圖1所示。

圖1 各種抑菌液的排列方式圖

（4）不同黃酮類化合物最小抑菌濃度（MIC）的測定。配制不同濃度的黃酮類化合物，采用試管2倍稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）。試驗(yàn)中每種制劑原液（10.000 mg/mL）均用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2倍系列稀釋10個(gè)梯度，每組13支試管，各試管中加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2.5 mL，在第1管內(nèi)各加入槲皮素、蘆丁、柚皮素2.5 mL，混勻后吸取2.5 mL到第2管，混勻后吸取2.5 mL到第3管，依次類推到第10管，每管黃酮類物質(zhì)濃度見表1。第11支試管作陽性對照（慶大霉素），第12、13支管作陰性對照（生理鹽水、無水乙醇）[7]。

表1 含不同濃度黃酮類化合物的液體試管培養(yǎng)基的配制表

每組試管中分別接種沙門氏桿菌菌懸液0.05 mL，并將上述試管置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，取出試管，充分震蕩后根據(jù)其渾濁度，判斷有無菌生長。如試管中培養(yǎng)液出現(xiàn)膜狀物或混濁為“+”，無膜狀物且澄清透明為“-”，表明沙門氏菌的生長被抑制[8]。若上述試管用難以肉眼判斷其混濁度，則分別接種到對應(yīng)編號的斜面培養(yǎng)基上，置于相應(yīng)溫度培養(yǎng)，觀察沙門氏菌的生長情況[9]。導(dǎo)致沙門氏菌完全被抑制的最低黃酮類化合物濃度即為其對相應(yīng)菌株的MIC[10]。

（5）不同黃酮類化合物最小殺菌濃度（MBC）的測定。取上述物最小抑菌濃度以上未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物，分別吸取100 μl，涂布接種在不含制劑的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上[11]，置37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無菌生長，計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者即為該黃酮類化合物的最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的作用

利用瓊脂擴(kuò)散法對沙門氏菌的測定結(jié)果見表2。從表2可知，三種黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果各不相同，槲皮素對沙門氏菌的抑菌作用最強(qiáng)，蘆丁對沙門氏菌的抑菌作用次之，柚皮素對沙門氏菌的抑菌作用最低。三種黃酮類化合物抑制沙門氏菌能力大小順序?yàn)殚纹に兀咎J?。捐制に亍?/p>

表2 黃酮類化合物抑制沙門氏菌活性表

2.2 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果

不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果見表3。從表3可知，在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，三種黃酮類化合物對沙門氏菌具有不同程度的抑制作用，且各自隨著濃度的增加，抑菌作用增強(qiáng)；其中槲皮素的抑菌效果最為明顯；蘆丁次之；與之相比柚皮素的抑菌濃度最高，需要在較高濃度才能完全抑制沙門氏菌的生長。

表3 不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果表

2.3 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的最小抑菌濃度（MIC）

黃酮類化合物的最小抑菌濃度見表4。由表4可知，三種黃酮類化合物對沙門氏菌均有不同程度的抑菌作用，柚皮素的最低抑菌濃度最高，其次是蘆丁，槲皮素的抑菌濃度最低，即抑制沙門氏菌的作用最強(qiáng)。

表4 黃酮類化合物的最小抑菌濃度表

2.4 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的殺菌效果

不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的殺菌效果見表5。由表5可知，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，三種黃酮類化合物對沙門氏菌具有不同程度的殺菌作用，且各自隨著濃度的增加，殺菌作用增強(qiáng)。其中槲皮素的殺菌效果最為明顯，蘆丁和柚皮素殺菌效果次之。

表5 不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的殺菌效果表

2.5 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的最低殺菌濃度（MBC）

黃酮類化合物的最低殺菌濃度見表6。由表6可知，三種黃酮類化合物對沙門氏菌能在較低的濃度下殺菌，柚皮素稍高，蘆丁和槲皮素的殺菌濃度次之，且隨著濃度的增加，殺菌作用越強(qiáng)。

表6 黃酮類化合物的最低殺菌濃度表

3 結(jié)語

從抑菌圈試驗(yàn)、最小抑菌濃度試驗(yàn)和最低殺菌試驗(yàn)可得出，柚皮素、蘆丁、槲皮素三種黃酮類化合物，特別是槲皮素，能夠在很低的濃度下抑制沙門氏菌的生長?？傮w抑菌效果上，三種黃酮類化合物抑制沙門氏菌能力大小順序槲皮素＞蘆?。捐制に兀以跐舛雀邥r(shí)具有殺菌的作用，黃酮類化合物柚皮素、蘆丁、槲皮素對沙門氏菌的最低殺菌濃度分別為0.063、0.125、0.125 mg/mL，且隨著濃度的增加，殺菌作用越強(qiáng)。說明這三種黃酮類化合物柚皮素、蘆丁、槲皮素具有開發(fā)利用價(jià)值。

目前，黃酮類化合物對微生物的抗菌活性的研究基本集中于體外試驗(yàn)。黃酮類化合物在人和動物體內(nèi)，尤其是消化道內(nèi)對微生物活性影響的研究極少，有待進(jìn)一步深入研究[12]。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.GB4789.31-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗(yàn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[2]趙 貴，張 華.畜產(chǎn)品中沙門氏菌的危害及檢驗(yàn)方法概述[J]，貴州畜牧獸醫(yī)，2004，28（3）：21-22.

[3]郭成東，張?jiān)词?，王國杰，?伴大豆球蛋白及其水解肽對沙門氏菌生長的影響[J].食品科學(xué)，2009（17）：30-34.

[4]王章云，滕煥昭.沙門氏菌引起的食物中毒細(xì)菌學(xué)調(diào)查[J].中國人畜共患病學(xué)報(bào)，1999（3）：115.

[5]賀奮義.沙門氏菌的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006（11）：91-95.

[6]李 楊，鞠玉琳，王曉波，等.中藥連黃對耐藥沙門氏菌抑制作用的研究[J]，吉林畜牧獸醫(yī)，2007（9）：9-11.

[7]張艷紅，吳延功，杜元釗，等.沙門氏菌快速檢測方法研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2001（2）：41-43,50.

[8]謝 鵬，張敏紅.黃酮類化合物抑菌作用的研究進(jìn)展[J].中國動物保健，2004（12）：35-37.

[9]曾曉芳.畜產(chǎn)品中沙門氏菌污染的檢測與控制[J].四川畜牧獸醫(yī)，2003（4）：28-29.

[10]羅雪云等.食品衛(wèi)生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[11]杜 林，黃小丹，趙文紅，等.MIC法測定四種抗氧化劑的抑菌作用[J].中國調(diào)味品，2006（8）：40-44.

[12]方從兵，宛曉春，江昌俊.黃酮類化合物生物合成的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（4）：498-504.