二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

朱志芳　白建民　鄧敏貞

1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校中醫(yī)系，河南　南陽(yáng)　473061；2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校護(hù)理系，河南　南陽(yáng)　473061；

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東　廣州　510405

?

二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

朱志芳1白建民2鄧敏貞3

1.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)系，河南南陽(yáng)473061；2.南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理系，河南南陽(yáng)473061；

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405

【摘要】目的：研究二至丸對(duì)更年期模型大鼠的影響。方法：將SPF級(jí)雌性SD大鼠60只隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組、模型對(duì)照組、更年欣膠囊組(4mg/kg)、二至丸高(600mg/kg)、中(300mg/kg)、低(150mg/kg)劑量組，各組灌胃給予相應(yīng)的藥物連續(xù)30d。除假手術(shù)對(duì)照組外，給藥30d后對(duì)其余5組大鼠通過(guò)手術(shù)將0.2ml無(wú)水乙醇注射到卵巢內(nèi)1次，建立更年期綜合征模型大鼠。觀察大鼠給藥前后體質(zhì)量的變化，測(cè)定血清中雌二醇(E2)、促卵泡成熟激素(FSH)、黃體生成素(LH)、催乳素(PRL)水平，計(jì)算子宮系數(shù)和陰道上皮細(xì)胞角化率，以及測(cè)定下丘腦5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的含量。結(jié)果：與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量緩慢降低，肛溫升高(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH和PRL水平明顯升高(P<0.05) ，E2水平明顯減少(P<0.01)；陰道上皮細(xì)胞角化率和子宮系數(shù)明顯下降(P<0.01)；降低下丘腦5-HIAA/5-HT (P<0.05)，增加NE/DA (P<0.05)；與模型對(duì)照組相比較，二至丸各劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較模型組快，肛溫下降(P<0.05)；FSH、LH水平明顯降低(P<0.01)；PRL水平明顯降低(P<0.05) ，E2水平明顯升高(P<0.05)；陰道上皮細(xì)胞角化率明顯提高(P<0.01)；子宮系數(shù)增加(P<0.05)；增加下丘腦5-HIAA/5-HT (P<0.05)，減少NE/DA (P<0.05)。結(jié)論：二至丸能既可以改善性激素，又可以增加更年期綜合征模型大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量，從而達(dá)到緩解更年期癥狀的作用。

【關(guān)鍵詞】二至丸；絕經(jīng)綜合征；神經(jīng)遞質(zhì)；性激素；

更年期綜合征多因婦女在圍絕經(jīng)前后因卵巢功能逐漸衰退以致雌激素水平下降，引起以植物神經(jīng)功能紊亂代謝障礙為主的一系列癥候群[1]。更年期綜合征見于中醫(yī)古籍的“臟躁”、“郁證”、“崩漏”、“月經(jīng)不調(diào)”等病證中，現(xiàn)代中醫(yī)將其命名為“絕經(jīng)前后諸癥”[2]。該病表現(xiàn)為五心煩熱、烘熱汗出、四肢麻木、時(shí)冷時(shí)熱等陰陽(yáng)失調(diào)的癥狀[2]。西醫(yī)學(xué)一般認(rèn)為卵巢功能的衰退是引起更年期各種癥狀的主要原因，應(yīng)用雌激素替代療法治療婦女更年期綜合征，雖能緩解部分癥狀，但是毒副作用較大[2]。二至丸出自清代江昂《醫(yī)方集解》，具有補(bǔ)腰膝，壯筋骨，益腎陰的功效[4]，臨床常用于更年期相關(guān)疾病的治療[5]。本實(shí)驗(yàn)采用手術(shù)方式制備更年期綜合征大鼠模型，觀察二至丸對(duì)模型大鼠生殖內(nèi)分泌和神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1材料二至丸(批號(hào)：990910，蘇州雷允上制藥廠)；雌二醇(E2)、黃體生成激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、催乳素(PRL)放免試劑盒(批號(hào)：116408，美國(guó)Beckman公司)；5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)；更年欣膠囊(批號(hào)：120702，通化方大藥業(yè)股份有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雌性大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量220～250g，動(dòng)物正常飼養(yǎng)5d后用于以下實(shí)驗(yàn)，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(豫)2010-0002。

1.3儀器ACCESS型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)；AE-200型電子分析天平(美國(guó)METTLER公司)；2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)。

2方法

2.1造模[6]雌性大鼠用10%水合氯醛(35mg/kg)，腹腔麻醉，腹位固定然后取最末肋骨下、腋中線和距脊柱外側(cè)約2cm交叉處，剪除長(zhǎng)毛，常規(guī)皮膚消毒，切開皮趺和背肌約1.5～2.0cm，在切口視野中白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)中找出卵巢，輕輕夾住脂肪團(tuán)拉出切口外，模型組用0.5ml的注射器將0.2ml無(wú)水乙醇注射到卵巢內(nèi)，假手術(shù)組僅作注射針刺動(dòng)作而無(wú)任何液體，然后順勢(shì)將卵巢送回腹腔中，縫合創(chuàng)面，皮膚消毒，腹腔注射青霉素20萬(wàn)單位，連續(xù)3d，以防手術(shù)感染。

2.2分組與給藥取雌性大鼠60只，隨機(jī)分成假手術(shù)組及造模組，假手術(shù)組10只，造模組50只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，將造模組大鼠按體質(zhì)量分5組，分別為模型對(duì)照組，更年欣膠囊組(4mg/kg)，二至丸高(600mg/kg)、中(300mg/kg)、低(150mg/kg)劑量組。各組連續(xù)灌胃給予相應(yīng)的藥物30d，每天一次。

2.3觀察與檢測(cè)方法

2.3.1一般觀察觀察雌性大鼠給藥前后毛發(fā)、舌質(zhì)的變化，分別于給藥前及給藥后第5、15、30天測(cè)雌性大鼠體質(zhì)量及直腸溫度。

2.3.2陰道上皮細(xì)胞角化的檢測(cè)末次給藥2h后，用生理鹽水浸濕的棉簽輕擦雌性大鼠陰道，取出后作陰道涂片，瑞氏染色后光鏡下觀察，計(jì)算陰道上皮細(xì)胞角化率。

2.3.3生殖內(nèi)分泌激素的測(cè)定末次給藥后1d，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈采動(dòng)脈血，3500r/min離心10min制備血清，采用放射免疫分析法測(cè)定血清中E2、LH、FSH、PRL的含量水平。

2.3.4下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定將取血后的雌性大鼠迅速斷頭取腦，用化學(xué)熒光法測(cè)定下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA、5-HIAA含量。色譜條件:色譜柱為依利特 C18(150mm×4mm，5μm)，流動(dòng)相: 50mmol/l檸檬酸-乙酸鈉緩沖液，流速1.0ml/min，波碳電極，檢測(cè)池電壓為0.75V，柱溫為(20±2)℃。3,4-二羥芐胺(DHBA)為內(nèi)標(biāo)物，樣品各主要組分用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.3.5臟器系數(shù)的檢測(cè)雌性大鼠處死后解剖，稱取各只大鼠的子宮重量，計(jì)算各組雌性大鼠的臟器系數(shù)。

2.4統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1對(duì)更年期綜合征模型大鼠體質(zhì)量的影響由表1可知，與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型大鼠在第15～30d毛色枯燥不光滑，舌尖色暗紅，體質(zhì)量明顯減少(P<0.01)；與模型組對(duì)照比較，二至丸中高劑量組治療后大鼠體質(zhì)量均有顯著增加(P<0.05)。

表1　二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠體質(zhì)量的影響

注:與假手術(shù)對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，?P<0.05。

3.2對(duì)更年期綜合征模型大鼠肛溫的影響由表2可知，與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肛溫明顯增高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，給予二至丸和更年欣膠囊治療后，不同時(shí)間大鼠升高的肛溫均有所降低，給藥5d后，二至丸中劑量組大鼠肛溫顯著降低(P<0.01)；給藥15d后，二至丸高、中、低劑量組肛溫均明顯降低(P<0.05)；其中給藥30d后，二至丸中、高劑量組顯著降低大鼠肛溫(P<0.01)。

表2　二至丸對(duì)更年期綜合征大鼠肛溫的影響　±s)

注: 與假手術(shù)對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，?P<0.05，#P<0.01。

3.3對(duì)更年期綜合征大鼠臟器系數(shù)及陰道上皮細(xì)胞角化程度的影響由表3可知，與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照大鼠子宮系數(shù)和陰道上皮細(xì)胞角化程度明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，二至丸中、高劑量組能明顯增加模型大鼠子宮系數(shù)(P<0.05)，陰道上皮細(xì)胞角化程度明顯增加(P<0.01)。

3.4對(duì)更年期綜合征大鼠陰道上皮細(xì)胞角化程度的影響由圖1可知，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組的角化細(xì)胞較少。與模型對(duì)照組比較，更年欣膠囊組合二至丸各劑量組的角化細(xì)胞都有一定程度增加。

3.5對(duì)更年期綜合征模型大鼠血清生殖內(nèi)分泌激素的影響由表4可知，與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的血清E2水平明顯降低，F(xiàn)SH、LH、PRL水平明顯升高；與模型對(duì)照組比較，二至丸高、中、低劑量組均能明顯增加模型大鼠E2水平(P<0.05或P<0.01)，中高劑量組能明顯降低模型大鼠血清FSH、LH水平(P<0.01)，二至丸各劑量組明顯降低大鼠血清中PRL水平(P<0.05或P<0.01)。

表3　二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠子宮系數(shù)及

注: 與假手術(shù)對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，?P<0.05，#P<0.01。

表4　二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠血清E2、LH、FSH、PRL的影響

組別劑量/mg/kgE2/pg/mlLH/mIU/mlFSH/mIU/mlPRL/μg/l假手術(shù)對(duì)照-6.36±2.053.52±0.851.53±0.485.65±0.81模型對(duì)照-3.10±1.24*4.97±1.16*2.86±0.72*16.40±1.11*更年欣膠囊4.004.78±1.85##4.26±0.94·2.36±0.80*#14.31±1.41*#二至丸600.005.21±1.72·#3.90±0.73·#2.14±0.57#15.52±0.85*300.004.60±1.44*#4.14±0.88·2.37±0.63*14.56±1.74*150.004.48±1.33*4.65±1.03*2.53±0.80*10.71±3.89*#

注:與假手術(shù)對(duì)照組比較·P<0.05，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，?P<0.05，#P<0.01。

3.6對(duì)更年期綜合征模型大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響由表5可知，與假手術(shù)對(duì)照組比較，模型大鼠下丘腦5-HIAA/5-HT明顯升高(P<0.05)，NE/DA含量明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，二至丸中高劑量組能明顯降低模型大鼠下丘腦5-HIAA/5-HT含量(P<0.05)，增加NE/DA含量(P<0.05)。

表5　二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠下丘腦NE/DA和

注:與假手術(shù)對(duì)照組比較，#P<0.05；*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，?P<0.05。

4討論

更年期綜合征的表現(xiàn)多見于陰虛內(nèi)熱，陰虛內(nèi)熱癥狀是由于腎氣虛，天癸竭，沖任脈虛，氣血臟腑功能失調(diào)，陰陽(yáng)失衡所致[7]。腎臟元?dú)鉃橄忍熘荆迮K之根，生命之門，人的生、長(zhǎng)、壯、老、已均由腎中精氣的盛衰來(lái)決定。婦女至絕經(jīng)前后，精血衰少，沖任虛損，故易使體內(nèi)陰陽(yáng)失調(diào)、臟腑氣血功能紊亂而發(fā)病[8]。大多以肝腎陰虛和火旺為主，故應(yīng)滋補(bǔ)其陰和清虛火、寧心安神。更年期婦女由于卵巢功能衰退和紊亂，雌激素分泌減少，反饋性引起垂體分泌功能亢進(jìn)，促性腺激素分泌過(guò)多，使下丘腦-垂體-卵巢性腺軸調(diào)節(jié)功能紊亂，內(nèi)分泌失調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)植物神經(jīng)、心血管系統(tǒng)功能紊亂、新陳代謝失常的一系列癥候群[9]。造模方法模擬更年期發(fā)生的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道絕經(jīng)期婦女LH、FSH升高相吻合[10-11]。

二至丸的女貞子甘苦涼，滋腎養(yǎng)肝，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“女貞子主補(bǔ)中，安五臟，養(yǎng)精神，除百病”；旱蓮草甘酸寒，養(yǎng)陰益精，涼血止血，二藥合用補(bǔ)益肝腎，減少更年期婦女腎氣漸衰，腎陰虧虛引起的頭暈耳鳴、腰膝酸軟的癥狀。該方兩藥合用共奏養(yǎng)血清熱、滋補(bǔ)肝腎之功[12]。由于更年期綜合征患者常因平素性情抑郁，或因病而致心情更為緊張，導(dǎo)致肝郁氣滯，或因腎陰虛而不足以養(yǎng)肝而致肝郁不疏，或脾病及肝，肝病及脾，心脾兩虛而生諸癥，用二至丸對(duì)此癥也有治療作用。

研究表明，二至丸對(duì)更年期綜合征模型大鼠能降低肛溫(P<0.05或P<0.01)，增加血清E2水平(P<0.05或

P<0.01)，降低血清FSH、LH、PRL水平(P<0.05或P<0.01)，降低下丘腦5-HIAA/5-HT (P<0.05)，增加NE/DA (P<0.05)，增加子宮系數(shù)(P<0.05)，陰道上皮細(xì)胞角化程度明顯增加(P<0.01)，為二至丸在臨床上治療絕經(jīng)綜合征提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。且葉雪清研究[13]認(rèn)為下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)含量與比值的改變，可能是性腺軸系統(tǒng)老化的始動(dòng)因素。因此，從治療更年期綜合征的效果而論，二至丸有一定的調(diào)整內(nèi)分泌失調(diào)及植物神經(jīng)功能紊亂的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 尤勁松，胡隨瑜，向群輝．地貞顆粒對(duì)更年期擬陰虛內(nèi)熱證大鼠兒茶酚胺遞質(zhì)及促性腺激素水平的影響[J]．湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，26(1):33-36．

[2] 許麗綿，歐陽(yáng)惠卿，盧如玲.更年期綜合征病因病機(jī)及其證治述要[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2003， 21(9):1550-1552.

[3] 胡德祥．中醫(yī)藥治療婦女更年期綜合征的研究近況[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(4):157-158．

[4] 王麗，閆玉新.芩連四物湯合二至丸治療婦女更年期綜合癥[J].山東中醫(yī)雜志，2013，32(5)：350-356.

[5] 徐瑾，羅玲英，吳鐵榮.二至丸的臨床應(yīng)用與劑量關(guān)系[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011，7(1):131-136.

[6] 盧金福，洪敏，朱荃.酒精性更年期綜合征大鼠模型的研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2006，3(26):363-364.

[7] 楊曉虹.二至二仙湯加減治療更年期綜合征60例[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2007，23(9)：564.

[8] 李剛.婦女更年期綜合癥證治觀察[J].醫(yī)學(xué)信息，2008，21(3)：411.

[9] 孫冬瑋，王瓏.針刺對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠HPA軸的影響[J].上海針灸雜志，2007，26(2)：32-34.

[10] 侯龍敏,張艷瑞.絕經(jīng)期婦女LH、FSH、PRL變化的臨床分析[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，25(3)：57-28.

[11] 李燕，郭蓉曉，吳涢婷，等.補(bǔ)益陽(yáng)明津氣對(duì)初老雌性大鼠卵巢流式細(xì)胞雙標(biāo)百分比的影響[J].中醫(yī)雜志，2005，46(12)：937-939.

[12] 徐進(jìn)文，許潔安，李潤(rùn)美，等.加味二至丸對(duì)卵巢切除小鼠的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30(3):367-443.

[13] 葉雪清. 圍絕經(jīng)期神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的變化[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，1997，13(2):59-60.

The Effect of Model Rats about the Menopausal Syndrome by Er Zhi Wan

ZHU Zhifang1BAI Jianmin2DENG Minzhen3

1. Traditional Chinese Medicine Department of Nanyang Medical College，Nanyang 473061，China；

2. Nursing Department of Nanyang Medical College，Nanyang 473061，China；

3.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

Abstract:Objective To observe the effect of Er Zhi Wan for the treatment of menopausal disorders．Methods Special-pathogen free Sprague Dawley (SD) female rats were used as the experimental animal．Rat models of Menopausal were induced by removal of bilateral ovaries, which were injected 0.2ml anhydrous ethanol once after dosing. SD rats were randomized into sham group，model group，positive group by Gengnianxin Capsule(4mg/kg) and treatment group (600mg/kg，300mg/kg，150mg/kg)．All rats were given intragastric once a day for 30 days. To observe the changes of rats’ body weight before and after administration，Serum levels of estradiol(E2)，luteinizing hormone(LH)，follicle-stimulating hormone(FSH)，prolactin(PRL) and calculate the Uterine factor and the rate of keratinocytes Vaginal epithelial cells and levels of 5-hydroxytryptamine(5-HT)，norepinephrine(NE)，dopamine(DA)，5-hydroxyindole acetic acid(5-HIAA) in rats＇ hypothalamic.Results After treatment，compare with sham group, the rats＇ weight reduced and the temperature of anus was rised and the level of FSH，LH，PRL and the ratio of NE/DA were increased(P<0.05)，but the level of E2 and the ratio of 5-HIAA/5-HT was decreased(P<0.05)．The rate of keratinocyte vaginal epithelial cells and the uterine factor was decreased too (P<0.01)．Compare with model group, the rats＇ weight gained and the temperature of anus was declined and the level of FSH，LH，PRL and the ratio of NE/DA were decreased(P<0.05)，but the level of E2 and the ratio of 5-HIAA/5-HT was increased(P<0.05)．The rate of keratinocyte vaginal epithelial cells and the uterine factor was increased too (P<0.01)．Conclusion Er Zhi Wan Decoction has an effect for rat models＇ treatment，which is about the menopausal syndrome．

Key words:Er Zhi Wan；menopause；neurotransmitter；sex hormone；

(收稿日期：2016.01.04)

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)06-0034-04

作者簡(jiǎn)介：朱志芳(1972-)，女，講師，主要從事婦科乳腺病與月經(jīng)病的中藥治療。