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    一致性檢驗(yàn)比較兩種弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒

    2016-04-25 00:34:07李知新劉光遠(yuǎn)田進(jìn)梅張學(xué)軍張和平甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州70070中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室甘肅蘭州70046寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心寧夏銀川7500
    甘肅畜牧獸醫(yī) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:弓形蟲

    李知新,劉光遠(yuǎn),趙 燕,田進(jìn)梅,張學(xué)軍,張和平,吳 潤(.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州70070 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州70046;.寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,寧夏銀川7500;)

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    一致性檢驗(yàn)比較兩種弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒

    李知新1,2,3,劉光遠(yuǎn)2*,趙燕3,田進(jìn)梅3,張學(xué)軍3,張和平3,吳潤1
    (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730070 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州730046;3.寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心,寧夏銀川750011;)

    摘要:比較兩個(gè)弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性,為流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷篩選可合理使用的商品化試劑盒。對(duì)510份豬血清分別進(jìn)行弓形蟲抗體IHA和ELISA檢測(cè),應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性并進(jìn)行分析,用x2檢驗(yàn)分析差異性。兩種試劑盒聯(lián)合檢出79份陽性,陽性符合率為67.52%,陰性符合率為95.17%,總符合率為88.82%。x2檢驗(yàn)差異顯著(x2=228.23,p=0.00);u檢驗(yàn)值為15.89,兩種產(chǎn)品的一致性為中度一致(Kappa值=0.66)。所以弓形蟲病IHA檢測(cè)試劑盒可作為現(xiàn)場(chǎng)收益流行病學(xué)調(diào)查,而弓形蟲IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒適合輔助臨床檢測(cè)和診斷。x2檢驗(yàn)比較兩種試劑盒具有局限性。u檢驗(yàn)排除偶然性造成的一致程度,與Kappa檢驗(yàn)結(jié)合可比較一致性。弓形蟲抗體檢測(cè)要根據(jù)實(shí)況選擇不同的試劑盒。

    關(guān)鍵詞:弓形蟲;Kappa檢驗(yàn);x2檢驗(yàn);u檢驗(yàn);IHA;ELISA

    弓形蟲(Toxoplasma)是一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生原蟲,可引起人獸共患寄生蟲病[1]。弓形蟲病缺乏特異性臨床癥狀和體征,臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多變,診斷較為困難,對(duì)其有效地診斷顯得尤為重要[2]。弓形蟲病檢測(cè)以免疫學(xué)為主,如間接血凝試驗(yàn)(IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)、膠乳凝集試驗(yàn)(LA)等[3]。目前市售商品化試劑盒種類較多,基層實(shí)驗(yàn)室常用IHA和ELISA方法診斷弓形蟲病。

    Kappa一致性檢驗(yàn)在診斷試驗(yàn)中有兩種情況中:一種是評(píng)價(jià)待評(píng)價(jià)的診斷實(shí)驗(yàn)方法與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性;另一種是評(píng)價(jià)兩種診斷方法對(duì)同一個(gè)樣本的診斷結(jié)果的一致性或兩個(gè)檢驗(yàn)工作者對(duì)同一種現(xiàn)象的診斷結(jié)論的一致性或同一檢驗(yàn)工作者對(duì)同一現(xiàn)象前后進(jìn)行兩次觀察做出的診斷的一致性[4-6]。應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較獸醫(yī)檢測(cè)試劑盒國外曾有報(bào)道。如Willems T等人利用兩種商品化的試劑盒,對(duì)口蹄疫病毒細(xì)胞增值活性進(jìn)行檢測(cè),細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒具有極強(qiáng)的一致性(u值=0.85,Kappa值=0.97)[7];Chen T H等人用Kappa檢驗(yàn)比較了口蹄疫病毒液相芯片檢測(cè)法和3ABC多肽阻斷ELISA檢測(cè)法,兩種檢測(cè)方法的符合率為96.3%,Kappa檢驗(yàn)強(qiáng)度極強(qiáng)(Kappa值=0.92)[8]。國內(nèi)除劉華用Kappa檢驗(yàn)比較豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)試劑盒外[9],未見其他報(bào)道。本試驗(yàn)用兩個(gè)商品化的弓形蟲檢測(cè)試劑盒開展弓形蟲抗體檢測(cè),并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了一致性檢驗(yàn)和分析,為選擇獸醫(yī)診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1試劑

    弓形體間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所(抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清批號(hào):20131030,標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和稀釋液批號(hào):20130815),動(dòng)物弓形蟲IgG抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購自海泰生物制藥有限公司(批號(hào):20131106)。

    1.2豬血清

    510份豬血清采自寧夏16個(gè)規(guī)?;B(yǎng)殖場(chǎng)和61個(gè)散養(yǎng)戶。

    1.3方法

    1.3.1檢測(cè)方法

    1.3.1.1弓形蟲間接血凝試驗(yàn)按試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定時(shí),陽性對(duì)照血清滴度不低于1∶1024;陰性對(duì)照血清除第1孔允許存在前滯現(xiàn)象“+”外,各孔均為“-”;稀釋液對(duì)照為“-”實(shí)驗(yàn)成立。被檢血清抗體滴度≥1∶64,“++”判為陽性。

    1.3.1.2弓形蟲IgG抗體ELISA檢測(cè)將樣品和樣品稀釋液按1:100比例稀釋。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定時(shí),陰性對(duì)照OD450nm≤0.20,臨界對(duì)照0.2<0OD450nm<0.60、陽性對(duì)照OD450nm>0.60時(shí),試驗(yàn)成立。被檢樣品OD450nm>臨界對(duì)照OD450nm×1.1判為陽性;被檢樣品OD450nm<臨界對(duì)照OD450nm×0.9判為陰性;介于二者之間判為可疑,需重新測(cè)定。

    1.3.2Kappa系數(shù)的計(jì)算制作C×C列聯(lián)表,按照參考文獻(xiàn)[4-6]方法計(jì)算Kappa值。

    1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和參考判斷指標(biāo)

    采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)2種產(chǎn)品檢測(cè)的陽性率進(jìn)行x2檢驗(yàn);u檢驗(yàn)按照參考文獻(xiàn)[4]計(jì)算,用來排除抽樣誤差的影響,在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下<0.05在統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為Kappa值并非由抽樣誤差所致,如果u值<1.96,則>0.05,則Kappa值大小沒有意義。一致性檢驗(yàn)進(jìn)行Kappa分析,當(dāng)K<0,極差;0.0~0.2,微弱;0.21~0.40,弱;0.41~0.60,中度;0.61~0.80,高度;0.81~1.00,極強(qiáng)[10]。

    2 結(jié)果

    IHA試劑盒單獨(dú)檢出98份陽性,陽性率19.22% (98/510),IgG抗體ELISA試劑盒單獨(dú)檢出117份陽性,陽性率22.94%(117/510),IgG抗體ELISA試劑盒檢測(cè)陽性略高于IHA試劑盒,經(jīng)x2檢驗(yàn)差異顯著(x2=228.232,p=0.00)。

    兩種試劑盒聯(lián)合檢出79份陽性,陽性率符合率為67.52%(79/117),陰性符合率為95.17%(374/393),總符合率為88.82%(453/510)。為排除因抽樣誤差等偶然性導(dǎo)致兩種結(jié)果的一致性,進(jìn)行u檢驗(yàn),經(jīng)檢測(cè)u檢驗(yàn)值為15.89,大于95%標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分位數(shù)1.96,Kappa一致性檢驗(yàn)值為0.66,表明兩種產(chǎn)品的一致性強(qiáng)度為中度。兩種試劑盒同時(shí)檢測(cè)510份血清結(jié)果見表1。

    3 討論

    Kappa一致性檢驗(yàn)在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域中應(yīng)用較為廣泛[6,9-12]。在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究工作中,常遇到兩種檢測(cè)方法或兩名檢驗(yàn)人員的檢測(cè)結(jié)果是否一致以及用同一種方法進(jìn)行多次測(cè)定的結(jié)果能否重現(xiàn)的問題[6]。國內(nèi)在獸用疫病檢測(cè)試劑盒、實(shí)驗(yàn)室比對(duì)等方面應(yīng)用一致性檢驗(yàn)的方法對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析報(bào)道不常見。

    有關(guān)文獻(xiàn)中常見用符合率、x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和回歸系數(shù)等方法間接反映兩種結(jié)果的一致性,這些統(tǒng)計(jì)方法都存在局限性和不足[5]。在比較試劑盒之間的一致性時(shí),x2檢驗(yàn)只能分辯兩者差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不能反映兩者是否一致,甚至可能得出完全相反的結(jié)論,這與王潔貞等人的觀點(diǎn)一致[4]。而Kappa檢驗(yàn)不僅可用于一致性檢驗(yàn),而且能給出一個(gè)反映一致性程度的值[5]。根據(jù)實(shí)際資料計(jì)算的K值只是一個(gè)樣本的統(tǒng)計(jì)量,存在著抽樣誤差,因而,所計(jì)算的K值是否來自K值為“0”的總體(即兩者之間的一致程度是由于機(jī)遇造成的),應(yīng)當(dāng)經(jīng)過假設(shè)檢驗(yàn)(u檢驗(yàn))[6]。本試驗(yàn)u檢驗(yàn)值為15.89,大于95%標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分位數(shù)1.96,故P<0.05,可以排除偶然性導(dǎo)致的兩種結(jié)果的一致,在α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)下可認(rèn)定兩種檢驗(yàn)方法具有一致性,且根據(jù)Kappa值為0.66這個(gè)判斷指標(biāo),表明兩種產(chǎn)品的一致性強(qiáng)度為中度,說明這兩種試劑盒在血清學(xué)調(diào)查中差異不顯著,而x2檢驗(yàn)表明兩種試劑盒檢測(cè)差異顯著。

    弓形蟲蟲體蛋白質(zhì)基因組復(fù)雜,在宿主體內(nèi)產(chǎn)生的抗體也就不同。雖然重組抗原診斷弓形蟲病的特異性很高,但敏感性仍低于天然抗原,將多個(gè)重組抗原組合成“雞尾酒”式的診斷抗原或重組復(fù)合多表位診斷抗原等方法有望克服漏檢現(xiàn)象,提高診斷的準(zhǔn)確性[3]。但是弓形蟲病的IHA一般在病后1個(gè)月左右出現(xiàn)陽性[13,15],因此,除人為因素外,與陽性出現(xiàn)的早晚有很大關(guān)系,而且IHA操作簡便,不需要特殊檢測(cè)儀器,因此認(rèn)為該方法更適用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查,這與李冕、Patton S等人的觀點(diǎn)一致[2,13]。周海寧等人認(rèn)為弓形蟲間接血凝方法陽性檢出率低,結(jié)果判定與人為因素影響大有關(guān),而弓形蟲IgG抗體ELISA方法客觀、敏感,省時(shí)、快捷,更適合于血清學(xué)調(diào)查[14]。由于該方法可出現(xiàn)假陽性,建議應(yīng)用于輔助臨床檢測(cè)和診斷,這與陳麗萍等人觀點(diǎn)一致[15]。因此,應(yīng)根據(jù)現(xiàn)有診斷資源合理選擇弓形蟲病的診斷方法,以適應(yīng)不同感染階段的診斷和不同目的的檢測(cè)。

    表1 兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較

    參考文獻(xiàn):

    [1]Sibley L D,Boothroyd J C.Virulent strains of Toxoplasma gondii comprise a single clonal lineage[J].Nature,1992,359(6390):82-85.

    [2]李冕,尹昆,閆歌.弓形蟲病的診斷技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].中國病原生物學(xué)雜志,2011,6(12):942-944.

    [3]盧志民,張進(jìn)順.弓形蟲感染免疫診斷抗原研究進(jìn)展[J].中國血吸蟲病防治雜志,2011,23(5):590-594.

    [4]王潔貞,韓兢,劉彥訓(xùn),等.Kappa統(tǒng)計(jì)量在一致性和重現(xiàn)性檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,34(3):209-212.

    [5]李春波,何燕玲,張明園.一致性檢驗(yàn)方法的合理應(yīng)用[J].上海精神醫(yī)學(xué),2000,12(4):228-232.

    [6]夏邦世,吳金華.Kappa一致性檢驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜,2006,29(1):83-84.

    [7]Willems T,Lefebvre D J,Neyts J,et al.Diagnostic performance and application of two commercial cell viability assays in foot-and-mouth disease research[J].J Virol Methods,2011,173(1):108-14.

    [8]Chen T H,Lee F,Lin Y L,et al.Development of a Luminex assay for the detection of swine antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus[J].J Immunol Methods,2013,396(1-2):87-95.

    [9]劉華,詹松鶴,何長生,等.應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)試劑盒[J].中國動(dòng)物檢疫,2014,31 (11):95-96.

    [10]田苗,王鵬新,嚴(yán)泰來,等.Kappa系數(shù)的修正及在干旱預(yù)測(cè)精度及一致性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2012,28(24):1-7.

    [11]張波.Kappa一致性檢驗(yàn)在流行病學(xué)中的應(yīng)用舉例[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1995,17(4):336-337.

    [12]Pietkiewicz H,HiszczynskaSawicka E,Kur J,et al.Usefulness of Toxoplasma gondii specific recombinant antigens in serodiagnosis of human toxoplasmosis[J].J Clin Microbiol,2004,42(4):1779-1781.

    [13]Patton S,Johnson S S,Puckett K.Prevalence of Toxoplasma gondii antibodies in nine populations of dairy goats:compared titers using modified direct agglutination and indirect hemagglutination[J].J parasitology,1990,76(1):74-77.

    [14]周海寧,張成蓮,王進(jìn)香,等.豬弓形蟲血清學(xué)檢測(cè)方法比較[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2014:38-39.

    [15]陳麗萍,陳慰,桂馨.ELISA弓形蟲IgG抗體試劑盒的研制[J].放射免疫學(xué)雜志,2002,15(1):57-59.

    通訊作者:劉光遠(yuǎn)*

    作者簡介:李知新(1981-),男,寧夏隆德人,高級(jí)獸醫(yī)師,在讀獸醫(yī)博士,主要從事動(dòng)物疾病預(yù)防與控制研究。

    基金項(xiàng)目:寧夏回族自治區(qū)科技支撐項(xiàng)目(2013ZZN30)

    中圖分類號(hào):S855.9

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

    文章編號(hào):1006-799X(2016)12-0081-02

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