通絡(luò)救腦注射液對(duì)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)保護(hù)作用的研究

康　康　冀書(shū)娟　梅海云

河南信陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　信陽(yáng)　464000

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通絡(luò)救腦注射液對(duì)大鼠腦缺血/再灌注神經(jīng)保護(hù)作用的研究

康康冀書(shū)娟梅海云

河南信陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科信陽(yáng)464000

【摘要】目的觀察通絡(luò)救腦注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。方法參照Longa法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、通絡(luò)救腦組。于腦缺血/再灌注24 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，HE染色法檢測(cè)腦組織病理變化，并且檢測(cè)大鼠腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)活性的變化，Western blot檢測(cè)NF-κB的表達(dá)結(jié)果。結(jié)果與模型組相比，通絡(luò)救腦注射液能明顯改善大鼠神經(jīng)行為，減輕腦組織病理改變，降低MDA含量，明顯升高SOD、GSH活性，下調(diào)NF-κB表達(dá)。結(jié)論通絡(luò)救腦對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能為抑制氧化損傷和炎癥。

【關(guān)鍵詞】通絡(luò)救腦；腦缺血再灌注；HE染色；蛋白質(zhì)印跡；神經(jīng)保護(hù)

通絡(luò)救腦注射液具有清熱解毒活血作用，適用于治療缺血性腦病，其處方組成為梔子苷和三七總皂苷[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，通絡(luò)救腦具有改善學(xué)習(xí)記憶[1-3]、保護(hù)血管[4]、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突觸可塑性[5]等廣泛藥理作用，并能透過(guò)血腦屏障，故臨床上可用于防治神經(jīng)障礙、缺血性腦病及老年性癡呆。腦缺血/再灌注時(shí)通常會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，究其原因與氧自由基過(guò)度釋放、炎癥反應(yīng)等緊密相關(guān)[6]。當(dāng)自由基的產(chǎn)生遠(yuǎn)超機(jī)體自身的清除能力時(shí)，會(huì)造成自由基蓄積，損害血管內(nèi)皮、破壞細(xì)胞膜及細(xì)胞器中的不飽和脂肪酸，進(jìn)而損傷神經(jīng)組織。此外中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)度炎癥反應(yīng)除了影響局部血流供應(yīng)，還會(huì)直接破壞組織結(jié)構(gòu)，而腫瘤壞死因子及白介素-6等炎性介質(zhì)的釋放會(huì)進(jìn)一步加重血腦屏障的破壞，從而使缺血損傷放大，加重神經(jīng)功能損傷。本文采用經(jīng)典的線(xiàn)栓法制備腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，研究通絡(luò)救腦對(duì)病理大鼠的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 PF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量282～326 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2006-0008)。

1.2藥物與試劑絡(luò)救腦注射液(天津紅日藥業(yè)有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，谷胱甘肽(GSH)試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供。

1.3儀器溫超速離心機(jī)，電子天平。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥成年健康雄性Wistar大鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組20只。假手術(shù)組：腹腔注射生理鹽水；腦缺血/再灌注模型組：腹腔注射生理鹽水；通絡(luò)救腦注射液組：預(yù)處理14 d，腹腔注射通絡(luò)救腦(50 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)大鼠手術(shù)前1 d禁食禁水。

2.2腦缺血再灌注模型制備 采用Longa法[7]制備局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)，麻醉后仰臥位固定，于頸正中切口，分離皮下組織、肌肉，繼續(xù)分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈后在頸總動(dòng)脈作一切口，插入線(xiàn)栓，向顱內(nèi)方向推進(jìn)約18 mm，此時(shí)大鼠中動(dòng)脈被阻塞并導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎入口處，縫合，2 h后拔出線(xiàn)栓進(jìn)行再灌注。

2.3大鼠行為障礙評(píng)分 按Longa評(píng)分法，分別于術(shù)后24、72 h對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下：0分癥狀最輕，未見(jiàn)明顯異常；1分為腦缺血/再灌注部位對(duì)側(cè)前爪不能完全伸直；2分為實(shí)驗(yàn)大鼠向腦損傷部位對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，屬中度灶性神經(jīng)缺陷；3分為大鼠向腦損傷對(duì)側(cè)傾倒，屬?lài)?yán)重局灶性神經(jīng)缺陷；不能自發(fā)行走，意識(shí)昏迷者記4分[7]。

2.4生化指標(biāo)評(píng)測(cè)待行為學(xué)評(píng)分試驗(yàn)結(jié)束后，每組取8只大鼠，斷頭、取腦，腦組織加適量生理鹽水制成1%的勻漿液，3 500 r/min離心10 min后，取上清液，測(cè)定蛋白濃度，總蛋白含量采用BCA蛋白試劑盒測(cè)定；SOD、GSH和MDA含量按照各自說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5組織病理學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)組分別隨機(jī)選取6只大鼠，斷頭處死后取腦，福爾馬林固定，7 d后脫水、包埋、切片及HE染色。光鏡下觀察腦組織的結(jié)構(gòu)變化[8]。

2.6NF-κB檢測(cè)取腦組織，加4倍裂解液(v/w)制成勻漿，Western blot檢測(cè)含量。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1對(duì)腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)癥狀的影響 腦缺血/再灌注模型組大鼠出現(xiàn)行走時(shí)步態(tài)不穩(wěn)且向左側(cè)傾斜、提尾懸空左前肢內(nèi)收等明顯的神經(jīng)癥狀。術(shù)后48、72 h評(píng)分中，由表1可知，通絡(luò)救腦組與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。通絡(luò)救腦注射液能不同程度地改善腦缺血/再灌注損傷大鼠的行為障礙，對(duì)腦缺血模型大鼠的神經(jīng)功能具有一定的保護(hù)作用。

表1　腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分　±s，n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，△△P<0.01

3.2生化評(píng)價(jià)結(jié)果由圖2可知，模型組大鼠SOD、GSH活性均比假手術(shù)組大鼠明顯降低，MDA含量卻升高。通絡(luò)救腦組能明顯提高SOD、GSH活性，降低MDA含量，說(shuō)明藥物可以在一定程度上降低腦缺血/再灌注模型大鼠的氧化損傷。

表2　通絡(luò)救腦注射液對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠血清中

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與假手術(shù)組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3.3HE染色結(jié)果在光鏡下觀察可見(jiàn)假手術(shù)組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)豐富，神經(jīng)細(xì)胞外形規(guī)則、排列整齊，核仁清晰可見(jiàn)。模型組缺血側(cè)神經(jīng)細(xì)胞變性，周?chē)g隙增寬，部分結(jié)構(gòu)不清，胞體縮小。與模型組相比，通絡(luò)救腦能明顯減輕上述病理改變，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變減輕，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　HE染色結(jié)果(×400)　A假手術(shù)組　B模型組　C通絡(luò)救腦組

3.4Western blot檢測(cè)結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠NF-κB的表達(dá)(0.964±0.23)高于假手術(shù)組(0.716±0.15)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而通絡(luò)救腦組大鼠NF-κB的表達(dá)(0.864±0.18)低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2　通絡(luò)救腦對(duì)腦缺血再灌注大鼠NF-κB 表達(dá)的影響

4討論

腦組織對(duì)缺氧高度敏感，腦缺血再灌注時(shí)，缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死，造成蛋白水解酶及活性氧(ROS)等物質(zhì)釋放，從而引發(fā)局部炎癥反應(yīng)[8]。此外，氧化應(yīng)激會(huì)造成缺血后的神經(jīng)元損傷，加速脂質(zhì)過(guò)氧化，從而改變腦內(nèi)的抗氧化體系。MDA是氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)后的代謝物，反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，其含量高低能說(shuō)明機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度；SOD、GSH則為自由基清除劑，能夠清除自由基，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，其活性越高，說(shuō)明機(jī)體清除自由基能力越強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在腦缺血/再灌注后，神經(jīng)功能會(huì)出現(xiàn)不同程度損傷，甚至有腦梗死出現(xiàn)，而通絡(luò)救腦注射液能降低神經(jīng)功能障礙的發(fā)生率、改善大鼠皮層神經(jīng)元核固縮、減輕運(yùn)動(dòng)障礙；此外，通絡(luò)救腦注射液能提高SOD、GSH活性，降低MDA含量。本實(shí)驗(yàn)觀察到通絡(luò)救腦注射液通過(guò)抗氧化作用從而減少氧化損傷和神經(jīng)元缺失，說(shuō)明其具有神經(jīng)保護(hù)作用。

有研究表明，腦缺血時(shí)NF-κB活化，加速細(xì)胞死亡、加速炎癥反應(yīng)，采用降低其活性的措施則會(huì)縮小腦梗死體積[9]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠在腦缺血再灌注初期時(shí)，新皮質(zhì)NF-κB活性已升高，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)快速升高，NF-κB的活化又進(jìn)一步增大了腦梗死體積。采用通絡(luò)救腦注射液后，能降低NF-κB活性，從而對(duì)腦缺血再灌注起到保護(hù)作用。

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(收稿2015-04-20)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R743

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673-5110(2016)05-0057-03