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    流體剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞miR-21和miR-199a表達(dá)的影響

    2016-04-26 09:29:04王玉彩劉振東趙穎馨
    生物信息學(xué) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:剪切力表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞

    張 燕,王玉彩,劉振東,趙穎馨,張 華

    (1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 濟南 250062;

    2.濟南大學(xué),山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 濟南 250022;

    3.山東省齊河縣人民醫(yī)院,山東齊河 251100)

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    流體剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞miR-21和miR-199a表達(dá)的影響

    張燕1,2,3,王玉彩3,劉振東1*,趙穎馨1,張華1

    (1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 濟南 250062;

    2.濟南大學(xué),山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 濟南 250022;

    3.山東省齊河縣人民醫(yī)院,山東齊河 251100)

    摘要:為探討流體剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞micorRNAs表達(dá)的影響。采用旋轉(zhuǎn)錐形圓盤剪切力系統(tǒng)對內(nèi)皮細(xì)胞分別加載低(4 dyn/cm2)、中(10 dyn/cm2)和高(15 dyn/cm2)3種不同梯度的剪切力作用24h。對照組未加載剪切力。采用高通量篩選芯片檢測microRNAs表達(dá)變化,qRT-PCR驗證,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。與對照組比較,低剪切力組表達(dá)差異的microRNAs有33個(FC>1.5或<0.5倍,P<0.05),其中28個上調(diào),5個下調(diào);中剪切力組表達(dá)差異的microRNAs有8個(FC>1.5或<0.5倍,P<0.05),其中6個上調(diào),2個下調(diào);高剪切力組表達(dá)差異的microRNAs有31個(FC>1.5或<0.5倍,P<0.05),其中25個上調(diào),6個下調(diào)。miR-21在高剪切力組中上調(diào)最顯著(FC = 0.026), 在低剪切力組中顯著下調(diào)(FC = 3.531)。miR-199a在低剪切力組中上調(diào)最顯著(FC = 0.075),在高剪切力組中顯著下調(diào)(FC = 3.031)。表達(dá)差異的microRNA的靶基因主要與內(nèi)皮細(xì)胞的力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞跨膜遷移、鈣離子信號通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用等相關(guān)。流體剪切力可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-21和miR-199a表達(dá)發(fā)生改變。

    關(guān)鍵詞:剪切力;內(nèi)皮細(xì)胞;microRNA;表達(dá)

    血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell, EC)是連接血流和血管壁的重要結(jié)構(gòu),是血流剪切力(Shear stress, SS)作用的靶細(xì)胞,其功能障礙是導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素。研究表明[1-3],不同梯度的血流剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞的影響不同。microRNA是一類高度保守、內(nèi)源性非蛋白編碼小分子RNA,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、代謝以及多種生物組織生長發(fā)育的重要過程[4],并且在機械生物力調(diào)節(jié)血管細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)中也發(fā)揮著不可或缺的作用[5-6]。但目前,血流剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響仍不清楚。本研究旨在通過高通量芯片篩選技術(shù),探討剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響。

    1材料和方法

    1.1主要材料

    人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Cascade Biologics公司),TRIzol試劑(Invitrogen公司),microRNA高通量篩選芯片(Exiqon公司), microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Exiqon公司),miR-21和miR-199a PCR引物(Exiqon公司),U6引物(Exiqon公司),microRNA SYRB Green實時熒光定量試劑盒(Exiqon公司)。Res(純度99.12%)購于陜西賽德生物股份有限公司,TRIzol試劑購于Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司;小鼠FITC標(biāo)記的抗CD4、PE標(biāo)記的CD25抗體購于eBioscience公司;mirVanaPARIS試劑盒購于Ambion公司,Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix (SYBR Green)等PCR相關(guān)產(chǎn)品均購自天根特殊化科技有限公司;AG490購自Sigma公司;STAT3及其磷酸化(Tyr705)抗體(p-STAT3)、β-tubulin購于Bioworld公司。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

    將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞計數(shù)后種植在載玻片上,在含5% CO2的混合氣體,溫度為37℃的環(huán)境下培養(yǎng),長滿后用于實驗。應(yīng)用旋轉(zhuǎn)錐形圓盤剪切力系統(tǒng)對培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分別加載低(4 dyn/cm2)、中(10 dyn/cm2)和高(15 dyn/cm2)3種不同梯度的剪切力作用24 h。對照組未加載剪切力作用。

    1.2.2總RNA提取

    剪切力作用結(jié)束后,將收集的細(xì)胞用TRIzol裂解,冰上靜置5 min后,加入氯仿,劇烈震蕩15 s,15~30℃下孵育2~3 min,于4 ℃、12 000 g條件下離心15 min,將上清移至新的離心管,加入等體積異丙醇并混勻,冰上靜置10 min,4 ℃、12 000 g條件下離心5 min。去上清,沉淀加入75%乙醇洗滌,漩渦振蕩30 s后,于4 ℃,7 500 r/min離心5 min,DEPC(Diethypyrocar-bonate)水溶解RNA。凝膠電泳鑒定提取RNA的完整性,紫外分光光度儀測定RNA的含量和純度。

    1.2.3microRNA表達(dá)譜檢測

    采用Exiqon公司提供的microRNA高通量篩選芯片,并按說明書檢測microRNA的表達(dá)譜,篩選表達(dá)差異的microRNA。1 μg總RNA用poly (A) polymerase和ATP作用后。microRNA被加上poly (A),按Flash Tag Biotin HSR Ligation標(biāo)記并與芯片雜交,洗脫未雜交的分子后,采用Affymetrix掃描儀對芯片進(jìn)行掃描,生成數(shù)據(jù)并分析差異表達(dá)。差異表達(dá)以變化倍數(shù)(Fold of change,F(xiàn)C)表示。

    1.2.4microRNA qRT-PCR驗證

    選擇miR-21和miR-199a用實時定量PCR(qRT-PCR)驗證。cDNA合成操作嚴(yán)格按microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μl,模板RNA為25 ng。反應(yīng)條件為:42 ℃,60 min;95 ℃,5 min,反應(yīng)結(jié)束后直接用于PCR反應(yīng)或-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR使用ABI 7 500檢測系統(tǒng)進(jìn)行,以rRNA U6作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μl,反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性10 min;95 ℃變性20 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次?;蛳鄬Ρ磉_(dá)水平采用2-△△Ct法計算[7-8],計算公式為:△Ct值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值,△△Ct=△Ct實驗-△Ct對照。表1為相關(guān)分析的引物序列。

    表1 microRNA實時定量PCR檢測相關(guān)引物序列

    1.2.5microRNA靶基因預(yù)測和富集

    采用miRanda、PicTar、TargetScan及miRBase 4個實時更新的在線數(shù)據(jù)庫聯(lián)合預(yù)測,將其交集的基因集合作進(jìn)一步分析。采用跨平臺芯片與路徑數(shù)據(jù)的綜合分析(Integrated analysis of Cross-platform MicroArray and Pathway data,IncroMAP)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因富集分析[9],以P< 0.01為顯著性閾值,分別得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和疾病通路。該數(shù)據(jù)庫包含靶基因的生物學(xué)過程和分子功能分析,最新IncroMAP數(shù)據(jù)庫可從網(wǎng)址(http://www.ra.cs.uni-tuebingen.de/software/InCroMAP/)免費下載,并附有Video使用教程。

    1.3統(tǒng)計學(xué)分析

    qRT-PCR檢測數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗分析,P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1高通量篩選表達(dá)差異的microRNAs

    內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同梯度剪切力作用后,與對照組比較,低剪切力組表達(dá)差異的microRNAs有33個(FC>1.5或<0.5倍,P<0.05),其中28個上調(diào),5個下調(diào);中剪切力組表達(dá)差異的microRNAs有8個(FC>1.5或<0.5倍,P<0.05),其中6個上調(diào),2個下調(diào);高剪切力組表達(dá)差異的microRNAs有31個(FC>1.5或<0.5倍,P<0.05),其中25個上調(diào),6個下調(diào)。表2為不同剪切力作用的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)差異的microRNAs。表達(dá)差異的microRNAs的聚類熱圖(圖1)也顯示出相同的結(jié)果,表達(dá)程度相似的microRNA聚類在一起,從綠色*到紅色*表達(dá)水平依次增高。其中,miR-21在高剪切力組中上調(diào)最顯著(FC=8.91), 在低剪切力組中顯著下調(diào)(FC=0.47)。miR-199a在低剪切力組中上調(diào)最顯著(FC=9.27),在高剪切力組中顯著下調(diào)(FC=0.33)。

    圖1 不同剪切力作用后內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)差異的  microRNAs聚類熱圖*Fig. 1 The heat map of differential expressed   microRNAs in endothelial cells after   effected by different shear stress

    注:*彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/index.aspx)(2016年第1期)。

    2.2qRT-PCR鑒定表達(dá)差異的microRNA

    選取在低及高剪切力組表達(dá)差異最顯著的miR-21和miR-199a進(jìn)行qRT-PCR檢測。以rRNA U6作為內(nèi)參,對照組及低、中、高剪切力組miR-21表達(dá)分別為4.34、2.52、7.69和9.58,miR-199a表達(dá)分別為3.03、6.76、2.28和1.43。與對照組比較,低剪切力組miR-21顯著下調(diào),miR-199a顯著上調(diào)(P< 0.05);高剪切力組miR-21顯著上調(diào),miR-199a顯著下調(diào)(P< 0.05)。圖2為miR-21和miR-199a擴增和融解曲線圖,圖3為miR-21及miR-199a qRT-PCR表達(dá)水平。

    表2 3組內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)差異microRNAs

    2.3microRNAs靶基因的預(yù)測及富集

    對在低及高剪切力組內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)變化的39個microRNA的靶基因進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測,結(jié)果顯示,靶基因數(shù)目有396個。對預(yù)測的靶基因富集后,GO(Gene Ontology)功能分析表明,這些靶基因與免疫應(yīng)答、細(xì)胞跨膜遷移、力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)。KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路分析表明,這些信號通路主要與免疫應(yīng)答(如:PI3K-Akt、細(xì)胞受體信號通路)、鈣離子信號通路以及細(xì)胞內(nèi)吞作用等相關(guān)。表3為has-miR-21和has-miR-199a GO基因功能分析主要結(jié)果,表4為has-miR-21和has-miR-199a KEGG信號通路分析主要結(jié)果。

    圖2 miR-21和miR-199a qRT-PCR擴增和融解曲線圖Fig. 2 qRT-PCR amplification and melting cures of miR-21 and miR-199a

    圖3 miR-21及miR-199a qRT-PCR表達(dá)水平Fig. 3 The expression of miR-21 and miR-199a using qRT-PCR

    has-miR-21has-miR-199aGO術(shù)語基因個數(shù)所占百分比P值GO術(shù)語基因個數(shù)所占百分比P值Intracellularnon-membrane-boundedorgan-elle6817.22.46×10-5Regulationoftranscription6516.51.26×10-6Regulationoftraanscription6717.01.95×10-5Intracellularnon-membrane-boundedorganelle6516.52.59×10-4Transcriptionregulatoractivity5413.78.77×10-5RegulationoftranscriptionfromRNApolymer-ase317.82.53×10-6Regulationoftranscription,DNA-dependent399.91.40×10-3Celljunction317.83.17×10-4Nucleotidebinding266.66.52×10-4Cellfraction287.11.27×10-2Intracellularorganellelumen266.64.54×10-5Plasmamembranepart164.13.58×10-3Intracellularsignalingcascade194.88.06×10-3Acetylglucosaminytransferaseactivity164.15.44×10-3ribonucleotidbinding153.81.63×10-2RegulationofRNAmetabolicprocess143.51.69×10-2Adenylnucleotidebinding133.34.22×10-2Zincionbinding133.33.93×10-5

    表4 has-miR-21和has-miR-199a KEGG信號通路分析主要結(jié)果

    3討論

    研究表明[5-6],microRNA在機械生物力調(diào)節(jié)血管細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同剪切力作用下,其microRNAs表達(dá)水平具有顯著差異,而這些microRNAs在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的生長周期和凋亡以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[5-6]。

    He等[10]研究發(fā)現(xiàn),在層流剪切力作用下,阻斷PI3K信號通路可使miR-19a表達(dá)下調(diào),阻斷MAPK信號通路可下調(diào)miR-23b和27b表達(dá)。本研究顯示,內(nèi)皮細(xì)胞在低剪切力作用后,有28個microRNA表達(dá)上調(diào),5個microRNA表達(dá)下調(diào);而在高剪切力作用后,有25個microRNA表達(dá)上調(diào),6個microRNA表達(dá)下調(diào)。選取表達(dá)差異顯著的miR-21和miR-199a采用qRT-PCR技術(shù)驗證,結(jié)果也顯示,低剪切力組miR-21表達(dá)顯著下調(diào),miR-199a表達(dá)顯著上調(diào);而高剪切力組miR-21表達(dá)顯著上調(diào),miR-199a表達(dá)顯著下調(diào)。這表明細(xì)胞外的流體剪切力可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的microRNAs表達(dá)發(fā)生改變。

    microRNAs表達(dá)改變又可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生變化。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-92a在剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮釋放增加,改變內(nèi)皮細(xì)胞功能過程中發(fā)揮重要作用。miR143/145則在剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞降低血管緊張素轉(zhuǎn)換酶表達(dá)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。研究還表明[13],剪切力還可通過microRNA誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化,保持不同剪切力作用下內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。本研究采用IncroMAP對表達(dá)差異的microRNAs靶基因進(jìn)行富集分析也發(fā)現(xiàn),這些靶基因與力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞跨膜遷移、鈣離子信號通路、細(xì)胞內(nèi)吞作用以及免疫應(yīng)答等相關(guān)。表明血流剪切可通過microRNA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生改變。

    本研究結(jié)果與其他研究者的結(jié)果基本一致。結(jié)果存在差異的原因可能是對內(nèi)皮細(xì)胞施加的剪切力程度、作用時間不同,而這些條件的不同可能導(dǎo)致microRNA表達(dá)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致表達(dá)差異的microRNA以及靶基因富集分析結(jié)果不同。

    綜上所述,流體剪切力可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的microRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變,而表達(dá)差異的microRNAs在剪切力作用下通過其靶基因誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生改變,這對深入了解剪切力誘導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能改變,闡明動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。

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    Effect of fluid shear stress on expression of miR-21 and miR-199a in endothelial cells

    ZHANG Yan1,2,3, WANG Yucai3, LIU Zhendong1*, ZHAO Yingxin1,ZHANG Hua1

    (1.InstituteofBasicMedicine,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China;2.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan&ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250022,China;3.People’sHospitalofQihe,QiheShandong251100,China)

    Abstract:To evaluate the effect of fluid shear stress on expression of microRNAs in endothelial cells.Low (4 dyn/cm2), middle (10 dyn/cm2), and high (15 dyn/cm2) fluid shear stress were loaded onto endothelial cells for 24 h using rotating cone disc shear stress system, respectively. No shear stress was loaded onto endothelial cells in control group. Changes of microRNAs expression were assessed using high throughput screening chip. The results were verified using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Bioinformatics analysis was performed in difference-expressed microRNAs.Compared to control group, there were 33 differentially expressed microRNAs in low shear stress group. Among them, 28 microRNAs expression were up-regulated and 5 microRNAs expression were down-regulated. In middle shear stress group, there were 8 differentially expressed microRNAs compared to control group. Among them, 6 microRNAs expression were up-regulated and 2 microRNAs expression were down-regulated. In high shear stress group, there were 31 microRNAs expression changed compared to control group. Among them, 25 microRNAs expression were up-regulated and 6 microRNAs expression were down-regulated.MiR-21 was markedly up-regulated in high shear stress group (fold change: 0.026) and significantly down-regulated in low shear stress group (fold change:3.531). MiR-199a was markedly up-regulated in low shear stress group (fold change: 0.075) and significantly down-regulated in high shear stress group (fold change:3.031). The results of bioinformatics analysis showed that target genes of differentially expressed microRNAs related to mechanical signal transduction, cell trans membrane transport, calcium ion signaling pathway, and endocytosis of cells.The change of the expressions of miR-21 and miR-199a were induced by fluid shear stress in endothelial cells.

    Keywords:Shear stress; Endothelial cell; MicroRNA; Expression

    中圖分類號:Q344+.13

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號:1672-5565(2016)01-019-07

    doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.01.04

    作者簡介:張燕 ,女, 主治醫(yī)師,碩士研究生,研究方向:動脈粥樣硬化機制;E-mail:dzqhzhy@163.com.*通信作者:劉振東,男,博士,研究方向: 動脈粥樣硬化機制; E-mail:zhendongliu876@126.com.

    基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(81470489);山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2014HM098,);山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0312,2014WS0316)。

    收稿日期:2015-10-26;修回日期:2016-12-18.

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