• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鉤吻素子在小鼠體內(nèi)的組織分布研究

    2016-04-25 07:25:12張永志何洪源佘彩蒙中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院北京100038
    貴州警察學(xué)院學(xué)報 2016年2期

    張永志,何洪源,佘彩蒙(中國人民公安大學(xué) 刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 100038)

    ?

    鉤吻素子在小鼠體內(nèi)的組織分布研究

    張永志,何洪源,佘彩蒙
    (中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京100038)

    摘要:建立小鼠染毒動物模型,通過尾靜脈給藥確定鉤吻素子的半數(shù)致死量,采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對小鼠不同組織臟器進(jìn)行定量分析,確定鉤吻素子主要分布器官。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,確定給藥濃度為20.48 mg/kg、25.6 mg/kg、32 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg,記錄小鼠在給藥0.5 h內(nèi)的死亡時間及數(shù)量,解剖小鼠并對組織臟器進(jìn)行檢測。鉤吻素子對小鼠的半數(shù)致死量為30.60 mg/kg,95%可信區(qū)間為28.10~33.32 mg/kg,由鉤吻素子引起急性中毒死亡后,心臟、肺、腎等臟器是毒素分布的主要器官。實驗確定了鉤吻素子對小鼠的半數(shù)致死量,并對相關(guān)臟器以及血液進(jìn)行定量檢測,為有關(guān)鉤吻素子的毒理研究提供參考,為相關(guān)中毒案(事)件中檢材的選擇以及鉤吻素子的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:鉤吻;鉤吻素子;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;組織分布

    何洪源(1965-),女,北京人,中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,博士;

    佘彩蒙(1990-),男,北京人,中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院碩士研究生。

    鉤吻(Gelsemium elegans Benth)作為一種常見的中草藥,主要分布在我國南方,其藥用價值很高,多為外用,忌內(nèi)服,可用于消腫止痛﹑祛風(fēng)散熱。[1]鉤吻素子(Koumine)屬生物堿類,是鉤吻的主要成分,[2]可用于多種疾病的治療,甚至?xí)蔀橹委熌[瘤和銀屑病的一種新型藥物。[3][4][5]鉤吻素子毒性較大,近些年,隨著鉤吻藥物的開發(fā)與應(yīng)用逐漸深入,相關(guān)的中毒案件也在不斷地增加。[6][7]實驗首先針對鉤吻素子的半數(shù)致死量進(jìn)行研究,再將實驗采集的生物檢材,利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)進(jìn)行定量分析,[8]確定鉤吻素子在小鼠體內(nèi)組織臟器的分布情況,為相關(guān)中毒案(事)件中檢材的選擇以及鉤吻素子的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

    一、材料

    (一)藥品與試劑

    鉤吻素子(購于廣西立安生物有限公司,純度:98%);乙腈﹑甲酸﹑甲酸銨(美國Fisher Scientific) ;酒精﹑生理鹽水(南京四通化學(xué)用品公司)。

    (二)儀器

    超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(ACQUITY UPLC-XEVO TQ MS,美國Waters公司);旋渦混合器(BM-2,上海德利科技有限公司);自動勻漿機(D-15,德國ART MICCRA);高速離心機(SLCZ-200,江蘇宏達(dá)儀器有限公司);高速振蕩器(QW-650,北京超越科技有限公司);電子分析天平(PCY1000,上??铺仄鞑挠邢薰荆籄CQUITY UPLC BEH C18( 2.1×50 mm, 1.7 μm)色譜柱(美國Waters公司)。

    (三)動物

    實驗選用周齡為9周左右的ICR雄性小鼠,共50只,小鼠購于北京斯貝福動物有限公司,體重:(40±2)g,衛(wèi)生級別:VAF/SPF;許可證編號:SCXK(京)2012-0005;合格證編號:0297638。實驗前將小鼠在鼠房適應(yīng)性喂養(yǎng)3天,保證飼養(yǎng)環(huán)境適宜,鼠具干凈衛(wèi)生,實驗前禁食12 小時,不禁水。本研究的動物實驗標(biāo)準(zhǔn)符合機構(gòu)責(zé)任委員會的倫理(道德)標(biāo)準(zhǔn),可以進(jìn)行研究所需的動物實驗。

    (四)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    取10 mg鉤吻素子,用10 mL乙腈溶解,得到1 mg/mL 的儲備液,將其依次稀釋得到10 ng/mL﹑50 ng/mL﹑100 ng/mL﹑200 ng/mL﹑500 ng/mL﹑1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用0.22 μm的有機濾膜過濾。

    二、方法

    (一)儀器條件

    1.色譜條件

    色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm﹑1.7 μm);流動相:A:乙腈,B:甲酸銨(5 mM)- 0.1%甲酸的水溶液;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣時間:5 min;洗脫程序:0~3 min:流動相A:B 為10:90,3~4 min:流動相A:B為70:30,4~5 min:流動相A:B為10:90。

    2.質(zhì)譜條件

    離子源:電噴霧電離(ESI);檢測方式:正離子;毛細(xì)管電壓:3.2 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣流速:800 L/h;脫溶劑氣溫度:400 ℃;錐孔氣流量:50 L/hr;掃描模式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)模式;錐孔電壓:48 V。穩(wěn)定基峰離子為m/z 307.39,兩個子離子碎片分別是m/z 180.35和m/z 167.30,通過比較兩者豐度高低,最后選擇豐度高的前者作為定量離子。100 ng/mL鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM離子色譜圖如圖1所示。

    (二)給藥與樣品采集

    溶劑選用酒精和生理鹽水(V:V=2:1),前期預(yù)實驗結(jié)果表明:小鼠經(jīng)尾靜脈注射鉤吻素子后,Dn=20 mg/kg,Dm=50 mg/kg。依據(jù)上述結(jié)果,經(jīng)改良寇氏法計算得出實驗劑量分別為20.48 mg/kg﹑25.6 mg/kg﹑32 mg/kg﹑40 mg/kg﹑50 mg/kg,給藥后觀察實驗小鼠在0.5 小時內(nèi)的中毒表現(xiàn)以及死亡時間﹑數(shù)量,之后采集小鼠組織并冷凍保存,用于后期檢測。

    圖1 Chromatograms of Koumine with MRM at a level of 100 ng/mL

    (三)樣品處理與檢測方法

    取上述實驗過程中所得檢材(血液:100 μL,臟器:50 mg并勻漿處理),加入乙腈4 mL,渦旋1 min,先以2000 r/min振蕩15 min,再以8000 r/min離心30 min,最后吸取上層清液并經(jīng)0.22 μm的有機濾膜過濾,進(jìn)樣檢測,檢測條件參照“儀器條件”項,以外標(biāo)曲線法定量。

    三、結(jié)果

    (一)工作曲線

    取小鼠空白血100 μL﹑空白肝50 mg,分別添加濃度為10 ng/mL﹑50 ng/mL﹑100 ng/mL﹑200 ng/mL﹑500 ng/mL﹑1000 ng/mL的鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液,加入4 mL乙腈,前處理方法參照“樣品處理與檢測方法”項,檢測條件參照“儀器條件”項,得到回歸方程,血:y=109.62x+1198.6,R2=0.9994;肝:y=563.70x+1437.1,R2=0.9993。結(jié)果表明在濃度為10~1000 ng/mL的范圍內(nèi),鉤吻素子線性關(guān)系良好,且最低檢測限為0.08 ng/mL和0.12 ng/mL (S/N≥3),最小定量限為0.2 ng/mL和0.4 ng/mL(S/N≥10)。

    (二)回收率和精密度

    取小鼠空白血100 μL﹑空白肝50 mg,分別添加濃度為10﹑100﹑500 ng/mL的鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)液,前處理方法參照“樣品處理與檢測方法”項,檢測條件參照“儀器條件”項,得到日內(nèi)﹑日間精密度。見表1。

    表1 Recovery and within- and between-day precisions of Koumine in plasma and liver samples(n=5)

    (三)死亡情況和半數(shù)致死量

    第1組實驗小鼠在給藥后立即表現(xiàn)出中毒癥狀,小鼠精神萎靡,困倦嗜睡,活動減少,身體發(fā)抖,四肢不穩(wěn),呼吸變緩,之后其癥狀減輕,無小鼠死亡。實驗2~4組小鼠前期的中毒癥狀與第1組基本相同,但初期中毒癥狀持續(xù)時間變短,之后小鼠出現(xiàn)異常興奮,具體表現(xiàn)為呼吸急促,四肢僵直,全身抽搐,甚至部分小鼠出現(xiàn)痙攣癥狀并最終死亡。第5組小鼠由于給藥劑量大,沒有表現(xiàn)出前期的中毒癥狀,給藥后小鼠呼吸受到明顯抑制,全身僵直并伴有劇烈的抽搐現(xiàn)象,部分小鼠還會出現(xiàn)跳躍和強直性驚厥癥狀,實驗小鼠在很短時間內(nèi)全部死亡。5組實驗小鼠的給藥劑量及死亡情況見表2。

    表2  Dose of Koumine and death rate of mice in the five groups

    根據(jù)上述表格中的相關(guān)數(shù)據(jù)以及改良寇氏的計算方法,半數(shù)致死量為30.60 mg/kg,95%可信區(qū)間是28.10~33.32 mg/kg。

    (四)組織含量分布

    實驗小鼠檢材的前處理方法參照“樣品處理與檢測方法”項,檢測條件參照“儀器條件”項,通過對50只小鼠的臟器及血液進(jìn)行檢測分析,得到鉤吻素子在實驗小鼠各臟器及血液中的含量分布。采用SPSS統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù),平行3次進(jìn)樣,實驗結(jié)果以平均數(shù)﹑標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計描述。鉤吻素子在小鼠不同臟器及血液中的分布結(jié)果見表3。

    四、討論

    (一)染毒動物模型

    本實驗選用群體動物模型,選擇ICR小鼠作為實驗對象,其優(yōu)點在于穩(wěn)定性好,簡單易復(fù)制,能夠通過大量實驗來保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。[9]實驗結(jié)果證明,動物模型的建立與實際情況相符,可以用于半數(shù)致死量的測定以及毒素的定性定量分析。對于溶劑的選擇,實驗考察了生理鹽水﹑酒精以及兩種溶液的混合,由于鉤吻素子自身理化性質(zhì)的限制,生理鹽水無法將其溶解,而酒精雖能將鉤吻素子溶解,但易引起實驗小鼠的酒精中毒,會對實驗造成影響,因此實驗后期主要考察了酒精與生理鹽水體積比例為1:1 和2:1的兩種情況。實驗發(fā)現(xiàn),由于小鼠注射體積的限制,對于高劑量的鉤吻素子,1:1的混合溶液無法完全溶解,而體積比為2:1時,能夠?qū)崿F(xiàn)完全溶解,達(dá)到實驗要求,因此選擇酒精與生理鹽水體積比為2:1作為實驗的溶劑。

    (二)組織含量分布

    表3 Distribution of Koumine (μg/g) after a intravenous administration of Koumine model of mice (x=s, n=10)

    鉤吻素子毒性很強,[10]靜脈注射25.6 mg/kg的鉤吻素子時,小鼠便出現(xiàn)中毒癥狀,甚至部分小鼠死亡。延髓呼吸中樞是鉤吻素子的主要作用區(qū)域,能夠引起呼吸麻痹,導(dǎo)致呼吸衰竭,這是鉤吻素子中毒引起死亡的根本原因。[11][12]鉤吻素子能夠?qū)ο到y(tǒng)造成一定程度的損害,[13][14]對胃﹑腎和肝等臟器作病理觀察時可發(fā)現(xiàn)大量瘀血,臟器粘膜出現(xiàn)充血﹑腫脹。此外鉤吻素子通過作用迷走神經(jīng),引起心律失常,進(jìn)而對心臟造成損傷。[15]實驗過程中部分小鼠會出現(xiàn)強直性驚厥甚至跳躍現(xiàn)象,這是由于鉤吻素子有類似于γ-氨基丁酸(GABA)拮抗劑的作用。[16]

    實驗結(jié)果顯示:鉤吻素子廣泛分布于小鼠體內(nèi)的各臟器中。鉤吻素子的含量以心臟﹑肺和腎最高,血中含量相對較低,肝﹑胰腺﹑肌肉和膀胱的含量居于中等,胃﹑脾和睪丸含量最低。實驗中可以發(fā)現(xiàn),隨著鉤吻素子給藥量的增加,小鼠中毒癥狀愈加明顯且死亡時間縮短。由于小鼠急性死亡,鉤吻素子在小鼠體內(nèi)無法代謝完全,導(dǎo)致2~5組小鼠體內(nèi)毒素在心臟﹑腎﹑和肺等組織中的含量最高,而第1組小鼠由于給藥劑量不足以致其急性死亡,鉤吻素子在小鼠體內(nèi)得以充分?jǐn)U散和代謝,導(dǎo)致之前毒素含量較低的臟器(如脾﹑胰腺﹑膀胱﹑睪丸等)反而高于其它臟器(如心臟﹑肺﹑腎等)。這一實驗結(jié)果說明鉤吻素子有從血液豐富的臟器(心臟﹑肺﹑腎)向血液不豐富的臟器(脾﹑胰腺﹑膀胱﹑睪丸等)分布擴散的趨勢。

    實驗首先建立染毒動物模型,確定了鉤吻素子對小鼠的半數(shù)致死量,并通過對生物檢材中鉤吻素子的定量分析,選取了毒素含量較高的心臟﹑肺﹑腎等臟器作為鉤吻素子急性中毒死亡的靶器官,有利于進(jìn)一步研究鉤吻素子的毒理作用,為相關(guān)中毒案(事)件中檢材的選擇以及鉤吻素子的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]陳翼勝, 中國有毒植物[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1990, 371-376.

    [2]張?zhí)m蘭, 王志睿, 黃昌全, 等. 鉤吻總生物堿中鉤吻素子的提取與分離[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2004(9): 1006-1008.

    [3]Xu Y, Qiu H Q, Liu H, et al. Effects of koumine, an alkaloid of Gelsemium elegans Benth. on inflammatory and neuropathic pain models and possible mechanism with allopregnanolone[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2012, 101(3): 504-514.

    [4]Liu M, Huang H H, Yang J, et al. The active alkaloid of Gelsemium elegans Benth. are potent anxiolytics[J].Psychopharmacology(Berl), 2013, 225(4): 839-851.

    [5]Dutt V, Thakur S, Dhar V J, et al. The genus gelsemium: an update[J]. Pharmacogn Rev, 2010, 4(8): 185-194.

    [6]陳仕生,陳業(yè)荷,徐志權(quán).鉤吻中毒的臨床特點及救治探討[J]. 中國急救醫(yī)學(xué), 2006(4): 298-300.

    [7]孟東江, 羅友杰. 搶救8例鉤吻中毒的經(jīng)驗及教訓(xùn)[J].中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學(xué)專業(yè)), 2012(313): 314-315.

    [8]陳滋浚. 生物檢材中雷公藤和鉤吻中主要有毒成分的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法研究[D]. 北京: 中國人民公安大學(xué), 2015.

    [9]趙森,張云峰,王炯,等.甲哌啶在大鼠體內(nèi)的分布研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報,2013(2):147-150.

    [10]終曉樂,甄漢深,秦海龍,等.鉤吻的研究概況[J].中藥研究進(jìn)展,2007(4):16-18.

    [11]謝立璟, 韓雪峰. 鉤吻中毒的機制、臨床特點及處理[J]. 藥物不良反應(yīng)雜志,2006(3):202-204.

    [12]蘇薇薇,徐偉,梁仁,等.鉤吻中毒機理及搶救方法研究[J].中藥材, 2001(7):510.

    [13]黃仲林, 黎秀葉. 鉤吻水溶性總堿對大鼠內(nèi)臟器官的影響[J]. 中國藥理通訊, 1986(3): 18-19.

    [14]趙振金, 周其錦, 高英立. 大鼠鉤吻堿毒性試驗-病理形態(tài)學(xué)觀察[J]. 實驗動物與動物實驗, 1990(1): 20-21.

    [15]楊倉良. 毒藥本草[M]. 北京:中國中醫(yī)藥出版社, 1993:1049-1050.

    [16]Rujjanawate C , Kanjanapothi D, Panthong A.Pharmacological effect and toxicity of alkaloids from Gelsemium elegans Benth[J]. J Ethnopharmacol, 2003, 89(1): 91-95.

    責(zé)任編輯:王燕

    The Research on Tissues Distribution of Koumine in Mice

    ZHANG Yong-zhi, HE Hong-yuan, SHE Cai-meng
    (School of Criminal Science and Technology, People's Public Security University of China, Beijing 100038, China)

    Abstract:Objective: A poisoned mice model of koumine was established to research median lethal dose (LD50).A UPLC-MS/MS method was used for qualitative detection and quantitative determination of the distribution of koumine in the bio-samples.Methods: Based on the preliminary experimental results, koumine standards were given to mice intravenously with the concentration of 20.48 mg/kg, 25.6 mg/kg, 32 mg/kg, 40 mg/kg, and 50 mg/kg.The mice were observed for 0.5 hour, toxic symptoms and death time were recorded and inspection of tissues and visceral organs were conducted after dissection.Results: The LD50 of mice is 30.60 mg/kg and 95% confidence interval is 28.10~33.32 mg/kg with the injection of koumine intravenously.Visceral organs with higher toxin distribution than others such as heart, lungs, kidney can be considered as target organ of koumine poisoning.Conclusion: In this research, LD50 and 95% confidence interval has been established and target organs in acute poisoning of koumine in mice has been selected, which can provide target samples and the basis for evaluation for the investigation of the poisoning cases involved in koumine in forensic science field.

    Key words:Gelsmium elegans Benth; koumine; UPLC-MS/MS; tissue distribution

    DOI:10.13310/j.cnki.gzjy.2016.02.007

    [中圖分類號:D918.9

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1671-5195(2016)02-0046-05]

    作者簡介:張永志(1989-),男,河北任丘人,中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院碩士研究生;

    基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81273346)。

    收稿日期:2015-10-18

    99热这里只有是精品在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日韩强制内射视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 丝袜喷水一区| 日韩亚洲欧美综合| 精品久久久久久久末码| 国产三级在线视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产麻豆成人av免费视频| 一夜夜www| 国产一区二区激情短视频| 日韩一本色道免费dvd| 18+在线观看网站| 亚洲第一电影网av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲欧美日韩无卡精品| 1000部很黄的大片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产av麻豆久久久久久久| 国产淫片久久久久久久久| 成人无遮挡网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产成年人精品一区二区| 国产精品伦人一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品女同一区二区软件| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 在线观看av片永久免费下载| 又黄又爽又免费观看的视频| 黄色欧美视频在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲熟妇熟女久久| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕av成人在线电影| 看十八女毛片水多多多| 18+在线观看网站| 亚洲在线自拍视频| 久久久久久久久久久丰满| 亚洲欧美精品综合久久99| 成年女人毛片免费观看观看9| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 狠狠狠狠99中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 乱人视频在线观看| 99热只有精品国产| 黄片wwwwww| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 国产av在哪里看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 大香蕉久久网| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久午夜福利片| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲18禁久久av| 午夜a级毛片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日本a在线网址| 久久精品影院6| 一进一出抽搐gif免费好疼| 18+在线观看网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品女同一区二区软件| 深夜精品福利| 久久99热6这里只有精品| 久久精品综合一区二区三区| 国产av在哪里看| 亚洲乱码一区二区免费版| 一级a爱片免费观看的视频| 丝袜美腿在线中文| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人美女网站在线观看视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本色播在线视频| 搡老岳熟女国产| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美bdsm另类| 精品乱码久久久久久99久播| av天堂在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲色图av天堂| 观看免费一级毛片| 国内精品宾馆在线| av国产免费在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久午夜欧美精品| 12—13女人毛片做爰片一| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 联通29元200g的流量卡| 国产伦精品一区二区三区四那| 老司机福利观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美一区二区亚洲| 欧美性感艳星| 搡老妇女老女人老熟妇| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美性感艳星| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av熟女| 毛片一级片免费看久久久久| 夜夜爽天天搞| 男女视频在线观看网站免费| 成人午夜高清在线视频| 一个人免费在线观看电影| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日本免费a在线| 国产高清三级在线| 亚洲在线观看片| 国产欧美日韩精品一区二区| 中文字幕久久专区| 99热这里只有是精品50| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 在线播放国产精品三级| 久久人妻av系列| 啦啦啦韩国在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 色5月婷婷丁香| 伦精品一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人永久免费在线观看视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 最新中文字幕久久久久| 美女大奶头视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 中文字幕av成人在线电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美人与善性xxx| 亚洲性久久影院| 伦精品一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| .国产精品久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲在线自拍视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 看免费成人av毛片| 村上凉子中文字幕在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品三级大全| 久久中文看片网| 久久中文看片网| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲成人精品中文字幕电影| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产午夜福利久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 在线观看av片永久免费下载| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品成人久久久久久| 高清日韩中文字幕在线| 99在线人妻在线中文字幕| 99九九线精品视频在线观看视频| 色播亚洲综合网| 久久久国产成人免费| 如何舔出高潮| 成人二区视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲在线观看片| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲色图av天堂| 成人av一区二区三区在线看| av天堂在线播放| 国产不卡一卡二| 亚洲熟妇熟女久久| 香蕉av资源在线| 长腿黑丝高跟| 色综合站精品国产| 国产精品女同一区二区软件| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲av第一区精品v没综合| 综合色丁香网| 午夜福利在线观看吧| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品久久久久久久久免| 欧美国产日韩亚洲一区| 成人永久免费在线观看视频| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 我要搜黄色片| 插阴视频在线观看视频| 国产视频内射| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一级毛片aaaaaa免费看小| 色综合色国产| 全区人妻精品视频| 精华霜和精华液先用哪个| 国产男人的电影天堂91| 久久久精品欧美日韩精品| 最后的刺客免费高清国语| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日本视频| 国产一区二区三区av在线 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 在线观看午夜福利视频| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av不卡在线观看| 青春草视频在线免费观看| 欧美人与善性xxx| 成人av一区二区三区在线看| 国产一区亚洲一区在线观看| 色播亚洲综合网| 免费看日本二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲欧美精品自产自拍| av天堂中文字幕网| 亚洲经典国产精华液单| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲,欧美,日韩| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 此物有八面人人有两片| 91av网一区二区| 亚洲av美国av| a级毛片a级免费在线| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久国产成人免费| 中文在线观看免费www的网站| 91在线观看av| 亚洲最大成人中文| 22中文网久久字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久午夜福利片| 亚洲av不卡在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 悠悠久久av| 免费高清视频大片| 亚洲高清免费不卡视频| 久久人人爽人人片av| av在线老鸭窝| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲美女黄片视频| 我要看日韩黄色一级片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 欧美一区二区亚洲| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩高清综合在线| 国产美女午夜福利| 久久久久久久久久久丰满| 可以在线观看毛片的网站| 91狼人影院| 免费观看在线日韩| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产成人福利小说| 99久久精品国产国产毛片| 一本精品99久久精品77| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本五十路高清| 国产av不卡久久| 观看美女的网站| 三级毛片av免费| 老女人水多毛片| 国产高清不卡午夜福利| 日韩av不卡免费在线播放| 天堂√8在线中文| 日韩欧美精品免费久久| 91精品国产九色| av在线亚洲专区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99久久中文字幕三级久久日本| 丰满人妻一区二区三区视频av| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲一区高清亚洲精品| a级一级毛片免费在线观看| av天堂中文字幕网| 无遮挡黄片免费观看| 变态另类丝袜制服| 嫩草影院新地址| 一进一出抽搐动态| 亚洲不卡免费看| av在线老鸭窝| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 欧美日韩国产亚洲二区| 久久久午夜欧美精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国模一区二区三区四区视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 91在线精品国自产拍蜜月| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 老女人水多毛片| 看十八女毛片水多多多| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一级毛片久久久久久久久女| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 久久久久久久久久黄片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久久亚洲中文字幕| 插逼视频在线观看| 久久中文看片网| 国产真实乱freesex| 欧美3d第一页| av专区在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 男人舔奶头视频| 97在线视频观看| 一进一出抽搐动态| 18+在线观看网站| 午夜福利高清视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产成人影院久久av| 国产综合懂色| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 人妻久久中文字幕网| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 少妇熟女欧美另类| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久精品91蜜桃| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲五月天丁香| 成熟少妇高潮喷水视频| 成年版毛片免费区| 美女黄网站色视频| 69av精品久久久久久| 国产精品久久久久久久久免| 黄色日韩在线| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 麻豆国产97在线/欧美| 1024手机看黄色片| 久久久精品大字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 色综合站精品国产| 可以在线观看的亚洲视频| 看片在线看免费视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩欧美免费精品| 亚洲美女搞黄在线观看 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一个人看视频在线观看www免费| 日本黄大片高清| 国产av不卡久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 美女cb高潮喷水在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 免费观看在线日韩| 99热网站在线观看| 99久国产av精品国产电影| 亚洲无线观看免费| 欧美又色又爽又黄视频| 国产成人影院久久av| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲最大成人av| 99热全是精品| 尾随美女入室| 国产 一区精品| 亚洲七黄色美女视频| 老司机福利观看| 一个人看的www免费观看视频| 美女大奶头视频| 日本a在线网址| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99久久九九国产精品国产免费| 精品国产三级普通话版| 日本欧美国产在线视频| 国产91av在线免费观看| 女同久久另类99精品国产91| 国内揄拍国产精品人妻在线| 一本久久中文字幕| 国内精品久久久久精免费| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜亚洲福利在线播放| 精品日产1卡2卡| 插逼视频在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 欧美3d第一页| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 午夜精品一区二区三区免费看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 九九爱精品视频在线观看| 国产黄片美女视频| 亚州av有码| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲成av人片在线播放无| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费观看的影片在线观看| 国产精品野战在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 99久国产av精品国产电影| 欧美激情久久久久久爽电影| 日日撸夜夜添| 在线免费观看不下载黄p国产| 一个人看的www免费观看视频| 露出奶头的视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美中文日本在线观看视频| 色哟哟哟哟哟哟| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品野战在线观看| 美女黄网站色视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品一区二区三区视频在线| 成年版毛片免费区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久久久亚洲中文字幕| av天堂在线播放| 久久午夜亚洲精品久久| 白带黄色成豆腐渣| 日本精品一区二区三区蜜桃| 欧美国产日韩亚洲一区| 搡老岳熟女国产| 日本一二三区视频观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 在线免费观看的www视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 插逼视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 淫妇啪啪啪对白视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩精品有码人妻一区| 九九热线精品视视频播放| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜影院日韩av| 成人性生交大片免费视频hd| 亚洲成人av在线免费| 国产精品女同一区二区软件| 免费人成在线观看视频色| 久久亚洲精品不卡| 女人被狂操c到高潮| 久久热精品热| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 看片在线看免费视频| 天堂√8在线中文| 亚洲图色成人| 久久国产乱子免费精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 一个人看的www免费观看视频| 中国国产av一级| 晚上一个人看的免费电影| 在线观看av片永久免费下载| 天天躁日日操中文字幕| 色5月婷婷丁香| 久久精品影院6| 亚洲国产精品国产精品| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 老司机影院成人| 日本熟妇午夜| 丰满乱子伦码专区| av在线老鸭窝| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美成人精品欧美一级黄| ponron亚洲| 久久九九热精品免费| 网址你懂的国产日韩在线| 国产成人福利小说| 又爽又黄a免费视频| 日本色播在线视频| 国产美女午夜福利| 中文亚洲av片在线观看爽| 丝袜美腿在线中文| 亚洲国产精品合色在线| 两个人视频免费观看高清| 日韩成人伦理影院| 成人特级av手机在线观看| 国产乱人偷精品视频| 午夜福利在线在线| 人妻少妇偷人精品九色| 精品一区二区三区人妻视频| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久久欧美国产精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 午夜福利成人在线免费观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品欧美国产一区二区三| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久大精品| 成人综合一区亚洲| 国产私拍福利视频在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 国产高清激情床上av| 人妻久久中文字幕网| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品欧美国产一区二区三| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 我要看日韩黄色一级片| 18+在线观看网站| 舔av片在线| 成人精品一区二区免费| 国产成人福利小说| 亚洲在线观看片| 国产成年人精品一区二区| 国产乱人偷精品视频| 最好的美女福利视频网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 大香蕉久久网| 久久久久久国产a免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 久久99热这里只有精品18| 成年女人毛片免费观看观看9| 日本五十路高清| 一级黄片播放器| av天堂在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩欧美免费精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品电影一区二区三区| 长腿黑丝高跟| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产成年人精品一区二区| 日本一本二区三区精品| 黑人高潮一二区| 亚洲国产精品国产精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 秋霞在线观看毛片| 不卡一级毛片| 国产成人aa在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 成人性生交大片免费视频hd| 1000部很黄的大片| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲四区av| 永久网站在线| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黄色日韩在线| av卡一久久| 一级黄色大片毛片| 六月丁香七月| 国产毛片a区久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 一个人看视频在线观看www免费| 听说在线观看完整版免费高清| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚州av有码| 十八禁国产超污无遮挡网站| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美极品一区二区三区四区| 婷婷色综合大香蕉| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av国产免费在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产精品,欧美在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲丝袜综合中文字幕| 成年女人永久免费观看视频| 日韩欧美在线乱码| 观看美女的网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 中文在线观看免费www的网站| 亚洲美女视频黄频| 久久久久久久久久久丰满| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲人成网站高清观看| 色哟哟·www| 久久久久久久久中文| 日本免费a在线| 亚洲国产精品合色在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 欧美激情在线99| 白带黄色成豆腐渣| 日韩欧美精品免费久久| 精品熟女少妇av免费看| 久久久色成人| 亚洲激情五月婷婷啪啪|