重組菌絲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及重組菌絲霉素在斷奶仔豬上的應(yīng)用

李　延　萬　津　晨　光　陳代文　余　冰　何　軍*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都611130；

2.成都華羅生物科技有限公司，成都610062)

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重組菌絲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及重組菌絲霉素在斷奶仔豬上的應(yīng)用

李延1,2萬津1晨光2陳代文1余冰1何軍1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都611130；

2.成都華羅生物科技有限公司，成都610062)

摘要：本試驗旨在對重組菌絲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化篩選，并研究飼糧中添加重組菌絲霉素對斷奶仔豬生長性能、養(yǎng)分消化率和腸道微生物菌群的影響。試驗利用30 L發(fā)酵罐對畢赤酵母基因工程菌(PPle)進行液體發(fā)酵，采用分批-補料式發(fā)酵工藝，比較低鹽、基礎(chǔ)甘油和基礎(chǔ)可溶性淀粉3種不同培養(yǎng)基對重組菌絲霉素分泌表達的影響。動物試驗選用30頭24日齡健康的“杜長大”斷奶仔豬，按體重一致原則隨機分配到5個組：對照組(CON組，基礎(chǔ)飼糧)、硫酸黏菌素組(CS組，基礎(chǔ)飼糧+0.3%硫酸黏桿菌素)、抗菌肽組(AP組，基礎(chǔ)飼糧+0.2%重組菌絲霉素)、微生態(tài)制劑組(PB組，基礎(chǔ)飼糧+0.1%微生態(tài)制劑)和聯(lián)合應(yīng)用組(PPB組，基礎(chǔ)飼糧+0.2%重組菌絲霉素+0.1%微生態(tài)制劑)，試驗期21 d。結(jié)果表明：發(fā)酵到114 h，低鹽組、基礎(chǔ)甘油組和基礎(chǔ)可溶性淀粉組菌體濕重達到最高，分別為450、402、277 g/L。發(fā)酵114 h，測得發(fā)酵上清液蛋白總濃度低鹽組0.38 g/L、基礎(chǔ)甘油組3.94 g/L、基礎(chǔ)可溶性淀粉組5.63 g/L。動物試驗表明，與CON組相比，CS組和AP組顯著提高了平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)，顯著降低了料重比(F/G)(P<0.05)。與CON組相比，CS組和AP組有降低腹瀉率的趨勢(0.05

關(guān)鍵詞：重組菌絲霉素；抗菌肽；生長性能；養(yǎng)分消化率；斷奶仔豬

近50年來，抗生素用于動物生產(chǎn)，給畜牧生產(chǎn)者帶來了巨大的經(jīng)濟效益，但近20年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生活水平的提高，人們逐漸認識到抗生素會在畜產(chǎn)品中殘留及產(chǎn)生抗藥性等負面作用。因此，尋求綠色、高效、無污染和無殘留的抗生素替代品顯得尤為迫切。近年來，抗菌肽作為一種潛在的飼用抗生素替代品越來越受到研究者的青睞。Schneider等[1]報道，在2005年通過分析腐生子囊菌分泌蛋白的cDNA庫，找到了與動物防御素相似的片段，并命名為菌絲霉素。金黃色葡萄球菌在保育豬舍發(fā)病率高達15%，仔豬感染后死亡率達到70%，這對畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的危害[2]。與此同時，抗生素的濫用也給養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的危害。目前國內(nèi)外都在尋找替代抗生素的新型飼料添加劑。本實驗室在前期的研究中將菌絲霉素基因克隆進入畢赤酵母中，得到一株畢赤酵母基因工程菌(PPle)，其分泌的重組菌絲霉素可用于金黃色葡萄球菌感染的預(yù)防和治療。研究表明，重組菌絲霉素無細胞毒性，無溶血性，可作為一種潛在的非抗生素類飼料添加劑使用[3]。許多動物防御素類抗菌肽需要在很低的離子濃度情況下才能發(fā)揮其抗菌作用，而菌絲霉素作為被篩選得到的首例真菌類防御素，在生理離子濃度下就能發(fā)揮殺菌作用，且對金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌等革蘭氏陽性菌有著很強的抑制作用[1]。目前菌絲霉素主要從天然微生物中獲得，產(chǎn)量低且分離純化困難。本實驗室在前期研究中成功構(gòu)建了一株能分泌重組菌絲霉素的PPle，不僅實現(xiàn)了高水平分泌表達，且表達產(chǎn)物純度較高。為進一步降低其生產(chǎn)成本，本試驗在30 L液體發(fā)酵罐中比較了低鹽等3種不同培養(yǎng)基對PPle菌絲霉素表達水平的影響；在此基礎(chǔ)上，評估了重組菌絲霉素在斷奶仔豬上的應(yīng)用效果，以期為抗菌肽重組菌絲霉素在飼料工業(yè)上的推廣應(yīng)用積累資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

重組菌絲霉素基因工程菌PPle，本實驗室構(gòu)建。

重組菌絲霉素：粉狀制劑，由本試驗發(fā)酵制得，有效含量為30 mg/kg。

硫酸黏菌素：粉狀制劑，有效含量為20 mg/kg，購自四川恒通公司。

微生態(tài)制劑：粉狀制劑，枯草芽孢桿菌≥109CFU/g，地衣芽孢桿菌≥109CFU/g，活菌總數(shù)≥2×109CFU/g，購自蔚藍生物集團。

1.2發(fā)酵罐培養(yǎng)與產(chǎn)物檢測

1.2.1發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵罐滅菌：將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中加水至20 L進行滅菌，升溫至120 ℃滅菌30 min，待冷卻至30 ℃后設(shè)置為恒溫，用氨水溶液將pH調(diào)至5.5，通過空氣壓縮機通入空氣，打開攪動閥。

發(fā)酵罐接種：采用火焰接種法，將2級種子接種到發(fā)酵罐中。

碳源補料：先預(yù)培養(yǎng)2 h，根據(jù)溶氧(DO)值來控制碳源的流加速度，當溶氧值升高時，碳源流加速度應(yīng)當提高，反之亦然。

甲醇誘導(dǎo)：當碳源消耗殆盡后，溶氧值會迅速升高，此時進行碳源饑餓1 h。然后采用變速流加的補料方式。當pH變化不大的時候，開始誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過程應(yīng)通過開度和周期的調(diào)節(jié)將溶氧控制在在20%～30%，確保甲醇流加量和消耗量相平衡。

甲醇補料速度：共3個階段，34、51、68 mL/h。

1.2.2發(fā)酵產(chǎn)物檢測

發(fā)酵結(jié)束后，離心收集發(fā)酵上清液進行純化。將含有菌絲霉素的發(fā)酵上清液通過His親和層析純化，-20 ℃短期貯存?zhèn)溆?。采用考馬斯亮藍法檢測發(fā)酵上清液總蛋白，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測重組菌絲霉素的表達效果。將金黃色葡萄球菌ATCC 25923接種于50 mL MHB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜；將事先準備好滅菌的42 ℃ MHA培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后，涂抹上述菌液200 μL,并在無菌孔中依次加入經(jīng)2 500 U胃蛋白酶、甘氨酸-氫氧化鈉(glycine-NaOH)緩沖液(pH=10.0)和pH為2.0的甘氨酸-鹽酸(glycine-HCl)緩沖液處理4 h后的重組菌絲霉素，將平板正面向上37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察抑菌效果。

1.3動物試驗設(shè)計

試驗選用30頭24日齡健康“杜長大”(DLY)的斷奶仔豬，按照體重一致原則分配到5個組：對照組(CON組，基礎(chǔ)飼糧)、硫酸黏菌素組(CS組，基礎(chǔ)飼糧+0.3%硫酸黏桿菌素)、抗菌肽組(AP組，基礎(chǔ)飼糧+0.2%重組菌絲霉素)、微生態(tài)制劑組(PB組，基礎(chǔ)飼糧+0.1%微生態(tài)制劑)和聯(lián)合應(yīng)用組(PPB組，基礎(chǔ)飼糧+0.2%重組菌絲霉素+0.1%微生態(tài)制劑)，每個組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，試驗期21 d。于試驗第21天空腹稱重，并記錄日采食量；并于試驗第17～21天，采用內(nèi)源指示劑收糞法，進行消化試驗。

1.3.1試驗飼糧

試驗采用玉米-豆粕型飼糧作為基礎(chǔ)飼糧，參考NRC(2012)豬營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3.2飼養(yǎng)管理

本試驗在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)(動物營養(yǎng)所科研試驗基地仔豬舍)進行。試驗前對豬舍進行徹底的消毒，并清洗料槽、水槽。對試驗仔豬進行常規(guī)免疫與驅(qū)蟲。每日飼喂4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，少喂勤添，自由飲水，每個處理飼養(yǎng)管理條件一致。圈舍內(nèi)溫度保持在24～26 ℃，相對濕度控制在70%～85%。保持圈舍清潔，環(huán)境舒適，每天晚上結(jié)算余料并做相應(yīng)記錄。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 6 000 IU，VE 12.5 UI，VD3400 IU，VK32 mg，VB10.8 mg，VB62.4 mg，VB26.4 mg，VB1212 μg，葉酸 folic acid 0.2 mg，泛酸 pantothenic acid 10 mg，煙酸 nicotinic acid 14 mg。

2)礦物元素預(yù)混料為每千克飼糧提供The mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (as ferrous sulfate) 100 mg，Zn 100 mg，Cu (as copper sulfate) 6 mg，I (as ferrous sulfate) 0.3 mg，Mn (as manganese sulfate) 4 mg，Se (as sodium selenite) 0.35 mg。

3)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4樣品采集與分析

試驗期間記錄仔豬的采食量，并計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

在試驗的第17～21天樣品收集糞便，共4 d。將收集的糞便經(jīng)充分混合，置于烘箱，60～65 ℃烘2 d。樣品干燥后用粉碎機粉碎，過40目篩，收集到樣品袋中，用于測定養(yǎng)分(干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、能量、鈣、磷)表觀消化率。

每天記錄腹瀉情況，并計算腹瀉率。

腹瀉率(%)=100×腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)/

(試驗頭數(shù)×試驗天數(shù))。

糞便中DNA的提取按照Omega公司的DNA提取試劑盒的操作方法進行，隨后進行熒光定量PCR檢測，測定回腸和盲腸食糜中的總菌(total bacteria)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)和大腸桿菌(Escherichiacoli)的數(shù)量。引物和探針序列(表2)參考Qi等[4]。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗結(jié)果均用平均值和標準誤表示，先用Excel 2010作初步統(tǒng)計，再采用SAS 9.1軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較和顯著性分析檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2結(jié)果

2.1不同培養(yǎng)基對重組畢赤酵母生長和重組蛋白分泌的影響

由圖1可知，菌體在進罐18 h內(nèi)增長非常緩慢。不同培養(yǎng)基對菌體生長過程有不同的影響。前期低鹽組菌體濕重增長速率較基礎(chǔ)甘油組和基礎(chǔ)可溶性淀粉組更快。發(fā)酵到114 h，低鹽組、基礎(chǔ)甘油組和基礎(chǔ)可溶性淀粉組菌體濕重達到最高，分別為450、402、277 g/L。菌體生長在98 h后進入穩(wěn)定期。發(fā)酵114 h，即誘導(dǎo)72 h后開始放罐。取菌液離心收集上清液后，做上清液總蛋白檢測，測得低鹽組上清液蛋白總濃度0.38 g/L，基礎(chǔ)甘油組3.94 g/L，基礎(chǔ)可溶性淀粉組5.63 g/L。綜合發(fā)酵曲線數(shù)據(jù)，最終選擇基礎(chǔ)甘油組發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE檢測以及體外抑菌試驗。

由圖2可知，基礎(chǔ)甘油組誘導(dǎo)24、48、72、96 h后，均在41 ku左右出現(xiàn)了特異性條帶。

表2　熒光定量PCR特異性引物序列及探針

圖1　不同培養(yǎng)基對畢赤酵母基因工程菌生物量的影響

2.2重組菌絲霉素的體外抑菌效果

由圖3可知，重組菌絲霉素經(jīng)glycine-HCl緩沖液(pH=2.0)、glycine-NaOH緩沖液(pH=10.0)和2 500 U的胃蛋白酶處理4 h后，其對金黃色葡萄球菌仍有強烈抑菌效果。其中胃蛋白酶處理之后抑菌效果與對照組相似，表明該重組菌絲霉素對胃蛋白酶耐受能力較強，進入胃后不易被降解，穩(wěn)定性較好。

M：標記，1:誘導(dǎo)96 h，2:誘導(dǎo)72 h，3:誘導(dǎo)48 h，4:誘導(dǎo)24 h。

M：marker，1: induction 96 h， 2: induction 72 h， 3: induction 48 h， 4: induction 24 h.

圖2重組菌絲霉素SDS-PAGE圖片

Fig.2SDS-PAGE picture of the recombinant

plectasin

2.3重組菌絲霉素對斷奶仔豬生長性能的影響

如表3所示，與CON組相比，CS組和AP組顯著增加了ADFI(P<0.05)。CS、AP和PPB組與CON組相比極顯著提高了ADG(P<0.01)，以及極顯著降低了F/G(P<0.01)。與CON組相比，CS組和AP組有降低腹瀉率的趨勢(0.05

3:胃蛋白酶處理，4:甘氨酸-鹽酸緩沖液處理，5:甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液處理，6:對照。

3: pepsin treatment, 4: glycine-HCl buffer treatment, 5: glycine-NaOH buffer treatment, 6: control.

圖3重組菌絲霉素抑菌圖(處理4 h)

Fig.3Antibacterial picture of the recombinant plectasin

(treatment for 4 h)

2.4重組菌絲霉素對斷奶仔豬養(yǎng)分消化率的影響

由表4可知，與CON組和AP組相比，其余3

個組顯著提高了粗灰分的表觀消化率(P<0.05)，但CON組和AP組之間差異不顯著(P>0.05)。PB組磷的表觀消化率極顯著高于其余4個組(P<0.01)。CON組粗脂肪的表觀消化率顯著低于其余4個組(P<0.05)。CON組在能量和干物質(zhì)的表觀消化率上有低于其余4個組的趨勢(0.05

2.5重組菌絲霉素對斷奶仔豬腸道微生物菌群的影響

從圖4可知，與其余各組相比，AP組顯著提高了回腸食糜雙歧桿菌的數(shù)量(P<0.05)，PB組顯著提高了回腸食糜乳酸桿菌的數(shù)量(P<0.05)。

由圖5可知，與CON組相比，AP組顯著降低了盲腸食糜中大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05)，PB組顯著提高了盲腸食糜中芽孢桿菌的數(shù)量(P<0.05)。

表3　不同處理對斷奶仔豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。表4同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as Table 4.

表4　不同處理對斷奶仔豬養(yǎng)分消化率的影響

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig. 5.

圖4不同處理對斷奶仔豬回腸微生物的影響(PCR結(jié)果)

Fig.4Effects of different treatments on ileum microflora of weaning piglets (PCR results)

圖5　不同處理對斷奶仔豬盲腸微生物的影響(PCR結(jié)果)

3討論

發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的質(zhì)量在很大程度上決定了菌種的生長速度和生物量[5]。甘油是畢赤酵母生長過程中使用最普遍的碳源，甘油的濃度決定了菌體生長的好壞。文獻中有報道將葡萄糖作為碳源其性價比優(yōu)于甘油[6]。而可溶性淀粉因其價格便宜，經(jīng)過高溫可水解成麥芽糖和葡萄糖，故選擇可溶性淀粉作為碳源可大大節(jié)約生產(chǎn)成本。

由于BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基成本低，組成簡單，能滿足畢赤酵母生長所需的養(yǎng)分，且能使畢赤酵母成功分泌外源蛋白，在工業(yè)化培養(yǎng)中應(yīng)用很廣[7-9]。畢赤酵母外源基因表達既可在胞內(nèi)也可分泌到胞外。由于發(fā)酵培養(yǎng)基中無外源蛋白，且畢赤酵母自身所分泌的內(nèi)生蛋白少，故對發(fā)酵產(chǎn)物的后續(xù)純化帶來便利。

劉斌[10]選擇pH、溫度和甲醇添加量為自變量因素，通過響應(yīng)面法，使得重組人源膠原蛋白表達量達到19.49 g/L。Zhao等[11]通過降低25%的BSM鹽濃度，將人血清蛋白干擾素表達量提高到215 mg/L。即使是同一表達系統(tǒng)，但對于不同的外源蛋白，其表達量存在很大差異。這可能是由于外源基因自身序列和表達條件的不同所造成。

畢赤酵母的生長和表達主要分為2個階段。第1階段為以甘油等碳源為主的生長期，此時期主要以積累菌體為目的，待到碳源耗盡，開始進入第2階段的誘導(dǎo)表達。第2階段主要通過流加甲醇作為其分泌表達的碳源。江學(xué)斌[12]通過比較間歇流加、恒速流加和指數(shù)流加對畢赤酵母生長和表達規(guī)律的影響，發(fā)現(xiàn)分段控制工藝發(fā)酵效果最好，發(fā)酵菌體濕重達到415 g/L，這與本試驗結(jié)果一致。發(fā)酵過程中pH的控制是通過補加氨水來實現(xiàn)的。氨水既能調(diào)節(jié)酸堿平衡，也能為畢赤酵母生長提供氮源。有研究報道，pH在3～7之間，畢赤酵母均能良好生長，且pH恒定在5時，外源蛋白分泌量最高[13]。發(fā)酵過程中pH主要影響畢赤酵母中酶的活性、細胞膜通透性以及中間代謝產(chǎn)物的離解。本研究表明，pH在5.5時重組菌絲霉素分泌量最高。畢赤酵母分泌表達產(chǎn)物活性高低與發(fā)酵溫度也密切相關(guān)。溫度升高，畢赤酵母代謝速率加快，誘導(dǎo)表達期提前到來，但溫度過高又會導(dǎo)致酶失活，菌體出現(xiàn)衰老，發(fā)酵周期縮短，影響誘導(dǎo)表達產(chǎn)量。研究報道，畢赤酵母生長最適溫度為28 ℃，誘導(dǎo)表達最適溫度為30 ℃，誘導(dǎo)期溫度過高容易導(dǎo)致酵母細胞死亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度在30 ℃，菌體生長良好，誘導(dǎo)表達結(jié)果比較理想。本實驗室前期搖瓶試驗發(fā)現(xiàn)，重組菌絲霉素的表達量僅達到143 mg/L，可能原因是搖瓶無法控制溫度、pH和溶氧，且無法控制甲醇的流加速度。根據(jù)畢赤酵母生長特點，結(jié)合分批-補料發(fā)酵技術(shù)，分別補加生長期碳源(甘油)，誘導(dǎo)表達期碳源(甲醇)和氮源(氨水)，通過溶氧情況來調(diào)節(jié)補加速度。當溶氧出現(xiàn)迅速上升后開始補加碳源，直至溶氧值控制在20%左右。

本試驗菌體在進罐18 h內(nèi)增長非常緩慢，可能原因是接種量小，菌體密度低。開始流加甲醇時，初期溶氧迅速下降，故需注意流加速度。雖然基礎(chǔ)可溶性淀粉組測得蛋白總濃度最高，但通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白幾乎沒有，加之其菌體生長曲線不符合畢赤酵母生長規(guī)律，推測發(fā)酵過程中由于淀粉類物質(zhì)不易被酵母細胞所利用，導(dǎo)致大部分酵母細胞發(fā)生菌體自容現(xiàn)象，從而導(dǎo)致菌體總蛋白濃度偏高。綜合考慮菌體生長曲線，篩選出最適培養(yǎng)基為基礎(chǔ)甘油組。

通過SDS-PAGE檢測，由圖可以看出基礎(chǔ)甘油組發(fā)酵上清液中雜蛋白少，目的條帶清晰，說明誘導(dǎo)表達產(chǎn)物純度較高。通過酸、堿和胃蛋白酶處理4 h后，重組菌絲霉素抗菌肽對金黃色葡萄球菌依然有強烈抑菌效果，可能是由于重組菌絲霉素分子里含有3個二硫鍵，使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被降解。

目前，飼糧中添加抗菌肽對斷奶仔豬生長性能的影響報道較多。抗菌肽由于其抗菌譜廣，耐藥性低，抗菌作用迅速而備受關(guān)注。Yoon等[15]通過比較飼糧中添加阿泊拉霉素和不同劑量抗菌肽A3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著抗菌肽A3添加劑量的增多，能顯著提高斷奶仔豬ADG，但對ADFI無影響；添加抗菌肽A3后，能顯著提高粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)的消化率。Xiong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在保育料中添加復(fù)合抗菌肽可極顯著提高ADG和ADFI，極顯著降低F/G，對斷奶仔豬的生長性能起到了較好的改善作用。Wang等[17]在飼糧中添加乳鐵蛋白抗菌肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組(無抗生素的基礎(chǔ)飼糧)相比，抗菌肽組極顯著提高了斷奶仔豬的ADG，增幅達到了41.8%，顯著降低了F/G。本試驗研究結(jié)果表明，與CON組相比，AP組顯著提高了ADG和ADFI，顯著降低了F/G，有提高能量、粗脂肪、干物質(zhì)等養(yǎng)分消化率的趨勢，以及降低斷奶仔豬腹瀉率的趨勢。AP組與CS組相比，差異不顯著，說明在生長性能方面，菌絲霉素能起到與抗生素相類似的效果。但是也存在不一致的報道。Shan等[18]和Wu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加復(fù)合抗菌肽對斷奶仔豬ADFI無影響，這可能是由于斷奶日齡和體重的不同所造成。菌絲霉素通過與帶負電荷的微生物細胞膜結(jié)合并插入膜內(nèi)，導(dǎo)致細胞膜空洞的形成，細胞內(nèi)容物滲漏，從而殺滅病原菌。大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致仔豬腹瀉，是一類有害菌。乳酸桿菌是研究報道中較為常見的一類有益菌，在消化道內(nèi)乳酸桿菌能產(chǎn)生乳酸，消耗氧氣，與病原菌搶占腸黏膜結(jié)合位點來抑制病原菌的生長繁殖，乳酸桿菌還能抑制細菌細胞膜的生成。芽孢桿菌能產(chǎn)生多種消化代謝的酶，分解飼料中的抗營養(yǎng)因子，提高飼料利用率。雙歧桿菌能輔助治療慢性腹瀉和便秘，是一類有益菌[20]。本研究結(jié)果表明，添加重組菌絲霉素后能顯著提高回腸食糜中雙歧桿菌的數(shù)量，顯著降低盲腸食糜中大腸桿菌的數(shù)量。菌絲霉素能殺滅有害菌，減少有害菌對腸道黏膜結(jié)合位點的競爭，促進有益菌的生長繁殖，從而維持動物腸道微生物菌群的平衡。由于抗生素對腸道內(nèi)菌群的殺滅是廣譜的，殺滅有害菌的同時也會減少腸道內(nèi)有益菌的數(shù)量，不利于微生物菌群的平衡。由此可見，應(yīng)用菌絲霉素替代抗生素，可有效維護腸道微生物菌群的平衡。重組菌絲霉素進入體內(nèi)后，通過抑制腸道內(nèi)有害微生物的生長，給有益微生物提供了良好的生存空間，更多的有益微生物能促進腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而改善仔豬生長性能，提高養(yǎng)分消化率。

4結(jié)論

該研究結(jié)果證實了本實驗室發(fā)酵產(chǎn)品重組菌絲霉素在飼料添加劑行業(yè)中具有較大的應(yīng)用價值及開發(fā)前景，在斷奶仔豬飼糧中添加重組菌絲霉素能改善斷奶仔豬生長性能，提高養(yǎng)分表觀消化率，維護腸道微生物菌群的平衡。在今后的研究中還應(yīng)對發(fā)酵條件進一步優(yōu)化，同時完善該抗菌肽產(chǎn)品的加工工藝，使之更符合動物生理特點。

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(責任編輯陳燕)

Recombinant Plectasin： Screening of Fermentation Medium and Application for Weaning piglets

LI Yan1,2WAN Jin1CHEN Guang2CHEN Daiwen1YU Bing1HE Jun1*

(1.Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Ministry of Education, Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China； 2. Chengdu Hualuo Bio-Tech Co., Ltd., Chengdu 610062, China)

Abstract:The study was aimed to investigate the optimization and screening of fermentation medium for the recombinant plectasin, and the effects of recombinant plectasin on growth performance, nutrient digestibility and intestinal microflora in weaning pigs. In the present study, the liquid fermentation was used to prepare the recombinant plectasin in a 30 L fermenter by using batch-fermentation process, and subsequently the expression levels of recombinant plectasin with low salt, basal glycerin and basal soluble starch mediums were compared. Thirty healthy piglets (Duroc× Landrace×Yorkshire) weaned at 24 d were selected and randomly allotted to five groups according to their initial BW. The groups consisted of control group (CON group, a basal diet without antibiotic), sulfuric acid colistin group (CS group, basal diet+0.3% sulfuric acid colistin), antimicrobial peptide group (AP group, basal diet+0.2% recombinant plectasin), probiotics group (PB group, basal diet+0.1% probiotics) and joint application group (PPB group, basal diet+0.2% recombinant plectasin+0.1% probiotics). The experiment lasted for 21 days. The results showed that the wet weight of bacteria in low salt group, basal glycerol group and basal soluble starch group reached the highest value at 114 hours of fermentation, which were 450, 402 and 277 g/L, respectively; the concentrations of total protein in supernatant were 0.38, 3.94 and 5.63 g/L, respectively. Animal trial results showed that compared with CON group, average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and ratio of feed to gain (F/G) were significantly increased (P<0.05) and diarrhea incidence tended to decrease in CS and AP groups (0.05

Key words:recombinant plectasin; antimicrobial peptide; growth performance; nutrient digestibility; weaning piglets

*Corresponding author, professor, E-mail: hejun8067@163.com

中圖分類號：S816.7；S828

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)01-0208-09

作者簡介：李延(1990—)，男，四川成都人，碩士研究生，從事豬的營養(yǎng)研究。E-mail: m18782044216@163.com*通信作者：何軍，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail： hejun8067@163.com

基金項目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(201403047)；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(IRT13083)

收稿日期：2015-07-02

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.027