響應(yīng)曲面法優(yōu)化羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基

秦 鵬，謝 鵬，劉廣宇，梁宏基，梁淑娃， 黃葵英　(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基

秦 鵬，謝 鵬，劉廣宇，梁宏基，梁淑娃*， 黃葵英(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

摘要[目的]優(yōu)化羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，提高該菌發(fā)酵活菌數(shù)。[方法]采用Plackett-Burman以及響應(yīng)曲面法對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究，確定羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中顯著影響發(fā)酵活菌數(shù)的因素，并通過(guò)響應(yīng)曲面法進(jìn)行優(yōu)化，以確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組分。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，所得二次回歸模型達(dá)到極顯著水平，無(wú)失擬因素存在。優(yōu)化后的羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，在此條件下發(fā)酵液活菌數(shù)可以達(dá)到8.25×109 CFU/mL。[結(jié)論]研究證實(shí)了響應(yīng)曲面法可用于優(yōu)化提高羅伊氏乳桿菌發(fā)酵活菌數(shù)，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞羅伊氏乳酸菌；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)曲面法

Optimization of Fermentation Medium ofLactobacillusreuteriby Response Surface Methodology

QIN Peng, XIE Peng, LIU Guang-yu, LIANG Shu-wa*et al

(Guangzhou Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510663)

Abstract[Objective] To increase the viable count of submerged fermentation ofLactobacillusreuteri. [Method] Plackett-Burman design and response surface methodology were used to investigate the fermentation medium ofL.reuteri. Factors significantly affected the viable count ofL.reuteriwere detected in fermentation medium. Optimization was carried out by response surface method. The combination of optimal fermentation medium was detected. [Result] The second-order regression models reached extremely significant level without the lack of fit. The optimized culture medium was 3.09% glucose, 4.19% yeast extract powder and 10.03% fruit and vegetable juice. Under this condition, the viable count of fermentation broth was 8.25×109CFU/mL. [Conclusion] Response surface method is suitable for the enhancement of viable count ofL.reuterifermentation broth, and lays foundation for the industrialized production.

Key wordsLactobacillusreuteri; Plackett-Burman design；Response surface method

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)是普遍存在于人類和大部分動(dòng)物腸道中的益生菌，它可以代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素及類細(xì)菌素等物質(zhì)[1-2]，不僅能夠調(diào)節(jié)胃腸道健康，還具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗癌變及抗衰老等多種功能[3-4]。然而目前，較低的發(fā)酵水平制約了羅伊氏乳桿菌的進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用。

響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，中心組合設(shè)計(jì)(CCD)可用于確定試驗(yàn)因素及其交互作用對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響，精確表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[5]。響應(yīng)面分析法具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精確度高等優(yōu)點(diǎn)，可以研究幾個(gè)因素的交互作用，是降低生產(chǎn)成本、優(yōu)化培養(yǎng)條件的一種有效方法，近年來(lái)逐漸受到重視，并成功運(yùn)用到農(nóng)業(yè)、生物、食品等領(lǐng)域[6]。

筆者使用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中影響發(fā)酵液活菌數(shù)的顯著因子進(jìn)行篩選；然后使用響應(yīng)面分析法，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母粉和果蔬汁3種顯著影響發(fā)酵液活菌數(shù)的因素進(jìn)行優(yōu)化，以提高羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液中的活菌數(shù)，為后續(xù)工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種及原料。供試菌種為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，廣州市微生物研究所保藏；果蔬汁， 北京匯源食品飲料有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：蛋白胨 1.0%，牛肉膏 1.0%，酵母粉0.5%，葡萄糖 2.0%，磷酸氫二鉀 0.2%，檸檬酸氫二銨 0.2%，乙酸鈉 0.5%，硫酸鎂 0.058%，pH 6.2～6.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3.5%，酵母粉2.0%，果蔬汁10.0%，磷酸氫二鉀 0.2%，檸檬酸氫二銨 0.2%，乙酸鈉 1.0%，pH 6.0。

1.2培養(yǎng)方法將羅伊氏乳桿菌凍存保管，接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng) 18～24 h，待活菌數(shù)達(dá) 1×108CFU/mL時(shí)，按 2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng) 24 h 后，使用微生物計(jì)數(shù)方法，對(duì)發(fā)酵液計(jì)數(shù)。

1.3測(cè)定方法及計(jì)算采用稀釋倒平板法，具體原理和步驟參考GB 4789-2010 中乳酸菌菌落總數(shù)的測(cè)定方法[7]。

1.4關(guān)鍵因素篩選試驗(yàn)使用Minitab軟件，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的7個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman組合設(shè)計(jì)。每個(gè)變量設(shè)高低2個(gè)水平，響應(yīng)值為發(fā)酵液活菌數(shù)(Y)，共進(jìn)行12次試驗(yàn)，考察各個(gè)因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)的一級(jí)作用，從中篩選出對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)具有顯著作用的3個(gè)因素。Plackett-Burman設(shè)計(jì)中各個(gè)因素水平及編碼見表1。

1.5培養(yǎng)基優(yōu)化根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的結(jié)果，選取葡萄糖、酵母粉和果蔬汁這3個(gè)因子作為研究對(duì)象，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以發(fā)酵液活菌數(shù)(Y)作為試驗(yàn)的響應(yīng)值，使用Design expert 7.5進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。中心組合試驗(yàn)實(shí)際的因素水平以及編碼見表2 。

2結(jié)果與分析

表1　Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平及編碼

表2　培養(yǎng)基參數(shù)水平編碼

表3　Plackett-Burman試驗(yàn)以及試驗(yàn)結(jié)果

表4　Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析

使用Design expert 7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的編碼方程為Y=6.970+1.354×A+0.915×B-0.272×C-0.005×A×B-0.005×A×C+0.245×B×C-0.619×A2-0.384×B2-0.512×C2。使用Design expert 7.5軟件進(jìn)行尋優(yōu)，得到最優(yōu)化條件為葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，此時(shí)預(yù)測(cè)的響應(yīng)值(發(fā)酵液活菌數(shù))可達(dá)8.25×109CFU/mL。

從以上分析可知，因素B(酵母粉)和C(果蔬汁)的交互作用對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液中的活菌數(shù)影響顯著(P=0.000 4<0.05)。這說(shuō)明在培養(yǎng)基中添加一定量的果蔬汁、酵母粉等富含氨基酸維生素的物質(zhì)，可以促進(jìn)羅伊氏乳桿菌的生長(zhǎng)，這也從側(cè)面說(shuō)明了羅伊氏乳桿菌是異養(yǎng)菌，為使菌體增殖，獲得更高的發(fā)酵活菌數(shù)，必須添加生長(zhǎng)因子；但過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)引起滲透壓升高等不利因素，抑制菌體的增殖，并且造成資源的浪費(fèi)。

表5　中心組合試驗(yàn)及結(jié)果

圖1　酵母粉與果蔬汁的交互作用Fig.1　Interaction between yeast extract powder and the fruit and vegetable juice

圖2　葡萄糖與酵母粉交互作用Fig.2　Interaction between glucose and yeast extract powder

由3組交互作用圖(圖1～3)可以看出，響應(yīng)曲面呈傘形，中心突起，說(shuō)明兩因素之間的影響基本呈拋物線型關(guān)系，均有一個(gè)極大值點(diǎn)，變化趨勢(shì)都是先增大后減小，即存在適宜的葡萄糖、酵母粉和果蔬汁的濃度使羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液中的活菌數(shù)達(dá)到最高。

圖3　葡萄糖與果蔬汁交互作用Fig.3　Interaction between glucose and the fruit and vegetable juice

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)為驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的擬合程度，使用上述優(yōu)化條件在搖瓶水平上進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)：葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、 果蔬汁10.03%，pH 6.0，試驗(yàn)共進(jìn)行3組(詳細(xì)結(jié)果見表6)，平均活菌數(shù)8.28×109CFU/mL，與預(yù)測(cè)值擬合性良好，較優(yōu)化前提高28.40%。

表6　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論

羅伊氏乳桿菌是一種異型發(fā)酵乳酸菌，Doleyres 等分批培養(yǎng)羅伊氏菌獲得生物量為 1.7×109CFU/mL[8]；國(guó)內(nèi)學(xué)者王志林等對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵過(guò)程參數(shù)進(jìn)行了研究?jī)?yōu)化，獲得的細(xì)胞密度達(dá)到了3.1×109CFU/mL[9]。

該研究以羅伊氏乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)為研究對(duì)象，使用Plackett-Burman對(duì)培養(yǎng)基中顯著影響發(fā)酵液活菌數(shù)的因素進(jìn)行快速篩選，然后通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)這些因素進(jìn)行研究，建立了葡萄糖、酵母粉、果蔬汁這三者與活菌數(shù)之間的關(guān)系，并實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。最優(yōu)條件為葡萄糖 3.09%、酵母粉4.19%、果蔬汁10.03%，pH 6.0，發(fā)酵活菌數(shù)預(yù)測(cè)值為8.25×109CFU/mL。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)該試驗(yàn)建立的模型具有實(shí)際指導(dǎo)意義，優(yōu)化后羅伊氏乳桿菌發(fā)酵活菌數(shù)可達(dá)8.28×109CFU/mL，較優(yōu)化前提高28.40%，且與模型預(yù)測(cè)值非常接

近，優(yōu)于Doleyres等、王志林等的結(jié)果，可為羅伊氏乳桿菌發(fā)酵工藝的開發(fā)與優(yōu)化提供研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 王成濤，曹雁平，孫國(guó)寶，等.產(chǎn)類細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其生物學(xué)特性研究[J]．中國(guó)釀造，2008(23)：50-53.

[2] SUSAN F B，CATHERINE G N.Antibiosis revisited：bacteriocins produced by dairy starter cultures[J].Journal of dairy science，1993，76(8)：2366-2379.

[3] 熊濤，宋蘇華，黃濤，等.植物乳桿菌 NCU116 抑菌性能的研究[J]． 食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(6)：97-101.

[4] TUOHY K M，PROBERT H M，SMEJKAL C W，et al． Using probiotics and prebiotics to improve gut health[J]．Drug discovery today，2003，8(15)：692-700.

[5] 韓健，劉朝輝，齊崴，等.β-甘露聚糖酶發(fā)酵液絮凝條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選與響應(yīng)面優(yōu)化[J].生物加工過(guò)程，2007，5(2)：29-34.

[6] 曹小紅，哈志瑞，王春玲，等.響應(yīng)面法對(duì)BcalliusnattoTK-2產(chǎn)聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J ].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008(1)：24-26.

[7] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[8] DOLEYRES Y，BECK P，VOLLENWEIDER S，et al.Production of 3-hydroxypropionaldehyde using a two-step process withLactobacillusreuteri[J].Applied microbiology and biotechnology，2005，68：467-474.

[9] 王志林，陳莊，廖玲，等.豬源羅伊氏乳酸桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及其凍干保護(hù)劑篩選[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(19)：151-153.

中圖分類號(hào)S 188+.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)06-091-03

收稿日期2016-02-14

作者簡(jiǎn)介秦鵬(1983- )，男，山東青島人，工程師，碩士，從事發(fā)酵工程研究。*通訊作者，高級(jí)工程師，從事發(fā)酵工程研究。

基金項(xiàng)目廣東省協(xié)同創(chuàng)新與平臺(tái)環(huán)境建設(shè)專項(xiàng)項(xiàng)目(2015B0404-03004)。