燕麥AsNAC1耐鹽基因的克隆及初步驗(yàn)證

張勝博，劉景輝，李立軍，趙寶平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019）

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是一個(gè)龐大的家族，其成員超過(guò)110個(gè)[1]。在擬南芥和水稻全基因組范圍內(nèi)表達(dá)譜分析的研究中發(fā)現(xiàn)20%～25%的NAC基因被至少一種諸如鹽、干旱、冷或ABA的非生物逆境脅迫和植物激素所誘導(dǎo)[2-4]。NAC轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同逆境脅迫有極大的響應(yīng)作用[5]。NAC基因家族中的很多成員在植物對(duì)非生物逆境脅迫反應(yīng)中存在差別表達(dá)特征，這種在非生物逆境脅迫反應(yīng)中的差別表達(dá)可能反映了NAC基因在植物抗非生物脅迫中具有一定的生物學(xué)功能。研究顯示：高鹽、干旱等逆境脅迫或ABA 能 誘 導(dǎo) 水 稻 SNAC1、OsNAC6/SNAC2、OsNAC5、OsNAC10、OsNAC045，擬 南 芥 ATAF1、AtNAC019、AtNAC055 和 AtNAC072/RD26 等 NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，而且功能研究也證明這些NAC基因在抗鹽、抗旱反應(yīng)中具有作用[6-8]。所以NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[9-10]以及逆境應(yīng)答[11-12]分子網(wǎng)絡(luò)中扮演著極其重要的角色，是作物遺傳工程的優(yōu)良候選資源。因此，本試驗(yàn)以燕麥VAO-9品種為材料，以本實(shí)驗(yàn)室反轉(zhuǎn)錄測(cè)序得到的一條基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR克隆基因全長(zhǎng)序列。構(gòu)建植物表達(dá)載體并通過(guò)花藥侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，在鹽脅迫條件下觀察其生長(zhǎng)狀況。為揭示NAC家族基因AsNAC1在植物中的耐鹽機(jī)制提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物耐鹽能力奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

燕麥VAO-9種子、野生型擬南芥種子、RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α、克隆載體pMD19-T Vector、過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301、DNA 限制性內(nèi)切酶 、Premix PrimeSTAR HS、DNA Marker等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR克隆AsNAC1的全長(zhǎng)序列 總RNA的提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。第一鏈cDNA合成參照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。設(shè)計(jì)AsNAC1全長(zhǎng)引物FpNAC（GGAAGATCTATGGGGATGGCCGTGC GCAGG）和 RpNAC（CGGGGTTACCTCAGAAGGGGC CCGGCATGCC），F(xiàn)pNAC添加了BglⅡ酶切位點(diǎn)，RpNAC添加了BstEⅡ酶切位點(diǎn)。利用TaKaRa公司的Premix PrimeSTAR HS以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系及程序參照Premix PrimeSTAR HS使用說(shuō)明書(shū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)檢測(cè)、回收、純化后連接至pMD19-T Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆后測(cè)序。

1.2.2 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株的獲得 將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒與pCAMBIA1301質(zhì)粒同時(shí)用BglⅡ和BstEⅡ雙酶切反應(yīng)，然后將獲得的目的片段和表達(dá)載體在T4連接酶作用下于16℃水浴過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并鑒定陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒。采用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥。

1.2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物的篩選及觀察 將收獲的擬南芥T0轉(zhuǎn)基因種子用75%酒精消毒10 min，然后無(wú)水乙醇消毒10 min，于超凈工作臺(tái)干燥。將種子播種在含25 mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上，在4℃冰箱中同步化3 d后于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后挑選抗性植株移栽到裝有蛭石和營(yíng)養(yǎng)土（1∶2）的盆缽中培養(yǎng)至成熟，并對(duì)植株進(jìn)行PCR鑒定。收獲T1種子。

將T1種子消毒后播種在含25 mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)分離比為3∶1的植株移栽并培養(yǎng)至成熟，收獲T2種子。

1.2.4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率及植株根長(zhǎng)、鮮重和干重測(cè)定 將野生型擬南芥種子和T2轉(zhuǎn)基因擬南芥種子滅菌后，播種于含150 moL/L NaCl的MS培養(yǎng)基，每皿播種100粒。4℃同步化3 d后，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，以有2片綠色子葉為萌發(fā)標(biāo)志。培養(yǎng)12 d時(shí)測(cè)量植株根長(zhǎng)、鮮重和干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥AsNAC1的序列分析

對(duì)已知序列全長(zhǎng)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)ORF序列963 bp，編碼氨基酸320個(gè)。將序列命名為AsNAC1并提交GenBank，登錄號(hào)為KU886332。AsNAC1基因全長(zhǎng)序列如下：

加粗標(biāo)示的為起始密碼子和終止密碼子

AsNAC1所編碼的氨基酸序列如下：

2.2 AsNAC1基因生物信息學(xué)分析

在NCBI上分析此蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖1，其屬于NAC家族。并利用DNAMAN軟件對(duì)該氨基酸序列與同源性較高的不同植物的NAC家族氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），結(jié)果顯示AsNAC1蛋白與大麥NAC蛋白和4個(gè)小麥NAC蛋白同源性較高，相似度為86%，而與二穗短柄草NAC蛋白的同源相似度為81%，和短花藥野生稻、高粱和南荻NAC蛋白同源相似度為66%。進(jìn)而表明燕麥AsNAC1蛋白與大麥和小麥的NAC蛋白家族進(jìn)化關(guān)系較近，而與其他植物進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。TMHMM和TMpred預(yù)測(cè)AsNAC1跨膜結(jié)構(gòu)域，都預(yù)測(cè)出該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3和圖4）。ProtComp Version預(yù)測(cè)AsNAC1基因亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示位于細(xì)胞核概率較大（圖5）。ProtScale預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)為親水蛋白（圖6）。

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性分析

為進(jìn)一步研究AsNAC1基因的功能，成功構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301-AsNAC1（圖7，圖8，圖9）。轉(zhuǎn)化擬南芥后篩選出5株潮霉素抗性株系，并通過(guò)PCR鑒定為陽(yáng)性植株。結(jié)果顯示5株擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中均可檢測(cè)到外源基因的表達(dá)，野生型對(duì)照未檢測(cè)到外源基因表達(dá)（圖10）。將這5株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株收獲的種子點(diǎn)播在添加25 mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)得到3個(gè)株系的分離比接近 3∶1（表 1）。在 150 mmol/L NaCl脅迫下對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗性鑒定，野生型和過(guò)表達(dá)擬南芥種子的萌發(fā)率可以看出（圖11），從第三天萌發(fā)開(kāi)始，轉(zhuǎn)基因種子每天的萌發(fā)率都比野生型高，10 d時(shí)的萌發(fā)率野生型為43%，而轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)率為63%，說(shuō)明AsNAC1的過(guò)量表達(dá)提高了擬南芥種子的耐鹽能力。未脅迫處理的野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)、鮮重和干重?zé)o明顯差異，在150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)、鮮重和干重均高于野生型植株。根長(zhǎng)的比較結(jié)果表明（圖12），轉(zhuǎn)基因型株系1、株系2和株系3分別為野生型植株根長(zhǎng)的1.39倍、1.52和1.37倍，差異顯著；鮮重和干重的比較結(jié)果表明（圖13、圖14），轉(zhuǎn)基因型植株為野生型植株鮮重的1.50倍，差異顯著，轉(zhuǎn)基因型植株為野生型植株干重的1.49倍，差異顯著。上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因型植株在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的耐鹽性。

表1 T2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株5株系篩選分離比統(tǒng)計(jì)

3 討論

NAC基因是被鹽、干旱、冷或ABA等非生物逆境脅迫和植物激素所誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[13-16]。本試驗(yàn)克隆在鹽脅迫誘導(dǎo)下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的AsNAC1基因，使用NCBI分析其蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示它屬于NAC基因家族。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析AsNAC1蛋白與大麥NAC家族蛋白和4個(gè)小麥NAC家族蛋白同源性較高，相似度為86%，而與二穗短柄草NAC家族蛋白的同源相似度為81%，和短花藥野生稻、高粱和南荻NAC家族蛋白同源相似度為66%。進(jìn)而表明燕麥AsNAC1蛋白與大麥和小麥的NAC蛋白進(jìn)化關(guān)系較近。研究顯示，高鹽等逆境脅迫能誘導(dǎo)水稻 SNAC1、OsNAC5、OsNAC6/SNAC2、OsNAC10 和 ONAC045；擬南芥 ATAF1、ANAC019、ANAC072/RD26和ANAC055等NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)，而且功能研究也證實(shí)了這些NAC基因?yàn)槟望}基因[17-20]。水稻的OsNAC063基因受高鹽誘導(dǎo)表達(dá)，擬南芥轉(zhuǎn)OsNAC063基因過(guò)表達(dá)植株的種子耐鹽性增強(qiáng)，對(duì)高滲透壓的耐受能力提高[20]。NaCl脅迫下野生型和過(guò)表達(dá)株系的萌發(fā)率說(shuō)明AsNAC1基因過(guò)表達(dá)可以提高種子萌發(fā)時(shí)期對(duì)高鹽的耐受能力。紫花苜蓿MsNAC2轉(zhuǎn)煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草植株鮮重和干重均高于野生型[21]。本研究中轉(zhuǎn)AsNAC1基因擬南芥植株鮮干重也顯著高于野生型對(duì)照組。植物根部是水分吸收的重要部位，根系發(fā)達(dá)的植物在逆境條件下生活得更好，野生型植株和T3轉(zhuǎn)基因植株NaCl脅迫培養(yǎng)根長(zhǎng)對(duì)比看出轉(zhuǎn)基因植株根部的抑制程度明顯低于野生型植株。結(jié)果表明AsNAC1基因過(guò)表達(dá)可以通過(guò)提高根部的伸長(zhǎng)和發(fā)育來(lái)提高高鹽脅迫耐受性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR獲得AsNAC1基因全長(zhǎng)，包含ORF序列963 bp，編碼氨基酸320個(gè)。成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301-AsNAC1，并成功轉(zhuǎn)化擬南芥。在擬南芥過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的表現(xiàn)明顯優(yōu)于野生型。初步判斷AsNAC1基因?yàn)槟望}相關(guān)新基因，可提高植物的抗鹽脅迫能力。

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