急性腦梗死患者HMGB1水平動(dòng)態(tài)變化研究

韓亞州　呂壯偉　董家豐

1)河南市沁陽人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科　沁陽　454550　2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三附院檢驗(yàn)科　新鄉(xiāng)　453000　3)河南市沁陽市人民醫(yī)院　沁陽　454550

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急性腦梗死患者HMGB1水平動(dòng)態(tài)變化研究

韓亞州1)呂壯偉2)董家豐3)

1)河南市沁陽人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科沁陽4545502)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三附院檢驗(yàn)科新鄉(xiāng)4530003)河南市沁陽市人民醫(yī)院沁陽454550

【摘要】目的觀察急性腦梗死患者血清HMGB1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化，探討HMGB1在急性腦梗死中的臨床意義。方法60例患者分為實(shí)驗(yàn)組和健康人對(duì)照組，2組分別于發(fā)病1 d、2 d、4 d取空腹靜脈血，分別采用RT-PCR方法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清HMGB1表達(dá)水平的變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組血清HMGB1的表達(dá)水平在測(cè)定時(shí)間內(nèi)持續(xù)升高，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論在急性腦梗死患者中，HMGB1起重要的炎癥因子作用。

【關(guān)鍵詞】急性腦梗死；HMGB1

高遷移率組蛋白Bl(high mobility group box-1，HMGBl)是一種存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白[1]。研究證實(shí)，HMGB1作為一種炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子，是啟動(dòng)和維持炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)的中心分子，與多種腫瘤、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、多器官功能障礙綜合征等發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切，已成為近年危重醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[2]。急性腦梗死是一種復(fù)雜的炎癥過程疾病，是伴腦血管梗死后出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)造成的腦損傷。本文主要研究HMGB1與急性腦梗死的相關(guān)性，以期為急性腦梗死的治療提供理論依據(jù)。

1資料和方法

1.1一般資料選取我院2014-01-2015-01，急性腦梗死住院病人60例，男30例，女30例；年齡50～70歲；對(duì)照組60例，均來至我院健康體檢老年人，與實(shí)驗(yàn)組年齡和性別配對(duì)。2組一般臨床資料無明顯差別(P>0.05)，具有可比性。

1.2主要試劑Trizol試劑、Taq酶，DNA MarkerII,反轉(zhuǎn)錄酶(M．MLv)，所用引物(見表1)均為上海英駿生物公司合成。酶免試劑盒由GIBCO公司提供。

表1　PCR引物序列

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集：采集急性腦梗死患者發(fā)病1 d、2 d、4 d的空腹靜脈血3 mL，普通生化管采集，采集后，3 000 r/min，5 min，-80℃冰箱放置，成批測(cè)定。對(duì)照組方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)血清HMGB1 mRNA水平變化：提取全血細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測(cè)HMGB1的mRNA的表達(dá)的變化。退火溫度是58 ℃。取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上電泳20 min，用uvp成像儀獲取圖像，用相對(duì)灰度值(HMGB1灰度值/GAPDH灰度值)表示樣本HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)。

1.2.3酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清HMGB1蛋白水平變化：采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)HMGB1表達(dá)變化。

2結(jié)果

2.1外周血清HMGB1蛋白表達(dá)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組1 d、2 d、4 d時(shí)血清HMGBl高于正常健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組中患者在發(fā)病l d、2 d、4 d時(shí)間段血清HMGB1表達(dá)水平持續(xù)性升高，各個(gè)時(shí)間段之間數(shù)值比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　外周血清HMGB1表達(dá)水平　

注：2組比較，P<0.05

2.2外周血清HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果RT-PCR檢測(cè)顯示，各組均存在HMGB1條帶648bp，也存在內(nèi)參GAPDH條帶568bp。實(shí)驗(yàn)組1 d、2 d、4 d檢測(cè)的HMGB1 mRNA表達(dá)的水平依次升高。見圖1。利用灰度分析軟件分析，HMGB1在每組中相對(duì)表達(dá)的灰度值依次是健康組的HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)灰度值0.25±0.04,實(shí)驗(yàn)組1 d 、2 d、3 d HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)灰度值分別為0.45±0.07、0.65±0.11、0.87±0.14，各時(shí)間段比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　1 d、2 d、4 d檢測(cè)的HMGB1 mRNA表達(dá)的水平

3討論

實(shí)驗(yàn)證明，急性腦梗死后隨著神經(jīng)元缺血缺氧壞死、炎癥細(xì)胞因子增加、趨化因子上調(diào)等一系列免疫炎癥反應(yīng)，加重腦組織損傷[3-4]。但急性腦梗死的炎性損傷機(jī)制比較復(fù)雜，目前還不明確。HMGB1是高遷移蛋白家族成員之一，在炎癥介質(zhì)中起著重要作用。

文獻(xiàn)[5]報(bào)道，發(fā)現(xiàn)單做酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來測(cè)定急性腦梗死后HMGB1的變化；也有文獻(xiàn)[6]報(bào)道經(jīng)做RT-PCR和流式細(xì)胞技術(shù)的方法來測(cè)定急性腦梗死后HMGB1的免疫學(xué)作用；本實(shí)驗(yàn)分別從HMGB1的mRNA水平和蛋白水平來研究HMGB1在急性腦梗死后的變化。

實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，急性腦梗死后，經(jīng)1 d、2 d、4 d后，外周血中HMGB1的含量依次升高。從而說明HMGB1在急性腦梗死后的病程中起重要作用。為了改善急性腦梗死后的炎癥病程，我們可以HMGB1為靶點(diǎn)進(jìn)行治療，這樣可改善急性腦梗后的炎癥進(jìn)程。

4參考文獻(xiàn)

[1]Yang H,Wang H，Czura CJ,et al．The cytokine activity of HMGBI[J]．J Leukoc Biol，2005,78(1)：1-8．

[2]Scaffidi P，Misteli T，Bianchi ME．Release of chromat protein HMGBI by necrotic cells triggers inflammation[J]．Nature，2002,418(6 894)：191-195.

[3]Bolanle M,Famakin.The Immune Response to Acute Focal Cerebral Ischemia and Associated Post-stroke Immunodepression: A Focused Review[J].Aging Dis,2014,5(5):307-326.

[4]Benakis C,Garcia-Bonilla L,Iadecola C,et al．The role of microglia and myeloid immune cells in acute cerebral ischemia[J].Front Cell Neurosci,2014,8:461.

[5]黃興友.腦梗死患者HMGBl和IL-1水平動(dòng)態(tài)變化研究[J]檢驗(yàn)與臨床,2012,50(20)：64-65.

[6]祁玲,劉強(qiáng).HMGB1在急性腦梗死患者外周血的表達(dá)和免疫學(xué)作用[J]中國免疫學(xué)雜志,2013,29(11)：1 186-1 189.

(收稿2015-10-29)

【中圖分類號(hào)】R743.33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)06-0058-02