杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4的獲得及其生物信息學(xué)分析

康　爽,　賀紅霞,　王　銘,　郭　嘉,　薛　晶

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118；

2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130033

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杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4的獲得及其生物信息學(xué)分析

康爽1,2,賀紅霞2*,王銘1*,郭嘉2,薛晶1

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118；

2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)春 130033

摘要：果樹(shù)通過(guò)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖進(jìn)入果實(shí)細(xì)胞中，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率直接影響著果實(shí)的糖含量和果實(shí)的品質(zhì)。利用RT-PCR方法，從吉農(nóng)紅杏中獲得蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4，測(cè)序結(jié)果表明序列全長(zhǎng)2 480 bp，其中完整開(kāi)放閱讀框1 500 bp，編碼499個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)分子量為53.58 kDa，等電點(diǎn)為9.31。相似性及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),所得蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與薔薇科李屬植物中同類蛋白序列相似性很高，推測(cè)其功能也具有保守性。對(duì)其表達(dá)分析結(jié)果顯示PaSUC4在杏樹(shù)各部位中的表達(dá)具有組織特異性，其中成熟葉片中表達(dá)量最高，雌蕊中表達(dá)量最低。為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能，構(gòu)建了適合植物遺傳轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體并進(jìn)行了煙草遺傳轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果為普通杏優(yōu)良品種培育提供了參考。

關(guān)鍵詞：杏；蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；生物信息學(xué)

杏是薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)杏屬(Armeniaca)植物，其果肉、果仁均可食用。它原產(chǎn)于中國(guó)，野生種和栽培品種資源都非常豐富。杏屬植物在全世界共有10個(gè)種，除法國(guó)杏(Prunusbrigantiaca)外其他9個(gè)種均原產(chǎn)于我國(guó)，分別為普通杏、西伯利亞杏、遼杏、紫杏、志丹杏、政和杏、李梅杏、藏杏、梅。栽培品種近3 000個(gè)，普通杏種(P.armeniacavulgaris)分布最廣[1~3]。

果實(shí)品質(zhì)的形成和改良直接影響著果樹(shù)行業(yè)的發(fā)展，因此，果實(shí)的品質(zhì)是果樹(shù)研究領(lǐng)域中最重要的課題之一。果實(shí)的糖分積累是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素[4]。在果實(shí)中，糖分常以果糖、葡萄糖和蔗糖這三種形式存在。由于蔗糖是由一分子果糖和一分子葡萄糖組成的雙糖，相對(duì)于果糖和葡萄糖等碳形式可以運(yùn)輸大量的碳，性質(zhì)穩(wěn)定且滲透勢(shì)高，所以蔗糖是幾乎所有果樹(shù)長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)碳的主要形式，也是光合產(chǎn)物的主要形態(tài)[5,6]。蔗糖不僅可以通過(guò)韌皮部長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)中積累糖分，提高果實(shí)糖含量，還可以長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)焦麡?shù)其他部位，提供營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)所需的能量。而蔗糖的主要運(yùn)輸途徑是質(zhì)外體途徑[7]，在質(zhì)外體途徑中蔗糖需要進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，所以在完成蔗糖韌皮部裝載和卸載的過(guò)程中，需要一種存在于質(zhì)膜上的載體蛋白的幫助，該載體蛋白利用ATP在質(zhì)膜H+/ATPase所建立的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)作用下產(chǎn)生跨膜質(zhì)子梯度，使蔗糖與H+以1∶1的比例跨膜共轉(zhuǎn)運(yùn)。這種載體蛋白叫做蔗糖-質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也叫做蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose transporter, SUT)[8~10]。

蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT)屬于MFS超家族(major facilitator super family)中的一員，是存在于質(zhì)膜上的一類高疏水性蛋白，幫助蔗糖等碳水化合物進(jìn)行跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)，含有12個(gè)保守的跨膜結(jié)構(gòu)域，其中間有一個(gè)大的面向細(xì)胞質(zhì)的胞質(zhì)環(huán)，將該蛋白劃分為各含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的2個(gè)半?yún)^(qū)，即前半?yún)^(qū)和后半?yún)^(qū)[11]。該跨膜結(jié)構(gòu)域高度保守，只有N端和C端為高變異區(qū)，最保守的跨膜區(qū)域?yàn)榈?、2和第11跨膜區(qū)，因此不同植物中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都存在相似的結(jié)構(gòu)域[12]。

杏樹(shù)具有突出的抗旱性和耐寒性，杏產(chǎn)品具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景，由此可見(jiàn)杏在我國(guó)民眾生活和園藝產(chǎn)業(yè)中占據(jù)非常重要的地位，雖然在杏資源評(píng)價(jià)、研究和利用方面做了大量工作并取得了很大進(jìn)展[13]，但在杏育種及優(yōu)質(zhì)基因功能挖掘方面的研究甚少，與國(guó)外相比差距很大，因此挖掘杏中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白新基因并闡明其生物功能對(duì)研究杏果實(shí)形成及抗旱耐寒等機(jī)理都具有重要意義[14]，本工作所選取的“吉農(nóng)紅杏”具有果大整齊、質(zhì)優(yōu)豐產(chǎn)、抗寒性強(qiáng)及早熟等優(yōu)點(diǎn)[15],本研究試圖從中獲得蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析和功能鑒定，以期為杏的品質(zhì)育種和生理機(jī)制挖掘提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料

吉農(nóng)紅杏屬于杏屬普通杏種(Prunusarmeniaca),由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院王銘教授提供，采于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)果園，在結(jié)果期取成熟葉片，用于總RNA的提取并進(jìn)行基因克隆?；虮磉_(dá)分析材料取自花期、展葉期和座果期。

1.2菌株、試劑和質(zhì)粒

總RNA提取試劑盒、LATaq酶和rTaq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ROCHE公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司，克隆載體pEASY-T1 Simple和熒光定量試劑盒TransScript Green Two-step qRT-PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，植物表達(dá)載體pCAM-UPN為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明專利載體。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)將NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已注冊(cè)的日本杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列和其他李亞科果樹(shù)中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性高的保守區(qū)作為模板，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，最后通過(guò)BLAST比對(duì)引物特異性，篩選出高成功率的引物PaS4(1)和PaS4(2)，根據(jù)所得序列拼接后的序列設(shè)計(jì)PaS4(3)引物，亞克隆引物根據(jù)PaSUC4基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)，為便于構(gòu)建載體在PaS4(4)的上、下游引物上分別添加了BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)。熒光定量引物利用Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線設(shè)計(jì)，所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列信息及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

1.3.2杏總RNA的獲得選取杏結(jié)果期成熟葉片100 mg，參照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)提取杏總RNA，利用NanoDrop 2000(Pittsburgh, USA)測(cè)定所提取RNA的濃度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，確定總RNA的完整性且無(wú)降解后于-80℃保存?zhèn)溆?。用Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit(ROCHE公司)將杏總RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄成第一鏈的cDNA來(lái)擴(kuò)增目的基因(參考ROCHE試劑盒說(shuō)明書(shū))。

1.3.3RT-PCR克隆與序列分析以杏總RNA反轉(zhuǎn)錄成的第一鏈cDNA為模板，分別用3組引物(RT-PCR引物見(jiàn)表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，用PaS4(1)引物和PaS4(2)兩組引物分別擴(kuò)增得到與預(yù)期片段大小一致的特異性產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物后連接入克隆載體pEASY-T1 Simple，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆測(cè)序，兩組重組質(zhì)粒分別命名為：pEASY-T1-X1XY1 4-1和pEASY-T1-X1XY1 E9。將兩組質(zhì)粒DNA混合作為PCR模板，用第3組引物擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，然后連接到克隆載體pEASY-T1 Simple上，所得重組質(zhì)粒命名為pEASY-T1-PaSUC4，經(jīng)菌落PCR鑒定后將符合條件的陽(yáng)性克隆送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.4杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4的表達(dá)分析用1 μg的不同組織(幼果、新葉、成熟葉、雌蕊、花瓣、新梢)提取的總RNA為模版，參照TransScript Green Two-step qRT-PCR SuperMix Kit操作步驟合成cDNA，稀釋5倍后作為模板,采用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)PaSUC4表達(dá)水平,以杏的管家基因actin為內(nèi)參。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增在熒光定量PCR儀(ABI7900)上完成，反應(yīng)總體積為20 μL，所用引物及反應(yīng)條件如表1所示，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法[16]。

1.3.5杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4的生物信息學(xué)分析序列拼接結(jié)果在瑞士生物信息學(xué)研究所網(wǎng)站(http:/us.expasy.org/)用Translate軟件預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列，用ProtScale軟件對(duì)編碼蛋白疏水性進(jìn)行分析，用ProtParam對(duì)編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量進(jìn)行預(yù)測(cè), 用在線工具TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)PaSUC4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；用TargetP1.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進(jìn)行跨膜區(qū)域的信號(hào)肽分析，采用PSORT II蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位服務(wù)器(http://psort.hgc.jp/form.html)定位[17,18]。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)PaSUC4蛋白進(jìn)行Blastp序列比對(duì)，將得到來(lái)源于不同植物的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列，利用BioEdit軟件中的ClustalW和MEGA6.0軟件進(jìn)行比對(duì)和聚類分析，采用鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[19~21]。

1.3.6植物表達(dá)載體的構(gòu)建將所得的PaSUC4基因進(jìn)行亞克隆，在擴(kuò)增引物上、下游分別填加BamHⅠ和SpeⅠ位點(diǎn)，經(jīng)測(cè)序分析后將準(zhǔn)確無(wú)誤的目的基因插入到植物表達(dá)載體pCAM-UPN中，得到重組載體pCAM-UPN-PaSUC4(圖1)，利用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105中(自制)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化模式植物煙草進(jìn)行功能驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1杏總RNA的獲得和PaSUC4全長(zhǎng)序列的獲得

從吉農(nóng)紅杏成熟葉片中提取的杏總RNA取3 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，圖2中可以看出所提取RNA的28S和18S條帶清楚，未發(fā)生降解,說(shuō)明提取RNA的完整性，可以用來(lái)擴(kuò)增目的基因。

圖1　pCAM-UPN-PaSUC4載體圖譜Fig.1　The construct map of pCAM-UPN-PaSUC4.

圖2　杏莖總RNA提取Fig.2　Total RNA isolated from apricot stem.注：M: DL10 000分子量標(biāo)準(zhǔn), 泳道1~4:從杏樹(shù)樣本1~4的莖提取的總RNA

為了檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄成第一鏈的cDNA，用內(nèi)參actin引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果證明cDNA反轉(zhuǎn)錄效果很好,沒(méi)有基因組DNA的污染(圖3)。

pEASY-T1-4-1和pEASY-T1-E9測(cè)序結(jié)果表明，這兩組陽(yáng)性克隆為杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)序列的一部分，前者缺少起始子，后者缺少終止子。以上述兩種質(zhì)粒DNA為混合模板進(jìn)行擴(kuò)增，所得的pEASY-T1-PaSUC4的測(cè)序結(jié)果表明：獲得了含有杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因全序列2 480 bp,其中開(kāi)放閱讀框(ORF)為1 500 bp，預(yù)測(cè)編碼499個(gè)氨基酸的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將其命名為PaSUC4，GenBank登記序列號(hào)為KT223003。與梅中的PmSUC4(XP_008219162)有98%的同源性。

圖3　cDNA內(nèi)參actin的PCR擴(kuò)增Fig.3　PCR amplification of actin.注： M:100 bp分子量標(biāo)準(zhǔn)，1:陰性對(duì)照，2:RNA，3:cDNA

圖4　PaSUC4基因PCR擴(kuò)增Fig.4　PCR amplification of PaSUC4.注：M:DL10 000，1:PaSUC4，2:陰性對(duì)照

2.2PaSUC4基因編碼蛋白的理化性質(zhì)

PaSUC4基因所編碼的蛋白質(zhì)由499個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為9.33，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為53.58 kDa。根據(jù)CDS(conserved domain search)分析發(fā)現(xiàn)，它具有典型的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域，屬于GPH_Sucrose即Sucrose/H+Symporter。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PaSUC4含有一個(gè)由168個(gè)氨基酸(26~193)組成的MFS功能域，一個(gè)373氨基酸組成的MFS-2結(jié)構(gòu)域(50~422)。信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽17.8%、線粒體靶向肽32.1%、分泌通路信號(hào)肽0.6%、其他定位60.8%，推測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，存在跨膜區(qū)域[17]，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該蛋白定位于葉綠體類囊體膜、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體的可能性分別是61.7%、60%、51.9%和40%[18,21]。應(yīng)用在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)PaSUC4蛋白含有12次跨膜區(qū)(圖5)。

圖5　杏PaSUC4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5　The prediction of trans-membrane structure of PaSUC4.

2.3PaSUC4基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將PaSUC4基因編碼的蛋白序列在NCBI-BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，選取31種相似度大于70%的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用ClustalW進(jìn)行多序列聚類分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)。

結(jié)果表明：PaSUC4與其他序列氨基酸同源性非常高，與梅(Prunusmume)的PmSUC4和碧桃(Prunuspersica)的PpSUC4同源性最高，分別為98.6%和97.8%，與薔薇科野草莓的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FvSUC4的同源性為79.2%。在草莓中的研究表明蔗糖是一個(gè)調(diào)控果實(shí)成熟的重要信號(hào)，其中栽培草莓的FaSUT1過(guò)表達(dá)引起蔗糖和ABA含量增加從而加速果實(shí)成熟[22]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分支，PaSUC4與薔薇科李屬的相關(guān)樹(shù)種中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源性較高，其功能也必定具有相似性。

2.4不同組織中PaSUC4的表達(dá)量分析

熒光定量qRT-PCR結(jié)果如圖7顯示，PaSUC4在杏樹(shù)的幼果、新葉、成熟葉、花瓣和新梢中均有表達(dá)，雌蕊中表達(dá)量很少，表達(dá)水平具有組織特異性。在成熟葉(源組織)中表達(dá)量最高，花瓣、新梢、幼果、新葉中表達(dá)量依次減少，雌蕊中表達(dá)量最低。這說(shuō)明PaSUC4基因在源組織中發(fā)揮著重要作用，主要負(fù)責(zé)從源到庫(kù)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.5PaSUC4基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

為了驗(yàn)證所克隆的PaSUC4基因功能，利用酶切連接的方法將目的基因插入pCAM-UPN中，得到重組的pCAM-UPN-PaSUC4。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化本生煙草，經(jīng)過(guò)除草劑雙丙胺磷篩選，得到抗性植株3批共30株，經(jīng)PCR檢測(cè)有6株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗(圖8A)。進(jìn)一步利用提取陽(yáng)性煙草葉片總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)PaSUC4是否轉(zhuǎn)錄(TEF作為內(nèi)參對(duì)照)，從中共檢出PaSUC4陽(yáng)性植株4株。圖8B結(jié)果顯示1、2、3、5號(hào)植株為PaSUC4表達(dá)植株，證明目的基因已經(jīng)在受體植物中表達(dá)，為后續(xù)基因的生物功能鑒定工作提供了重要實(shí)驗(yàn)材料。

圖6　吉農(nóng)紅杏蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PaSUC4系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.6　Phylogenetic tree of homolog sucrose transporters of PaSUC4.注：所選的SUTs的蛋白序列經(jīng)過(guò)ClustalW比對(duì)，利用相鄰連接(Neighbor-joining，NJ)分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(MEGA6.0.6)。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)所選用的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白登錄號(hào)(NCBI)如下：圖標(biāo)長(zhǎng)度代表0.05個(gè)氨基酸差別?？s寫(物種來(lái)源)：序列號(hào)：PaSUC4(杏)：KT223003；PmSUC4(梅)：XP_008219162.1；PpSUC4(碧桃)：XP_007223388.1；PbSUC4-like(白梨)：XP_009335489.1；MdSUC4(蘋果)：XP_008339011.1；FvSUC4(草莓)：XP_011464770.1；DgSUT4(北美假大麻)：CAG70682.1；CmSUT4(甜瓜)：NP_001284446.1；EgSUC4(巨桉)：XP_010060140.1；ThSUC4-like(醉蝶花)：XP_01055367.1.1；BnSUC4(歐洲油菜)：XP_013698453.1；PeSUC4(胡楊)：XP_011016949.1；JcSUC4-like(麻風(fēng)樹(shù))：XP_012068110.1；HbSUT4(橡膠樹(shù))：ABK60191.1；MeSUT4(木薯)：ABA08443.1；TcSUT4(可可)：XP_007018362.1；GaSUC4-like(木本棉)：KHG28870.1；CsSUC4(甜橙)：XP_006472375.1；PsSUF4(豌豆)：AFS33111.1；MtSUT2(苜蓿)：XP_013462077.1；GmSUC4(黃豆)：XP_003523764.1；VrSUC4-like(綠豆)：XP_014521848.1；PvSUC4(菜豆)：XP_007141313.1；LjSUT4(百脈根)：CAD61275.1；CcSUC-like(中果咖啡)：CDP00966.1；CaSUC4(鷹嘴豆)：XP_004490500.1；SlSUT4(番茄)：NP_001234344.1；StSUT4(馬鈴薯)：NP_001275070.1； NtSUT4(煙草)：BAI60050.1；VvSUC-like(葡萄)：XP_010664062.1；NnSUC4(荷花)：XP_010271544.1；BvSUC4(甜菜)：XP_010695439.1

3討論

絕大多數(shù)果樹(shù)的光合產(chǎn)物為蔗糖，并以蔗糖為主要形式，通過(guò)質(zhì)膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白經(jīng)韌皮部卸載到發(fā)育的果實(shí)內(nèi)，進(jìn)行代謝和糖分的積累[23]。柴葉茂等[24]在對(duì)草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析研究中發(fā)現(xiàn)，草莓的成熟只需要短短的一個(gè)月時(shí)間，在這期間果實(shí)需要完成褪綠和著色過(guò)程，曾出現(xiàn)兩次蔗糖含量的高峰，兩次的高峰都與蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高水平表達(dá)相關(guān)，說(shuō)明草莓的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)會(huì)影響果實(shí)的成熟進(jìn)程[24]。在葡萄中共發(fā)現(xiàn)4種蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列：VvSUT1[25]、VvSUC11、VvSUC12、VvSUC27[26]，它們均在果實(shí)中表達(dá)，且具有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的功能。其中VvSUC11屬于SUT4亞群，VvSUC12屬于SUT2亞群[27]。Chun等[28]研究不同糖對(duì)柑橘蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CitSUT1和CitSUT1的表達(dá)影響，其結(jié)果表明CitSUT2的表達(dá)不受外源糖的影響，且在庫(kù)中表達(dá)；而CitSUT1在源葉中表達(dá)，被外源的蔗糖、葡萄糖、甘露糖和2-脫氧葡萄糖所抑制。彭昌操[29]從新紅星果實(shí)cDNA文庫(kù)中克隆到蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdSUT1，并研究發(fā)現(xiàn)，MdSUT1不僅在蘋果果實(shí)中表達(dá)，同樣也在花瓣、枝條皮層、葉片、種子中表達(dá)。隨果實(shí)的發(fā)育，MdSUT1的表達(dá)在花后60 d和花后110 d達(dá)到高峰，而在花后30 d和花后80 d則表達(dá)量下降。

圖7　吉農(nóng)紅杏不同組織中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4的相對(duì)表達(dá)量Fig.7　Relative expression level of PaSUC4 in different apricot tissues.

圖8　轉(zhuǎn)PaSUC4煙草植株的RT-PCR檢測(cè)Fig.8　RT-PCR amplification of PaSUC4 transgenic tobacco plants.注：A. M：DL2000, -:水對(duì)照，+:陽(yáng)性質(zhì)粒DNA，1~6:轉(zhuǎn)基因植株， WT:野生型煙草；B. M:DL1000, -:水對(duì)照，+:陽(yáng)性質(zhì)粒DNA，1~6:轉(zhuǎn)基因煙草，WT:野生型煙草

在蘋果、櫻桃、桃和梨等薔薇科木本果樹(shù)中，其光合產(chǎn)物山梨醇雖然作為韌皮部主要運(yùn)輸形態(tài)[29, 30]，但是其果實(shí)內(nèi)的蔗糖含量仍然不可忽略。如在成熟期的桃葉片中，山梨醇∶蔗糖(w/w)為1.3∶1~4.2∶1，在蘋果韌皮部中為3∶1[31]。蔗糖的含量雖低于山梨醇的含量，但是依然占據(jù)相當(dāng)?shù)谋壤?/p>

目前已經(jīng)在草莓、梨、蘋果、葡萄和柑橘等果樹(shù)中發(fā)現(xiàn)并獲得了相關(guān)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而且蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅在蔗糖的長(zhǎng)距離運(yùn)輸上起重要作用，也影響著光合作用同化的碳水化合物的分配，與果實(shí)品質(zhì)有直接關(guān)系。因此發(fā)現(xiàn)并獲得果樹(shù)新的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，并對(duì)其進(jìn)行深度的功能分析，對(duì)提高果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)有很大幫助。本實(shí)驗(yàn)獲得了杏的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PaSUC4，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)和表達(dá)分析，證明該基因符合MFS超家族的高度保守特點(diǎn)，是MFS超家族中的一員，具有組織表達(dá)特異性。

參考文獻(xiàn)

[1]呂增仁. 試論我國(guó)杏品種改良的方向與途徑[J].河北果樹(shù), 2002, 3:1-3.

[2]趙宏勇, 趙 鋒.我國(guó)杏資源及遺傳育種研究進(jìn)展[J].北方果樹(shù), 2008, 2:1-3.

[3]趙海娟，劉威生，劉 寧,等. 普通杏(Prunusarmeniaca)種質(zhì)資源數(shù)量形狀的遺傳多樣性分析[J].果樹(shù)學(xué)報(bào), 2014, 31(1):20-29.

[4]趙智慧, 周俊義.果樹(shù)果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)形成及評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 25(S):111-114.

[5]張立軍,李曉宇,阮燕曄,等.雙子葉與單子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(3):259-264.

[6]白雪梅,張立軍,吳曉丹,等.植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6):1195-1202.

[7]吳 楚,朱能斌.植物中糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其生理功能[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,24(4):294-301.

[8]Barth I, Meyer S, Sauer N. PmSUC3: characterization of a SUT2/SUC3-type sucrose transporter fromPlantagomajor[J]. Plant Cell,2003,15(6):1375-85.

[9]戚繼艷,陽(yáng)江華,唐朝榮,等.植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因與功能[J].植物學(xué)通報(bào),2007,24(4):532-543.

[10]Kühn C, Barker L, Bürkle L,etal.. Update on sucrose transport in higher plants[J]. J. Exp. Bot., 1999, 50(335):935-953.

[11]彭昌操，趙小蘭. 植物體內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能和調(diào)控[J].植物生理學(xué)通訊，2010，46(4):317-323.

[12]王利芬, 張虎平, 張紹鈴.植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其功能調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J].植物研究, 2012, 32(4):501-507.

[13]張艷敏，何天明，馮建榮,等.杏種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、創(chuàng)新與利用研究新進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)，2009，36(5):755-762.

[14]劉曉華，丁寧，牛洪斌,等.桃蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆及序列分析[J].園藝學(xué)報(bào), 2012，39(S):2596.

[15]郭連柱，賀喜春，孫玉書(shū). “吉農(nóng)紅杏“新品種[J].北方園藝，1991，2(S):49.

[16]唐永凱，賈永義.熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法的探討[J].生物技術(shù)，2008，18(3):89-91.

[17]Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G.etal.. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP, and related tools[J]. Nat. Protocols, 2007, 4(2):953-971.

[18]賀紅霞，陳 亮，康 爽,等.玉米ZmSUT4-J基因的克隆與植物表達(dá)載體構(gòu)建[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，40(3):18-22,72.

[19]李俊，王學(xué)敏，董 潔,等.東方山羊豆蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建[J].中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2011，33(3):39-46.

[20]李浩戈，劉曉宇，郭致富,等.ZmG1基因在玉米小穗發(fā)育中作用的初步探析[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,3:1-6.

[21]閆 倩，閆苗章，王保莉,等.梭菌氫酶基因部分片段的同源克隆及敲除載體的構(gòu)建[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21(7):61-66.

[22]Jia H F, Wang Y H, Sun M Z,etal.. Sucrose functions as a signal involved in the regulation of strawberry fruit development and ripening[J]. New Phytol., 2013, 198:453-465.

[23]陳發(fā)興, 祁芳斌. 薔薇科果樹(shù)果實(shí)糖的形成與調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展[J].福建果樹(shù),2009,4: 46-51.

[24]柴葉茂, 賈海鋒, 李春麗,等.草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(4): 637-643.

[25]Ageorges A, Issaly N, Picaud S,etal.. Identification and functional expression in yeast of a grape berry sucrose carrier[J]. Plant Physiol. Biochem., 2000, 38: 177-185.

[26]于 菲, 盧 江, 張雅麗. 葡萄中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的序列分析及功能推測(cè)[J].生物信息學(xué), 2011, 9(1):35-38.

[27]Chun Y L, Jian X, Weiss D,etal.. Sugars regulate sucrose transporter gene expression in citrus[J]. Biochem. Biophys. Res. Commun.,2003,306(2): 402-407.

[28]彭昌操. 蘋果蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdSUT1克隆及其互作因子篩選[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 博士學(xué)位論文， 2006.

[29]陳俊偉, 張上隆, 張良誠(chéng).果實(shí)中糖的運(yùn)輸、代謝與積累及其調(diào)控[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 30(1):1-10.

[30]王永章, 蔣家慧, 李培環(huán),等.肉質(zhì)果實(shí)碳水化合物代謝及調(diào)控研究進(jìn)展[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 18(4):288-296.

[31]李嘉瑞, 馬鋒旺.薔薇科果樹(shù)山梨醇的研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào), 1991, 8(2):111-115.

The Acquisition and Bioinformatic Analysis of Sucrose Transporter Protein GenePaSUC4 from Apricot

KANG Shuang1,2, HE Hong-xia2*, WANG Ming1*, GUO Jia2, XUE Jing1

1.CollegeofHorticulture,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;

2.JilinProvincialKeyLaboratoryofAgriculturalBiotechnology,InstituteofAgriculturalBiotechnology,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Changchun130033,China;

Abstract:Sucrose is transported into fruit cells by sucrose transporters in fruit trees. The transport efficiency of sucrose transporters affects the sugar content and quality of fruits. Reverse transcript PCR technology was used in this study. Prunus armeniaca sucrose transport protein gene SUC4 (PaSUC4) was obtained from Jinong red apricot. The full cDNA was 2 480 bp according to the sequencing result. The codon region was 1 500 bp, encoding 499 amino acids. The protein molecular weight was 53.58 kDa, the soelectric point was 9.31. Results of similarity and phylogenetic analysis showed that the sucrose transporters we got had high similarity with that in Prunus (Rosaceae), speculating the function was also conserved. The expression level of PaSUC4 was highest in mature leaves and lowest in pistils. The characteristics of predicted protein had been analyzed by bioinformatics software. For further verification of the gene biological function, the expression vector had been constructed and transformed into tobacco plants. The research results was expected to provide reference for apricot breeding.

Key words:apricot; sucrose transporter protein gene; bioinformatics

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.05

作者簡(jiǎn)介：康爽，碩士研究生，主要從事果樹(shù)生物技術(shù)與功能基因挖掘研究。E-mail:kangshuang0000@sina.com。*通信作者：賀紅霞，副研究員，主要從事植物功能基因挖掘與生物技術(shù)研究。E-mail：hehx35@cjaas.com；王銘，教授，主要從事果樹(shù)育種研究。E-mail:wmingaa@sina.com

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130102043JC)資助。

收稿日期：2015-11-30; 接受日期：2016-01-04