紫金化毒栓的質量標準研究

夏　澆　張麗艷　李艷英　劉　軍　馬曉晴

1.貴陽中醫(yī)學院，貴州　貴陽　550002；2.北京因科瑞斯藥物研究院有限公司，北京　102209

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紫金化毒栓的質量標準研究

夏澆1張麗艷1李艷英2*劉軍2馬曉晴2

1.貴陽中醫(yī)學院，貴州貴陽550002；2.北京因科瑞斯藥物研究院有限公司，北京102209

【摘要】目的:建立紫金化毒栓的質量標準。方法:采用薄層色譜法(TLC)對栓劑中金銀花、連翹、關黃柏、五倍子進行定性鑒別([1])；采用高效液相色譜法(HPLC)對制劑中綠原酸和連翹苷進行定量測定。結果:薄層鑒別專屬性強、斑點清晰、分離度好；綠原酸和連翹苷進樣量分別在0.07976～1.994 μg(r=0.9998)、0.1202～3.005 μg(r=0.9999)范圍內線性關系良好，平均加樣回收率(n=6)分別為98.11%、99.17%，RSD分別為0.92%、0.85%。結論:所建立的定性、定量分析方法簡便快速、重復性好、準確度高，能夠有效控制紫金化毒栓的質量。

【關鍵詞】紫金化毒栓；HPLC；TLC

紫金化毒栓是名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗方，根據(jù)中醫(yī)辨證施治理論將金銀花、連翹、黃柏等中藥合理配伍，并按一定比例配方制成的栓劑[2]，具有清熱解毒、活血燥濕、消腫生肌的功效。主要用于濕熱瘀阻所致的帶下病，癥見帶下量多、色黃或異味、或陰部瘙癢以及宮頸炎高危型人乳頭瘤病毒感染(HPV)見上述證候者。為了保證臨床用藥的安全性、有效性，建立紫金化毒栓中有效成分的定性定量控制方法有至關重要的意義。本實驗采用TLC法對處方中的金銀花、連翹、關黃柏、五倍子進行定性鑒別，采用HPLC法測定栓劑中的金銀花中綠原酸的含量和連翹中連翹苷的含量,為紫金化毒栓臨床用藥的安全有效性提供了保障,也為紫金化毒栓的質量標準建立奠定基礎。

1儀器與材料

1.1儀器LC-2010 AHT高效液相色譜儀(日本島津)；色譜柱 Dikma Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)，色譜柱Platisil ODS C18(250mm×4.6mm，5 μm)；電子分析天平；UV-2450紫外分光光度計(島津)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；高速冷凍離心機；紫外分析儀。

1.2材料綠原酸對照品(批號：110753-200413，純度：96.2%)、連翹苷對照品(批號：110821-201112，純度：96.8%)、沒食子酸對照品(批號：11083-200803，純度：90.1%)、鹽酸小檗堿(批號：110713-201212，純度：86.7%)、金銀花對照藥材(批號：121060-200805)、關黃柏對照藥材(批號：120937-200506)、五倍子對照藥材(批號：121078--200402)、紫草對照藥材(新疆紫草)(批號：121430-201103)、連翹對照藥材(批號：120908-201218)均購自中國食品藥品檢定研究院;紫金化毒栓(批號：20130401，20130402，20130403，自制)；甲醇、乙腈為色譜純(迪馬公司)，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純；硅膠G板、硅膠H板、硅膠GF254板均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

2方法與結果

2.1薄層鑒別

2.1.1金銀花的薄層鑒別取本品1粒，置于100ml具塞錐形瓶中，加水30ml，水浴加熱使其完全溶散，超聲處理30min(40℃)，冷凍30min(-20～-10℃)，離心，過濾，濾液加入稀鹽酸1ml，搖勻，取30ml乙酸乙酯振搖提取，取乙酸乙酯液水浴蒸干，殘渣加入甲醇2ml使其溶解，作為供試品溶液。另取金銀花對照藥材0.5g，加甲醇30ml，超聲30min，過濾，濾液濃縮至約2ml，作為對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各3μl，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(7∶2.5∶2.5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾，見圖1。

2.1.2連翹的薄層鑒別[3]取本品2粒，置于100ml具塞錐形瓶中，加水40ml，水浴加熱使其完全溶散，超聲處理30min(40℃)，冷凍30min(-20～-10℃)，離心，過濾，濾液用乙酸乙酯振搖提取3次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣用70%甲醇5ml使溶解，加于中性氧化鋁柱(100～200目，2g，內徑1cm，干法裝柱)，用70%甲醇30ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作為對照品溶液。再取連翹對照藥材1g，加石油醚(30～60℃)20ml，超聲處理15min，濾過，棄去石油醚液，殘渣揮干，加甲醇20ml，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述三種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(20∶3)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖2。

2.1.3關黃柏的薄層鑒別[4]取本品適量，切碎，取約1g，置于100ml具塞錐形瓶中，加50%乙醇25ml，水浴使溶散均勻，40℃超聲處理30min，冷凍(-20～-10℃)30min，離心，上清液用少量棉花濾過，濾液蒸干，加甲醇2ml使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成0.2mg·ml-1的對照品溶液。再取關黃柏對照藥材0.2g，加甲醇5ml，超聲處理30min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。吸取上述三種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠H薄層板，以乙酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖3。

2.1.4紫草的薄層鑒別[5]取本品1粒，置于100ml具塞錐形瓶中，加無水乙醇25ml，40℃超聲處理20min，冷凍(-20～-10℃)30min，離心，取上清液蒸干，殘渣加無水乙醇4ml使溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。另取紫草對照藥材0.1g，加70%乙醇回流1h，濾過，濾液蒸干，加無水乙醇25ml，超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至約4ml，作為對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各3μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，于10℃以下預飽和30min，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖4。

2.1.5五倍子的薄層鑒別取本品1粒，置于100ml具塞錐形瓶中，加水25ml，水浴使溶散均勻，40℃超聲處理30min，冷凍(-20～-10℃)30min，離心，上清液用少量棉花濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇制成每1mg·ml-1的溶液，作為對照品溶液。再取五倍子對照藥材0.5g，加水25ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述三種溶液各2μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。噴以三氯化鐵試液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾。見圖5。

2.2含量測定

2.2.1綠原酸的含量測定

2.2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.2.1.1.1色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸(9∶91)為流動相，體積流量 1.0ml/min；檢測波長327nm；柱溫25℃ ；進樣量10 μl。該條件下測出理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于2000,相鄰峰分離度均大于1.5且陰性樣品無干擾。

2.2.1.1.2對照品溶液的制備取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加50%甲醇制成40μg·ml-1的溶液，即得(10℃以下保存)。

2.2.1.1.3供試品溶液的制備取本品，切碎，精密稱定0.5g，置具塞錐形瓶中，加硅藻土1.0g，精密加水50ml，稱定重量，置60℃水浴5min使溶散均勻，取出，40℃超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，冷凍(-20～-10℃)30min，取出，離心10min(轉速為4000rpm)，取上清液，濾過，即得。

2.2.1.1.4測定方法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.1.1.5專屬性試驗除金銀花外，按處方比例稱取藥材及輔料按2.2.1.1.3項下制成陰性樣品，再按供試品制備方法，制備成陰性對照溶液，進行測定。結果表明：陰性樣品色譜中在與綠原酸相應的保留時間上有色譜峰 ，但計算峰面積約為供試品峰面積的3.56%，小于5%，表明其他成分對綠原酸的測定干擾比較小，綠原酸峰的理論板數(shù)n大于2000。樣品中綠原酸色譜峰與相近峰分離完全，分離度均大于1.5。本品中綠原酸的含量具有專屬性。見圖6。

2.2.1.2方法學考察

2.2.1.2.1線性關系的考察精密稱取綠原酸對照品9.97mg，置于25ml棕色容量瓶中，加入50%甲醇適量使其完全溶解并定容至刻度，搖勻，制得綠原酸對照品濃度為0.3988mg/ml；再精密量取0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml分置10ml棕色量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成7.976、19.94、39.88、79.76、119.64、199.4μg/ml的對照品溶液，搖勻，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀進行測定?；貧w方程：Y=3139590.3720X-95257.0154(r=0.9998)。結果表明綠原酸含量在79.76～1994μg范圍內線性關系良好。

2.2.1.2.2精密度試驗取本品切碎，精密稱定0.5g，按2.2.1.1.3項下方法制備供試品，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，進行測定，同一供試品連續(xù)進樣6次。結果綠原酸的峰面積RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.1.2.3穩(wěn)定性試驗取本品切碎，精密稱定0.5g，按2.2.1.1.3項下方法制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24h精密吸取10 μl，注入液相色譜儀進行測定，結果RSD為0.21%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.2.1.2.4重復性試驗取本品切碎，精密稱定6份，每份0.5 g，按2.2.1.1.3項下方法制備供試品，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀進行測定。結果RSD值為0.12%，RSD<2.0%，表明本方法的重復性良好。

2.2.1.2.5加樣回收率試驗采用加樣回收法，精密稱取綠原酸對照品8.70mg，置10ml量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.87mg/ml的對照品溶液，精密吸取1ml(共6份)，分置不同錐形瓶中，蒸干，然后取本品切碎，精密稱定6份，每份0.25g，分置上述錐形瓶中，分別加硅藻土1.0 g，精密加水50 ml，密塞，稱定重量，置60℃水浴5 min使溶散均勻，取出，40℃超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，冷凍(-20～-10℃)30min，取出，離心10min(轉速為4000r/min)，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。結果綠原酸含量：3.3936mg/g，平均回收率為98.11%，RSD為0.92%。表明本方法具有較好的回收率。

2.2.1.2.6樣品的含量測定取三批樣品，按供試品溶液方法制備，按上述色譜條件測定，計算，得到三批樣品綠原酸的含量為：7.58、7.58、7.60mg/粒。根據(jù)三批樣品測定結果及所用的金銀花藥材中的綠原酸的含量，折算本品連翹苷的提取率均為55%左右；因此本品按2015年版《中國藥典》一部“金銀花”藥材項下綠原酸的含量限度1.5%折算制劑的理論含量為12.85mg/粒，結合實際大生產(chǎn)情況，按50%轉移率折算，暫定本品每片含金銀花以綠原酸(C16H18O9)計，不得少于6.5mg/粒。

2.2.2連翹苷的含量測定

2.2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.2.2.1.1色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(24∶76)為流動相，流量 1.0ml/min，檢測波長為230nm，柱溫40℃。理論板數(shù)按連翹苷峰計算應不低于3000,相鄰峰分離度均大于1.5且陰性樣品無干擾。

2.2.2.1.2對照品溶液的制備取連翹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1μg/ml的溶液，即得。

2.2.2.1.3供試品溶液的制備取本品，切碎，取約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加硅藻土2g，精密加入50%乙醇50ml，稱定重量，置60℃水浴15min使溶散均勻，取出，40℃超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇溶液補足減失的重量，搖勻，置于冰箱冷凍層(-20～-10℃)30min，取出，離心(轉速4000r/min)10min，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取5次，每次30ml，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.1.4測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，進行測定。

2.2.2.1.5專屬性試驗除連翹藥材外，按處方比例稱取藥材及輔料按2.2.2.1.3項下制成陰性樣品，進行測定。結果表明陰性樣品色譜中在與連翹苷相應的保留時間上無色譜峰，表明其他成分對本品中連翹苷的含量測定無干擾，連翹苷的理論板數(shù)n大于3000。樣品中連翹苷色譜峰與相近峰分離完全，分離度均大于1.5。以本法測定本品中連翹苷的含量具有專屬性。見圖7。

2.2.3方法學考察

2.2.3.1線性關系的考察精密稱取連翹苷對照品7.76mg，置25ml量瓶中，加甲醇適量超聲處理(功率250W，頻率40kHz)使溶解，取出，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml分置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成6.01、15.02、30.05、60.1、90.15、150.25μg/ml的對照品溶液，搖勻，分別精密吸取20μl，注入液相色譜儀進行測定，得回歸方程：Y=2209920.5724X-2526.4149(r=0.9999)。結果表明，連翹苷進樣量在0.1202～3.005μg范圍內線性關系良好。

2.2.3.2精密度試驗取本品切碎，精密稱定2g，按2.2.2.1.3項下方法制備供試品，分別精密吸取20μl，注入液相色譜儀進行測定，同一供試品連續(xù)進樣6次，結果RSD為0.76%。表明該方法的儀器精密度良好。

2.2.3.3穩(wěn)定性試驗取本品切碎，精密稱定2g，按2.2.2.1.3項下方法制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24h精密吸取10μl，注入液相色譜儀進行測定。RSD為0.72%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.2.3.4重復性試驗取本品切碎，取約2g(共6份)，按2.2.2.1.3項下方法制備供試品，分別于0、2、4、8、12、24h精密吸取10μl，注入液相色譜儀進行測定。結果RSD為0.72%，小于2.0%，表明該方法的重復性良好。

2.2.3.5加樣回收率試驗采用加樣回收法，精密稱取連翹苷對照品14.95mg，置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.5789mg/ml的對照品溶液；精密吸取4ml置10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成231.56μg/ml的對照品溶液，分別精密吸取1.5ml(共6份)，分置不同錐形瓶中，蒸干，再取本品切碎，取約1g(共6份)，精密稱定，分置上述錐形瓶中，分別加硅藻土2g，精密加入50%乙醇50ml，密塞，稱定重量，置60℃水浴15min使溶散均勻，取出，40℃超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇溶液補足減失的重量，搖勻，置于冰箱冷凍層(-20～-10℃)30min，取出，離心(轉速4000r/min)10min，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取5次，每次30ml，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。結果連翹苷含量：0.3223mg/g，平均回收率為99.17%，RSD為0.85%。說明本方法具有較好的回收率。

2.2.3.6樣品的含量測定取三批樣品，按供試品溶液方法制備，按上述色譜條件測定，計算，得到三批樣品連翹苷的含量為：0.91、0.93、0.92mg/粒。根據(jù)三批樣品中連翹苷的測定結果及所用的連翹藥材中的連翹苷的含量，折算本品連翹苷的提取率均為50%左右；因此本品按2015年版《中國藥典》一部“連翹”藥材項下連翹苷的含量限度0.15%折算制劑的理論含量為1.28mg/粒，按50%轉移率折算，暫定本品每片含連翹以連翹苷(C27H34O11)計，不得少于0.65mg/粒。

3討論

3.1紫金化毒栓為未在國內上市銷售的中藥六類復方制劑，為保證成品質量，對方中藥材的主要特征成分進行了鑒別試驗。本實驗所建立的質量標準薄層鑒別專屬性強，斑點清晰、快速、簡便、重現(xiàn)性好、分離度好；利用HPLC法對樣品中綠原酸、連翹苷進行測定具有操作簡單、重復性好、分析時間短、分離效果好等優(yōu)點，能很好的用于紫金化毒栓的質量控制，保證臨床用藥的安全、有效。

3.2該栓劑基質為脂溶性基質，薄層色譜鑒別中供試品都進行低溫冷凍處理使油脂分離，排除基質對實驗結果的干擾。連翹藥材提取為水提，故連翹的鑒別中用水作為提取溶劑，但結果背景較深，且分離度不好，需進一步純化樣品，參考《中國藥典》連翹苷含量測定方法，增加過中性氧化鋁柱的步驟結果排除了背景雜質的影響，顯色斑點清晰可見，故確定為本實驗的薄層鑒別方法。金銀花參照藥典中金銀花藥材的薄層鑒別條件結果，供試品溶液中含栓劑基質太多，無法點樣，因此加入鹽酸進一步純化，最后用乙酸乙酯萃取，除去了基質中干擾雜質。

3.3本復方中由于連翹、金銀花為君藥，其含有的成分連翹苷、綠原酸均具有抗菌作用，因此確定連翹苷、綠原酸作為本品的含量測定成分。金銀花加樣回收試驗樣品制備過程加入硅藻土，吸附了基質中的油脂，排除其對含量的影響，以便更好地控制產(chǎn)品質量。

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實驗研究

Study on quality standard for Zijin Huadu Suppository

XIA Jiao1ZHANG Liyan1LI Yanying2*LIU Jun2MA Xiaoqing2

1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,guiyang 550002,China;2.Beijing Increase Pharmaceutical Institute Co.，Ltd. beijin 102209,China

Abstract:Objective To establish the quality standard of the Zijin Huadu suppository. Methods Exert qualitative identification of Honeysuckle,Forsythia,Cortex Phellodendri, Galla chinensis by Thin Layer Chromatography(TLC) and quantitative identification of chlorogenic acid and Phillyrin by High Performance Liquid Chromatography(HPLC).Results TLC identification shows great specificity,that spots are clear and resolution is good. When the injection volume of chlorogenic acid and forsythin are within the range respectively: 0.07976-1.994 μg(r=0.9998),0.1202-3.005 μg(r=0.9999),the linearity is favorable. The average recovery rate(n=6) of chlorogenic acid and forsythin are 98.11% and 99.17% while the RSD are 0.92% and 0.85%.Conclusion The qualitative and quantitative identification methods we established are simple and fast and have good repeatability and accuracy, by which we can effectively control the quality of Zijin Huadu Suppository.

Key words:Zijin Huadu Suppository;HPLC; TLC

(收稿日期：2015.12.31)

【中圖分類號】R286

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)06-0030-04

作者簡介：夏澆，碩士，主要從事中藥學質量控制研究。E-mail：1069511329@qq.com。通信作者：李艷英，碩士，工程師，主要從事新藥研究。E-mail：yanyingliabc@163.com 。

基金項目：北京市中醫(yī)局科技發(fā)展資金項目(JJ2014-15)。