黃連素對實驗性再狹窄模型血管內(nèi)皮功能的影響

張煥鑫，趙金河湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北十堰442000

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黃連素對實驗性再狹窄模型血管內(nèi)皮功能的影響

張煥鑫，趙金河
湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北十堰442000

［摘要］目的：探討黃連素對兔頸動脈球囊損傷后血一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）水平及血管形態(tài)改變的影響，并初步探討其改善血管內(nèi)皮功能的可能機制。方法：將40只日本大耳白兔，隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃連素組和辛伐他汀組，除假手術(shù)組外各組均以球囊導(dǎo)管擴張損傷頸動脈內(nèi)膜，并分別給予生理鹽水、黃連素注射液和辛伐他汀配制液2.5 mg/（kg·d）腹腔注射，假手術(shù)組僅普食喂養(yǎng)。分別于術(shù)后3、7及15天探測各組右頸總動脈直徑，并于耳緣靜脈采血，檢測血清NO含量及血漿ET-1濃度;取15天時的頸動脈切片于光鏡下觀察。結(jié)果：術(shù)后3、7及15天，黃連素組血清NO含量與假手術(shù)組無明顯差異，但顯著高于模型組及辛伐他汀組（P＜0.05）；黃連素組和辛伐他汀組血漿ET-1水平與假手術(shù)組均無明顯差異，但顯著低于模型組（P＜0.05）；術(shù)后15天，黃連素組和辛伐他汀組血管直徑較假手術(shù)組均無明顯差異，但顯著大于模型組（P＜0.05）；黃連素和辛伐他汀組新生內(nèi)膜中的平滑肌細胞較同期模型組明顯減少（P＜0.05），泡沫細胞、纖維結(jié)締組織較少，內(nèi)皮較完整光滑，內(nèi)膜增生較輕。結(jié)論：黃連素可能通過抑制兔頸動脈球囊損傷后NO濃度降低和ET-1水平升高，抑制新生內(nèi)膜增生、改善血管內(nèi)皮功能。

［關(guān)鍵詞］心血管再狹窄；內(nèi)皮功能；黃連素；辛伐他??；一氧化氮；內(nèi)皮素-1；兔；實驗動物

Influence of Berberine on Venous Endothelial Function of Experimental Model of Restenosis

ZHANG Huanxin,ZHAO Jinhe
Cardiovascular Department of Affiliated People′s Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Abstract Objective:To explore the possible mechanism of berberine improving venous endothelial function initially through discussing its influence on the levels of nitric oxide(NO) and endothelin-1 (ET-1) of the rabbits with carotid artery balloon injury.Methods:Forty rabbits were randomly allocated to sham operation group,the model group,berberine group and simvastatin group,except sham operation group,the rabbit models in other groups were prepared by balloon catheter dilation injuring carotid artery intima,and they accepted peritoneal injection of physiological saline,berberine injection and simvastatin preparation solution in the concentrations of 2.5 mg/(kg·d),sham operation group were fed with common food.The diameters of right common carotid artery in different groups were measured in three,seven and 15 days after the operations,and blood was drawn from auricular vein,the contents of NO and the concentrations of ET-1 were detected;carotid artery slice in 15 days after the operation was observed under light microscope.Results:In three,seven and 15 days after the operations,there was no significant difference between the berberine group and sham operation group in the contents of No,but the berberine group was higher than the model group and simvastatin group significantly (P＜0.05);No significant difference was existed in the comparison among the berberine group,simvastatin group and sham operation group in the levels of ET-1,but the berberine group and simvastatin group were lower than the model group remarkably in the levels of ET-1 (P＜0.05);in 15 days after the operation,there was no significant difference in the comparison among the berberine group,simvastatin group and sham operation group in vessel diameter,the berberine group and simvastatin group were larger than the model group in vessel diameter (P＜0.05);smooth muscle cells decreased in new intima in the berberine group and simvastatin group compared with the model group at the same time obviously(P＜0.05),foam cells and fibrous connective tissue were less,endothelium was complete and smooth,endometrial hyperplasia was more light.Conclusion:Berberine could inhibit new endometrial hyperplasia and improve vascular endothelial function by decreasing the concentrations of NO and raising the level of ET-1 after inhibiting rabbit carotid artery balloon injury.

Keywords cardiovascular restenosis;endothelial function;berberine;simvastatin;NO;endothelin-1;rabbits;experimental animals

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty，PTCA)后3～6個月的再狹窄率高達30％～50％［1］，即使行支架植入仍有發(fā)生支架內(nèi)再狹窄的可能。目前對于再狹窄的確切機制尚不十分清楚，但內(nèi)皮功能障礙是其主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物不僅可有效降低膽固醇，還可減輕炎癥反應(yīng)，抑制平滑肌細胞增殖和遷移，改善血管內(nèi)皮功能。相關(guān)研究表明，黃連素不僅具有抗菌作用，還具有降脂作用，并能抑制平滑肌細胞增殖、改善血管內(nèi)皮功能［2-3］。本實驗以辛伐他汀為對照，通過對內(nèi)皮源性血管活性因子一氧化氮(Nitric Oxide，NO)、內(nèi)皮素-1 (Endothelin-1，ET-1)水平及血管形態(tài)的觀測，探討黃連素在改善血管內(nèi)皮功能方面的作用。

1　材料與方法

1.1動物分組選取健康清潔級日本大耳白兔40只(武漢大學(xué)實驗動物中心提供)，體質(zhì)量2.3～2.8 kg，平均(2.6±0.2)kg，雌雄不拘，分籠喂養(yǎng)，自由飲水。1周后隨機分為假手術(shù)組(n=7)、模型組(n=11)、小檗堿組(n=11)和辛伐他汀組(n=11)。

1.2模型復(fù)制與分組處理暴露并游離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，于右頸總動脈近心側(cè)距頸內(nèi)、外動脈分叉4～5 cm處及右頸內(nèi)動脈起始處用動脈夾夾閉，在右頸外動脈遠心側(cè)，距頸內(nèi)、外動脈分叉約1 cm處結(jié)扎。于右頸外動脈結(jié)扎處近端穿一細線備用，并剪一“V”型小口(約為管周1/3)，血管鉤拉起切口，直視下逆行插入球囊導(dǎo)管(強生公司提供，Φ2.5 mm×20 mm)至動脈夾處，連接壓力泵(麥瑞特公司提供)，以5～6 atm擴張球囊，重復(fù)3次，30 s/次，緩慢回拉導(dǎo)管，逐段擴張至切口處，退出球囊，在切口近端結(jié)扎右頸外動脈。假手術(shù)組不行球囊擴張，余步驟同上［4］。術(shù)后肌注青霉素80萬U/d，連續(xù)3天，預(yù)防感染。黃連素組予2.5 mg/(kg·d)黃連素注射液(安徽蚌埠制藥廠，10 mg/支)腹腔注射，辛伐他汀組予2.5mg/(kg·d)辛伐他汀原粉(美國默克公司，批號：FR-047)配制液腹腔注射，模型組腹腔注射等量生理鹽水，假手術(shù)組僅予普通飲食，至術(shù)后15天實驗結(jié)束。實驗過程中模型組與辛伐他汀組因感染、創(chuàng)傷等原因死亡4只。

1.3右頸總動脈直徑超聲檢測各組動物分別在術(shù)后3、7、15天于采血前用全數(shù)字化高分辨力彩色超聲診斷儀Sequioa 512(Acuson公司)探測各組右頸總動脈管腔直徑。

1.4血液采集與生化指標檢測各組動物分別于術(shù)后3、7、15天空腹耳緣靜脈采血4mL，取2mL注入干燥試管，待自凝后，4000r/min離心10分鐘，分離血清；余下2mL注入含有7.5％EDTA·Na230μL和抑肽酶40μL的試管中混勻，4℃3600r/min離心10分鐘，分離血漿。所有血樣均保存于-20℃待測。檢測前室溫下復(fù)融，采用硝酸還原酶法，使用英國CECIL 2041紫外分光光度計檢測血漿NO生成量，試劑盒購于南京建成生物工程研究所；采用放射免疫法，使用上海SN-697全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)器檢測血漿ET-1水平，試劑盒購于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5切片制備及形態(tài)學(xué)觀察術(shù)后15天處死全部家兔，暴露并游離右頸總動脈，取自頸內(nèi)、外動脈分叉以下1 cm處至4～5 cm處約2～3 cm節(jié)段，生理鹽水沖洗后放入10％中性甲醛固定，逐級乙醇脫水，石蠟包埋，間斷均勻切片(每片厚4 μm)，行HE染色，于光鏡下觀察受損血管組織形態(tài)學(xué)改變并照相。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以(±s)表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1頸動脈管腔直徑超聲檢測結(jié)果顯示，術(shù)后3天及7天各組之間比較，管腔直徑無明顯差異(P＞0.05)；至15天時，黃連素組和辛伐他汀組的管腔直徑均顯著大于此時的模型組(P＜0.05)，且均明顯小于3天時的管腔直徑(P＜0.05)，但與假手術(shù)組和7天時比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而模型組較假手術(shù)組及3、7天時的管腔直徑均顯著減小(P＜0.05)；黃連素組與辛伐他汀組比較，在各時間點上均無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1　術(shù)后3、7及15天4組頸動脈管腔直徑比較(±s)　mm

表1　術(shù)后3、7及15天4組頸動脈管腔直徑比較(±s)　mm

注：*表示與15天時模型組比較，P＜0.05;#表示與同組3天時比較，P＜0.05。

組別　只數(shù)　術(shù)后3天　術(shù)后7天　術(shù)后15天假手術(shù)組　7　0.66±0.01　0.65±0.02　0.62±0.02*模型組　9　0.67±0.02*　0.66±0.02*　0.43±0.02黃連素組　11　0.69±0.02　0.66±0.04　0.58±0.03*#辛伐他汀組　9　0.70±0.03　0.67±0.05　0.57±0.02*#

2.2血清NO含量球囊損傷后3、7、15天時，黃連素組血清NO含量與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，且兩者均顯著高于模型組及辛伐他汀組(P＜0.01)；每組在各時間點間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

2.3血漿ET-1濃度球囊損傷后3、7、15天時，假手術(shù)組、黃連素組和辛伐他汀組血漿ET-1濃度明顯低于模型組(P＜0.05)，但黃連素組與辛伐他汀組及假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；每組各時間點間比較，均無明顯差異(P＞0.05)。見表3。

表2　術(shù)后3、7、15天4組血清一氧化氮含量變化(±s)　μmol/L

表2　術(shù)后3、7、15天4組血清一氧化氮含量變化(±s)　μmol/L

注：*表示與模型組比較，P＜0.05;#表示與辛伐他汀組比較，P＜0.05。

組別　只數(shù)　術(shù)后3天　術(shù)后7天　術(shù)后15天假手術(shù)組　7　70.53±8.19*#　71.47±8.33*#　70.21±16.49*#模型組　9　22.92±5.77　26.15±5.69　31.87±13.33黃連素組　11　60.29±6.77*#　63.55±6.43*#　65.20±12.70*#辛伐他汀組　9　33.51±4.12　38.35±4.33　40.15±16.01

表3　術(shù)后3、7、15天4組血漿內(nèi)皮素-1水平變化(±s)　pg/mL

表3　術(shù)后3、7、15天4組血漿內(nèi)皮素-1水平變化(±s)　pg/mL

注：*表示與模型組比較，P＜0.05;#表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05。

組別　只數(shù)　術(shù)后3天　術(shù)后7天　術(shù)后15天假手術(shù)組　7　55.38±7.73*　52.25±7.68*　54.91±10.14*模型組　9　92.39±8.94　93.47±9.12　91.19±15.94黃連素組　11　67.61±7.44*#　61.88±7.33*#　58.39±10.71*#辛伐他汀組　9　67.06±4.58*#　65.38±8.71*#　62.44±13.18*#

2.4組織形態(tài)學(xué)觀察HE染色后，光鏡下可見頸動脈壁分為內(nèi)膜、中膜和外膜，內(nèi)膜和中膜以波浪狀的內(nèi)彈力板為界，中膜和外膜以外彈力板為界。假手術(shù)組頸動脈內(nèi)膜平滑、無增厚，內(nèi)膜下可見扁平狀內(nèi)皮細胞，內(nèi)彈力板完整，平滑肌細胞核呈梭形，見圖1。模型組血管內(nèi)膜增生嚴重，內(nèi)膜修復(fù)不完整，內(nèi)彈力板不連續(xù)，腔內(nèi)面不光滑，可見大量平滑肌細胞由中膜向內(nèi)膜遷移并增生，細胞排列紊亂，并有大量泡沫細胞及纖維結(jié)締組織形成，內(nèi)膜明顯增厚，見圖1。黃連素組和辛伐他汀組新生內(nèi)膜有所增厚，平滑肌細胞增殖、遷移，可見少許泡沫細胞、纖維結(jié)締組織形成，但內(nèi)皮相對完整光滑，見圖1。

圖1　組織病理學(xué)表現(xiàn)

3　討論

近年來，對于血管內(nèi)皮功能的研究一直是血管受損后再狹窄研究中的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞的損傷、動脈彈性以及血清炎性因子可能在亞臨床動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要的協(xié)同作用［5］。血管內(nèi)皮細胞不僅具有屏障的作用，還是一個高度活躍的代謝庫，可起到抗血栓的作用并且可以合成多種血管活性物質(zhì)，影響血管舒縮、凝血、抗凝、血液流動性等多方面的功能，對其起到調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細胞的損傷以及功能異?？梢鸲喾N疾病，是多種疾病的始動環(huán)節(jié)，尤其對于心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展起重要作用［6］。

NO和ET-1是兩種最重要的內(nèi)皮源性血管活性因子，二者作用相反，在維持血管正常結(jié)構(gòu)和功能方面起重要作用。ET-1不僅具有強大的長效縮血管、促血小板和單核巨噬細胞聚集、黏附作用，還是強大的促平滑肌細胞增生因子，能刺激細胞外基質(zhì)的合成。與之相反，NO則是內(nèi)皮合成和分泌的最重要擴血管物質(zhì)之一，能夠抑制平滑肌細胞的有絲分裂及DNA的合成。正常情況下，血管內(nèi)皮細胞通過平衡血管舒張因子(NO)和血管收縮因子(ET-1)的含量來維持正常的內(nèi)皮功能。內(nèi)皮損傷時，血漿ET水平升高和(或)NO水平下降時，兩者比例失衡，可導(dǎo)致血管舒張功能異常［7］。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后3、7、15天，黃連素組和辛伐他汀組的血漿ET-1水平明顯低于模型組，而與假手術(shù)組比較無明顯差異，提示黃連素和辛伐他汀具有抑制ET-1釋放的作用，治療過程中ET-1濃度似有降低趨勢，可能與內(nèi)皮功能逐漸好轉(zhuǎn)或恢復(fù)有關(guān)；黃連素組血清NO濃度顯著高于模型組，而與假手術(shù)組比較無明顯差異，提示黃連素具有抑制NO下降的功能，辛伐他汀組在本實驗中升高NO的作用不明顯，提示辛伐他汀降低ET-1濃度與升高NO水平的作用可能沒有直接關(guān)系。同時，15天時，黃連素組和辛伐他汀組的血管直徑較模型組大，提示黃連素和辛伐他汀可能通過抑制ET-1的釋放和NO的減少，以舒張血管、改善內(nèi)皮功能；較3天時明顯縮小但與7天時比較無顯著差異，可能是由于7～15天時血管的代償性擴張較前加劇，并隨著藥物對內(nèi)皮功能的修復(fù)作用逐漸增強，使得因內(nèi)膜受損導(dǎo)致的局部血管收縮與彈性回縮明顯緩解所致。結(jié)合光鏡下形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，15天時黃連素組和辛伐他汀組新生內(nèi)膜有所增厚，有平滑肌細胞增殖、遷移，可見少許泡沫細胞、纖維結(jié)締組織形成，但內(nèi)皮相對完整光滑，提示黃連素可能通過維持NO/ET-1的相對平衡，抑制平滑肌細胞從中膜向內(nèi)膜增殖、遷移而減輕新生內(nèi)膜的增生和血管的重塑。

以往研究顯示，黃連素可以上調(diào)低密度脂蛋白受體(LDLR)，單獨或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用均可顯著降低總膽固醇、低密度脂蛋白、ApoB和甘油三酯含量，增加高密度脂蛋白的表達水平，可以用于舒緩血脂障礙和降低心血管疾病的危險［3，8］；黃連素還具有抗脂質(zhì)過氧化的作用［9］，故可防止脂質(zhì)在內(nèi)膜沉積，減少和抑制低密度脂蛋白氧化生成氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL作為動脈粥樣硬化形成的重要危險因素之一，可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷和功能障礙，引起NO合成減少，ET-1分泌增加，而內(nèi)皮細胞的損傷及功能改變是動脈粥樣硬化形成的初始改變［10-11］。因此推測，黃連素亦可能通過降脂、抗氧化作用的途徑直接或間接抑制新生內(nèi)膜增生，保護血管內(nèi)皮并維持其功能，但尚需更深入的研究來證實。

綜上所述，兔頸動脈球囊損傷后腹腔注射黃連素，可使血清NO含量升高、血漿ET-1濃度下降，使管腔直徑增加、內(nèi)膜增生程度減輕，提示黃連素保護血管內(nèi)皮功能、抑制新生內(nèi)膜增生和血管重塑的機制可能與其提示黃連素可能通過升高NO濃度和/或降低ET-1水平以維持NO/ET-1的相對平衡有關(guān)，但更長時間的影響尚需進一步探究。同時，冠心病的發(fā)生發(fā)展與一氧化氮合酶/一氧化氮(NOS/NO)的功能異常有密切關(guān)系［12］。因此，探討NOS/NO對內(nèi)皮功能的影響將是我們下一步研究的重點。

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作者簡介：張煥鑫(1978—)，男，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。

收稿日期：2015-07-20

［中圖分類號］R285.5

［文獻標識碼］A

［文章編號］1004-6852(2016)02-0019-04