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    黃酮類化合物對沙門氏菌的體外抑制

    2016-04-28 01:23:34李程野杜繼紅廖慧芬富冠豪李梓銘
    現(xiàn)代食品 2016年22期
    關(guān)鍵詞:柚皮素蘆丁槲皮素

    ◎ 李程野,杜繼紅,廖慧芬,富冠豪,李梓銘

    (廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校,廣東 廣州 510663)

    在各種的食物中毒中,沙門氏菌性食物中毒常居首位或第二位。沙門氏菌屬(Salmonella)為腸桿菌科的一個(gè)屬,廣泛分布于土壤、水、動物糞便、動物體等環(huán)境中,可通過各種途徑污染食品,如引起魚、肉類、蛋類腐敗,并使其表面變紅和變黏,導(dǎo)致食物中毒,并引發(fā)人類的傷寒、副傷寒等沙門氏菌病[1]。

    沙門氏菌性食物中毒一般認(rèn)為是進(jìn)食大量活菌(105~109CFU/g)和毒素的協(xié)同作用所造成。潛伏期很短,活菌進(jìn)入腸道后繁殖,繼而侵襲腸黏膜及腸黏膜下層,引起發(fā)炎,水腫,充血和出血,可造成菌血癥和釋放內(nèi)毒素[2]。部分含VI抗原的細(xì)菌還能在吞噬細(xì)胞內(nèi)繁殖,據(jù)認(rèn)為VI抗原能防止細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的破壞。毒素包括內(nèi)毒素和腸毒素。內(nèi)毒素可引起發(fā)燒并增加消化道蠕動而發(fā)生嘔吐和腹瀉。由于蠕動加快,腸道內(nèi)致病菌被迅速排出體外,患者在短期內(nèi)多可恢復(fù)。腸道素能使細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶活性增高,使細(xì)胞的氯離子分泌亢進(jìn)和對離子吸收的抑制,從而引起小腸過度分泌水分和電解質(zhì),產(chǎn)生腹瀉,因此認(rèn)為腸毒素是導(dǎo)致腹瀉的因素。

    沙門氏菌除甲、乙、丙型傷寒桿菌僅對人類致病外,多種菌是動物和人類的共同致病菌;也有的對動物是致病菌,對人類是條件致病菌。由感染沙門氏菌引起的疾病統(tǒng)稱沙門氏菌病,在人類主要為傷寒、副傷寒、食物中毒和敗血癥等[3]。潛伏期平均4~12 h,最短2 h,長者達(dá)2~5 d。起病急,體溫可升高至38~40 ℃左右,伴嘔吐、腹痛、腹瀉(多為水樣便)等癥狀[4]。病情輕重程度不一,有時(shí)可出現(xiàn)傷寒或霍亂樣癥狀。一般病程短,預(yù)后較好,但嚴(yán)重者也可引起死亡。

    黃酮類化合物(Flavonoid)是以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生的一類黃色色素。以C6-C3-C6為基本碳架,包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物。黃酮類化合物常應(yīng)用于植物研究領(lǐng)域,在植物體內(nèi)以苷類或碳糖基的形式存在,也有以游離形式存在的。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基[5]。

    近年來,國內(nèi)外學(xué)者對類黃酮的研究集中在分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、清除自由基、藥理作用、抗輻射作用、抗癌和抗腫瘤等方面。與此同時(shí),類黃酮對微生物的抑制和殺滅作用使類黃酮的研究進(jìn)入一個(gè)新的階段。國內(nèi)外對黃酮類化合物抑菌作用的研究,主要涉及抗菌能力的測定,具有抗菌能力的黃酮體種類和抑菌作用的構(gòu)效關(guān)系等領(lǐng)域。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    (1)主要試驗(yàn)材料。槲皮素、蘆丁、柚皮素三種黃酮類化合物,由廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校食品化妝品教研組提供;沙門氏菌(Salmonella),由廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

    (2)培養(yǎng)基。①固體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2~7.4、121 ℃高壓滅菌30 min。②液體培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 7.2~7.4、121 ℃高壓滅菌30 min。

    (3)試驗(yàn)儀器。立式壓力蒸汽滅菌器YM型,上海三申醫(yī)療器械有限公司;生化培養(yǎng)箱LRH-500型,上海一恒科技有限公司;雙人凈化工作臺SW-CJ-2FD型,蘇州凈化設(shè)備有限公司;電子恒溫水浴鍋HH-S28S型,江蘇金壇市大地自動化儀器廠;電子分析天平FA2204,上海上平儀器有限公司。試管、培養(yǎng)皿、吸管、酒精燈、接種環(huán)、三角瓶、燒杯、玻璃刮鏟、1 000 mL刻度搪瓷杯、小鋁鍋、托盤天平、分裝漏斗、漏斗架、紗布、棉塞、牛皮紙、橡皮圈、電爐。

    1.2 試驗(yàn)方法

    (1)沙門氏菌的培養(yǎng)。配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 mL,從沙門氏菌菌種斜面挑取一環(huán)于盛有20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中,放入生化培養(yǎng)箱中,調(diào)節(jié)溫度為37 ℃,培養(yǎng)24 h后,再轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱冷藏保存,備用。

    (2)黃酮類化合物溶液的配制。分別稱取100 mg槲皮素、蘆丁、柚皮素,溶解于10 mL無水乙醇中,配制成濃度為10.000 mg/mL的原液,備用。

    (3)不同黃酮類化合物抑菌效果測試。利用瓊脂擴(kuò)散法,取濃度為106CFU/mL的沙門氏菌菌懸液1 mL,加入100 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中,吸取15 mL置無菌平皿制備含菌牛肉膏蛋白胨瓊脂平板,待凝固后,按梅花花瓣?duì)顚?只牛津杯放置于培養(yǎng)基平板表面,其中3杯分別加入濃度為10.000 mg/mL槲皮素、蘆丁、柚皮素溶液,用無水乙醇作為陰性對照,用慶大霉素針劑作為陽性對照,每組分別設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。然后再將平皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng),24 h后取出觀察[6]。用游標(biāo)卡尺測量形成的抑菌圈直徑并比較其抑菌效果。每種抑菌液的排列如圖1所示。

    圖1 各種抑菌液的排列方式圖

    (4)不同黃酮類化合物最小抑菌濃度(MIC)的測定。配制不同濃度的黃酮類化合物,采用試管2倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)。試驗(yàn)中每種制劑原液(10.000 mg/mL)均用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2倍系列稀釋10個(gè)梯度,每組13支試管,各試管中加入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2.5 mL,在第1管內(nèi)各加入槲皮素、蘆丁、柚皮素2.5 mL,混勻后吸取2.5 mL到第2管,混勻后吸取2.5 mL到第3管,依次類推到第10管,每管黃酮類物質(zhì)濃度見表1。第11支試管作陽性對照(慶大霉素),第12、13支管作陰性對照(生理鹽水、無水乙醇)[7]。

    表1 含不同濃度黃酮類化合物的液體試管培養(yǎng)基的配制表

    每組試管中分別接種沙門氏桿菌菌懸液0.05 mL,并將上述試管置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后,取出試管,充分震蕩后根據(jù)其渾濁度,判斷有無菌生長。如試管中培養(yǎng)液出現(xiàn)膜狀物或混濁為“+”,無膜狀物且澄清透明為“-”,表明沙門氏菌的生長被抑制[8]。若上述試管用難以肉眼判斷其混濁度,則分別接種到對應(yīng)編號的斜面培養(yǎng)基上,置于相應(yīng)溫度培養(yǎng),觀察沙門氏菌的生長情況[9]。導(dǎo)致沙門氏菌完全被抑制的最低黃酮類化合物濃度即為其對相應(yīng)菌株的MIC[10]。

    (5)不同黃酮類化合物最小殺菌濃度(MBC)的測定。取上述物最小抑菌濃度以上未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物,分別吸取100 μl,涂布接種在不含制劑的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上[11],置37 ℃培養(yǎng)過夜,觀察有無菌生長,計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者即為該黃酮類化合物的最低殺菌濃度(MBC)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的作用

    利用瓊脂擴(kuò)散法對沙門氏菌的測定結(jié)果見表2。從表2可知,三種黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果各不相同,槲皮素對沙門氏菌的抑菌作用最強(qiáng),蘆丁對沙門氏菌的抑菌作用次之,柚皮素對沙門氏菌的抑菌作用最低。三種黃酮類化合物抑制沙門氏菌能力大小順序?yàn)殚纹に兀咎J?。捐制に亍?/p>

    表2 黃酮類化合物抑制沙門氏菌活性表

    2.2 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果

    不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果見表3。從表3可知,在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,三種黃酮類化合物對沙門氏菌具有不同程度的抑制作用,且各自隨著濃度的增加,抑菌作用增強(qiáng);其中槲皮素的抑菌效果最為明顯;蘆丁次之;與之相比柚皮素的抑菌濃度最高,需要在較高濃度才能完全抑制沙門氏菌的生長。

    表3 不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的抑菌效果表

    2.3 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的最小抑菌濃度(MIC)

    黃酮類化合物的最小抑菌濃度見表4。由表4可知,三種黃酮類化合物對沙門氏菌均有不同程度的抑菌作用,柚皮素的最低抑菌濃度最高,其次是蘆丁,槲皮素的抑菌濃度最低,即抑制沙門氏菌的作用最強(qiáng)。

    表4 黃酮類化合物的最小抑菌濃度表

    2.4 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的殺菌效果

    不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的殺菌效果見表5。由表5可知,在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中,三種黃酮類化合物對沙門氏菌具有不同程度的殺菌作用,且各自隨著濃度的增加,殺菌作用增強(qiáng)。其中槲皮素的殺菌效果最為明顯,蘆丁和柚皮素殺菌效果次之。

    表5 不同濃度的黃酮類化合物對沙門氏菌的殺菌效果表

    2.5 不同黃酮類化合物對沙門氏菌的最低殺菌濃度(MBC)

    黃酮類化合物的最低殺菌濃度見表6。由表6可知,三種黃酮類化合物對沙門氏菌能在較低的濃度下殺菌,柚皮素稍高,蘆丁和槲皮素的殺菌濃度次之,且隨著濃度的增加,殺菌作用越強(qiáng)。

    表6 黃酮類化合物的最低殺菌濃度表

    3 結(jié)語

    從抑菌圈試驗(yàn)、最小抑菌濃度試驗(yàn)和最低殺菌試驗(yàn)可得出,柚皮素、蘆丁、槲皮素三種黃酮類化合物,特別是槲皮素,能夠在很低的濃度下抑制沙門氏菌的生長??傮w抑菌效果上,三種黃酮類化合物抑制沙門氏菌能力大小順序槲皮素>蘆?。捐制に兀以跐舛雀邥r(shí)具有殺菌的作用,黃酮類化合物柚皮素、蘆丁、槲皮素對沙門氏菌的最低殺菌濃度分別為0.063、0.125、0.125 mg/mL,且隨著濃度的增加,殺菌作用越強(qiáng)。說明這三種黃酮類化合物柚皮素、蘆丁、槲皮素具有開發(fā)利用價(jià)值。

    目前,黃酮類化合物對微生物的抗菌活性的研究基本集中于體外試驗(yàn)。黃酮類化合物在人和動物體內(nèi),尤其是消化道內(nèi)對微生物活性影響的研究極少,有待進(jìn)一步深入研究[12]。

    參考文獻(xiàn):

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