葦蘑液體菌種培養(yǎng)基的優(yōu)化

王翟，趙安，班立桐，黃海東，郭雅聰，楊紅澎，王玉，黃亮

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

?

葦蘑液體菌種培養(yǎng)基的優(yōu)化

王翟，趙安，班立桐，黃海東，郭雅聰，楊紅澎，王玉，黃亮通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

摘 要：通過比較觀察相應(yīng)的種子液中菌絲球的生長狀況及其菌絲球數(shù)量、干重等指標(biāo)，從4種發(fā)酵培養(yǎng)基中選出最適合葦蘑菌絲生長的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，并采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖15 g/L、乳糖15 g/L、酵母膏4 g/L，自然條件下的pH值。通過最適培養(yǎng)基培養(yǎng)后，葦蘑菌絲干重提高到18.26 g/L。

關(guān)鍵詞：葦蘑；正交試驗(yàn)；菌絲干重；菌絲球

葦蘑為蠟傘科(Hygrophoropsidaceae)、擬蠟傘屬（Hygrophoropsis）蘑菇[1]，產(chǎn)于天津市寧河縣七里海地區(qū)蘆葦?shù)?。葦蘑屬于一種野生食用菌，具有極鮮美的味道，尤其干品具有獨(dú)特的濃郁香氣。葦蘑作為一種可再生資源，利用好則可以永續(xù)利用，但利用過度，資源會(huì)趨向枯竭以至滅絕。另外，其利用價(jià)值越大，其過度的破壞性利用程度也就越大[2]。目前，市場(chǎng)上未見葦蘑相關(guān)的開發(fā)產(chǎn)品，且對(duì)于該物種的研究主要集中在本研究室[3-4]，這主要是因?yàn)橐吧斈?shù)量稀少，尚未實(shí)現(xiàn)人工栽培。因此，通過液體培養(yǎng)來快速獲得葦蘑菌絲球，并篩選出較優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)葦蘑的生態(tài)開發(fā)及資源利用具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

葦蘑，分離于野生葦蘑子實(shí)體，保藏于天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基（草炭土培養(yǎng)基，g/L）：草炭土600、麥粒100、MgSO4·7H2O 1.5、KH2PO41、蛋白胨2、葡萄糖20、瓊脂20。

（2）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖15、乳糖15、酵母膏6，pH值調(diào)至6，115 ℃滅菌20 min。

（3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）配方如下：

配方一：葡萄糖20、K2HPO40.1、蛋白胨2、MgSO40.5、酵母膏1、KH2PO40.4。

配方二：葡萄糖10、乳糖10、酵母膏4。

配方三：大豆粉30、K2HPO41、蛋白胨3、酵母膏1、KH2PO40.5、VB10.03 mg。大豆粉需要單獨(dú)清水煮沸15 min后用紗布過濾，之后取濾液備用。

配方四（草炭土培養(yǎng)基）：草炭土600、麥粒100、MgSO4·7H2O 1.5、KH2PO41、蛋白胨2、葡萄糖20。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將新鮮斜面菌種切成小塊，每塊0.5 cm2。取2塊接至種子培養(yǎng)基（100 mL/250 mL三角瓶）中，每個(gè)瓶子中接入5塊。放置于搖床中，25 ℃，150 r/min培養(yǎng)4～7 d。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

以5%（v/v）接種量將種子轉(zhuǎn)接于新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL/250 mL三角瓶）中，25 ℃下，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)基成分根據(jù)試驗(yàn)方案逐次改變。

綜合不同配方下的葦蘑菌絲干重及菌絲球數(shù)，確定最佳基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.3 最適培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以通過搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)初步選定的培養(yǎng)基配方二，繼續(xù)在搖瓶中對(duì)葦蘑進(jìn)行液體種子培養(yǎng)。設(shè)計(jì)了L9(34)正交試驗(yàn)（表1），以確定深層培養(yǎng)的液體種子培養(yǎng)基最佳配方。以菌絲體干重及菌球數(shù)為指標(biāo)，每組2個(gè)重復(fù)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表[5]

1.3.4 菌絲體干重的測(cè)定

采用細(xì)胞干重法測(cè)定。取發(fā)酵液，3 000 r/min離心15 min，收集菌絲體，并用蒸餾水洗滌2次后，將菌絲體放在已干燥好的培養(yǎng)皿中，置于80 ℃下烘至恒重，稱量。

1.3.5 菌球數(shù)測(cè)定

將搖瓶中的發(fā)酵液搖勻，快速吸取l0 mL發(fā)酵液置于90 mm的配養(yǎng)皿中攤勻，重復(fù)3次，用方格法計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每瓶菌球總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

采用4種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行棕色蘑菇菌絲培養(yǎng)7 d后，所得菌絲量見表2。由表2看出，在相同培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)基對(duì)葦蘑菌絲體的生長狀況有一定影響，其中配方二培養(yǎng)的葦蘑菌絲體干重最大，且菌絲球數(shù)較多。作為液體菌種，菌絲量越多，越有利于后續(xù)的菌體生長，菌球數(shù)多可增加轉(zhuǎn)接后的菌絲萌發(fā)點(diǎn)。故綜合考慮，采用菌絲生長較好且菌球數(shù)最多的配方二進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

表2 不同培養(yǎng)基的葦蘑菌絲生長情況

2.2 以葦蘑菌絲干重為指標(biāo)的搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化

由表3看出，由極差分析得出的最優(yōu)水平組合為A3B3C2，即：葡萄糖15 g，乳糖15 g，酵母膏4 g，水1 000 mL，自然條件下pH值。通過極差比較，各因素對(duì)葦蘑菌絲產(chǎn)量影響為：葡萄糖＞乳糖＞酵母膏。

表3 菌絲干重的正交分析結(jié)果

2.3 以葦蘑菌絲球數(shù)為指標(biāo)的搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化

據(jù)不同液體培養(yǎng)基配方配制葦蘑種子液，接種后于搖床上恒溫振蕩培養(yǎng)5 d后，對(duì)種子液中生成的菌球進(jìn)行計(jì)數(shù)[6]（表4），將搖瓶中的發(fā)酵液搖勻，取l0 mL發(fā)酵液置于90 mm的配養(yǎng)皿中攤勻，重復(fù)3次，用方格法計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每瓶菌球總數(shù)，最終以每瓶培養(yǎng)基中形成的菌球數(shù)多少來選擇液體培養(yǎng)基配方。

表4 菌絲球數(shù)的正交分析結(jié)果

由上述的極差分析得出，最優(yōu)水平組合為A3B3C2，即：葡萄糖15 g，乳糖15 g，酵母膏4 g，水1 000 mL，自然條件下pH值。與以菌絲干重為指標(biāo)分析得出的結(jié)果相同，可見菌絲干重與菌絲球數(shù)有一定的相關(guān)性。通過極差比較，各因素對(duì)葦蘑菌絲球數(shù)影響大小為：乳糖＞酵母膏＞葡萄糖，與各因素對(duì)葦蘑菌絲體的影響順序不同，主要原因在于：葡萄糖屬于快速利用碳源，在菌絲初期生長階段作用較大，可在短時(shí)間內(nèi)增加菌絲產(chǎn)量，故以菌絲體干重為指標(biāo)時(shí)葡萄糖的影響最大；而菌絲球?yàn)檎婢后w培養(yǎng)一段時(shí)間后的特化形態(tài)，菌絲生長一般在培養(yǎng)后期葡萄糖利用完后再利用乳糖（緩慢利用碳源），故乳糖對(duì)菌絲球數(shù)的影響高于葡萄糖。后續(xù)研究可根據(jù)實(shí)際需要調(diào)整兩種糖的比例來加速葦蘑不同生長階段的培養(yǎng)過程。

3 討論與結(jié)論

液體菌種制作技術(shù)是食用菌生產(chǎn)中一項(xiàng)新型制作方式，它是生物發(fā)酵技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。隨著食用菌生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展和生產(chǎn)的規(guī)?；?、工廠化、現(xiàn)代化程度的提高，液體菌種制作技術(shù)將越來越具有廣泛的推廣價(jià)值[6]。目前液體菌種已經(jīng)用于栽培金針菇、蟹味菇、平菇等菇種，且在工廠化栽培金針菇中已經(jīng)形成產(chǎn)業(yè)化，而把液體菌種快繁技術(shù)應(yīng)用于葦蘑的發(fā)酵培養(yǎng)還未見報(bào)道[7]。

液體菌種與固體菌種相比，具有菌種生產(chǎn)周期短、菌齡整齊一致、菌絲活力強(qiáng)、接種方便、不宜感染雜菌等優(yōu)點(diǎn)，接于固體培養(yǎng)料內(nèi)，流動(dòng)性好，萌發(fā)點(diǎn)多，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景[8]。本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)確定出了最適的液體培養(yǎng)基配方，在此配方下進(jìn)行葦蘑液體搖瓶培養(yǎng)獲得的菌絲球數(shù)量多，菌絲產(chǎn)量提高至18.26 g/L，與原配方的6.66 g/L相比，提高了1.74倍。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊紅澎，黃亮，班立桐，等.天津七里海野生葦蘑科屬研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（5）：51-52.

[2]王秀云，孔愛琴.博斯騰湖野生葦蘑調(diào)查研究[J].干旱區(qū)研究，1987（4）：62-63.

[3]班立桐，楊紅澎，吳疆，等.野生葦蘑不同活性組分的體外抗氧化作用研究[J].食用菌，2010（3）：72-73.

[4]班立桐，楊紅澎，吳疆，等.超聲波法提取葦蘑多糖的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2011，3（3）：38-41.

[5]黃亮，王玉，胡炳旭，等.正交設(shè)計(jì)法篩選紫芝菌絲液體培養(yǎng)基的研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，17（2）：14-17.

[6]王瑞娟，郭倩，李玉，等.一種灰樹花液體菌種及用其栽培灰樹花的方法：200910201986[P].2010-06-16.

[7]劉永，劉永寶，劉振富.液體菌種專用培養(yǎng)基及使用方法：201010291375[P].2011-01-26.

[8]毛先兵，朱華，李葉敏，等.一種北冬蟲夏草液體菌種的生產(chǎn)方法：200910103625[P].2010-10-20.

Optimization of Liquid Medium for Weimo Mycelium

WANG Di,ZHAO An,BAN Li-tong,HUANG Hai-dong,GUO Ya-cong,YANG Hong-peng,WANG Yu,HUANG LiangCorrespongding Author
（College of Agronomy and Resource Environment,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China）

Abstract:By comparing the mycelium growth,mycelium pellets number and mycelium dry weight of Weimo,the most suitable initial fermentation medium for Weimo was selected from the four types of fermentation culture medium.Then L9(34) orthogonal experiment design was employed to optimize the medium.The determined fermentation medium as the following: glucose 15 g/L,lactose 15 g/L,yeast paste 4 g/L and the nature pH value.The dry mycelium weight of Weimo can reach to 18.26 g/L with the optimum culture medium.

Key words:Weimo; orthogonal experiment; dry mycelium weight; mycelium pellet

通信作者：黃亮（1983-），男，江蘇沭陽人，副教授，碩士，主要從事微生物發(fā)酵及食用菌相關(guān)研究。E-mail：huangliang@tjau.edu.cn。

作者簡介：王翟（1993-），女，遼寧撫順人，本科在讀，主要從事生物技術(shù)專業(yè)方面研究。E-mail：1172121661@qq.com。

基金項(xiàng)目：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“葦蘑發(fā)酵條件優(yōu)化及多糖口服液的研發(fā)”（201510061049）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目“葦蘑液體發(fā)酵條件優(yōu)化及多糖活性的研究”（20140607）

收稿日期：2015-10-16

文章編號(hào)：1008-5394（2016）01-0043-03

中圖分類號(hào)：S646.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A