黑曲霉降解人參皂苷Rb1制備稀有皂苷Compound K

高　娟,　周安東,　原　野,　趙天蛟

1.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長春130024;

2.東北師范大學(xué)附屬中學(xué), 長春 130024

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黑曲霉降解人參皂苷Rb1制備稀有皂苷Compound K

高娟1,周安東2,原野1,趙天蛟1

1.東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長春130024;

2.東北師范大學(xué)附屬中學(xué), 長春 130024

摘要：稀有人參皂苷Compound K(C-K)具有顯著的生物學(xué)活性。從東北農(nóng)耕土壤中分離出9株真菌，系統(tǒng)研究了其轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備C-K的能力。其中，黑曲霉Aspergillus niger sp. J7能夠高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成C-K，轉(zhuǎn)化途徑為Rb1→Rd→F2→C-K。對黑曲霉J7轉(zhuǎn)化Rb1制備C-K的條件進行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，Rb1可完全轉(zhuǎn)化成C-K。將該轉(zhuǎn)化體系擴大到200 mL，60 h內(nèi)可將Rb1完全轉(zhuǎn)化成C-K，轉(zhuǎn)化率為74.7%。黑曲霉J7為人參皂苷Rb1高效水解為稀有人參皂苷C-K奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人參皂苷；黑曲霉；生物轉(zhuǎn)化；β-葡萄糖苷酶

人參皂苷是人參的主要活性成分之一。藥理學(xué)研究表明一些稀有人參皂苷如Compound K(C-K)具有顯著的抗腫瘤活性[1~4]。然而，人參皂苷C-K在天然人參中并不存在，這限制了C-K的臨床應(yīng)用。因此，如何制備稀有人參皂苷C-K成為目前研究的熱點。對比人參皂苷的結(jié)構(gòu)可知，稀有人參皂苷C-K與其他高含量的人參皂苷，如Rb1相比，其皂苷元結(jié)構(gòu)相同，只是側(cè)鏈上糖基的數(shù)目和種類不同[5]。因此，理論上可以通過選擇性水解人參皂苷Rb1的糖基來制備稀有皂苷C-K[6~8]。目前，制備稀有人參皂苷的方法主要包括化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法[9,10]?；瘜W(xué)法包括加熱、部分酸水解和堿水解等，具有副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、污染環(huán)境等缺點，不利于其應(yīng)用?；谔擒账饷复呋奈⑸镛D(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、專一性高、環(huán)境相容性強等優(yōu)點，具有極大的應(yīng)用潛力[11~13]。因此，篩選高效轉(zhuǎn)化人參皂苷制備稀有人參皂苷C-K的菌株具有廣闊的研究和應(yīng)用前景[14~16]。本研究從東北農(nóng)耕土壤中篩選出能高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備C-K的真菌，并優(yōu)化其轉(zhuǎn)化條件，通過TLC、HPLC和13C-NMR進行定量分析和結(jié)構(gòu)鑒定[17~19]，以期為C-K的制備奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗所用土壤采集自吉林省梨樹縣的農(nóng)耕土壤。轉(zhuǎn)化底物人參皂苷Rb1由實驗室制得并經(jīng)HPLC和13C-NMR鑒定。人參皂苷標準品購自成都曼思特生物科技有限公司。對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)購自Sigma-Aldrich公司。分子克隆相關(guān)試劑如Taq酶、dNTPs、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自上海生工公司。其他試劑均為分析純或色譜純。引物合成由上海生工公司完成。

1.2實驗方法

1.2.1土壤中人參皂苷轉(zhuǎn)化菌種的篩選稱取5 g土樣加入50 mL滅菌水，充分攪拌后靜置，上清涂布于PDA固體培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)72 h后，將平板上長出的菌落分別劃線至新的PDA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h。所得的真菌再經(jīng)一次劃線培養(yǎng)，得到9種形態(tài)不同的真菌，分別命名為J1~J9，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.29種土壤真菌對人參皂苷的降解將分離得到的9種土壤真菌分別接種在V8汁液體培養(yǎng)基(1 L培養(yǎng)基含有 200 mL V8果汁上清、2 g CaCO3)中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。加入滅菌的玻璃珠，200 r/min振蕩10 min，用無菌紗布過濾，收集濾液，用25 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)稀釋至孢子濃度為1.0×106個/mL。向上述菌液中加入底物人參皂苷Rb1(溶于ddH2O，用0.22 μm濾膜過濾除菌)，使其終濃度為0.5 mg/mL。28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。在不同的時間點取樣，加入等量的正丁醇萃取，上層正丁醇相減壓蒸干，重新溶于甲醇，用TLC法和HPLC法檢測轉(zhuǎn)化結(jié)果。

1.2.3真菌J7鑒定將待鑒定的真菌J7接種到 PDA固體培養(yǎng)基平板上，將滅菌的蓋玻片斜插于平板上，于28℃恒溫箱中暗培養(yǎng)。觀察菌落的顏色和形態(tài)。待菌絲長到蓋玻片上時，于顯微鏡下觀察分生孢子梗、分生孢子及菌絲的大小和形態(tài)，并與《真菌鑒定手冊》進行比對。

將真菌J7接種于V8汁液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。過濾收集菌絲體，液氮研磨，提取真菌J7的基因組DNA。采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增真菌J7的ITS片段。PCR擴增體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs(10 μmol/L)0.5 μL，引物ITS1和ITS4(10 μmol/L)各0.5 μL，Taq酶0.2 μL，基因組DNA 0.5 μL，ddH2O補足體積至25 μL。擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃ 8 min。PCR擴增結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，對產(chǎn)物進行切膠回收，送至上海生工生物技術(shù)公司進行測序。將序列上傳至GenBank，并與11株真菌的ITS序列進行比對，應(yīng)用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4黑曲霉J7發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活性測定以對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物測定黑曲霉J7發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶活性，具體方法如下：取pNPG(5 mmol/L)30 μL、發(fā)酵液上清70 μL，用醋酸緩沖液(25 mmol/L，pH 5.0)補足體積至500 μL。反應(yīng)混合物在37℃下避光反應(yīng)30 min，然后加入2.5 mL NaOH(0.25 mol/L)終止反應(yīng)。以無pNPG底物的反應(yīng)體系作為對照，檢測405 nm的吸光值。根據(jù)對硝基苯酚標準曲線計算發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活。以每分鐘釋放1 nmol對硝基苯酚所需要的酶量定義為1個酶活性單位。

1.2.5轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的檢測與鑒定TLC檢測：采用硅膠G60板。展開劑為氯仿：甲醇：水=65∶35∶10(V/V/V，下層)。顯色劑：5%硫酸-乙醇溶液，105℃加熱5 min顯色。展開方式：上行展開。

HPLC檢測：采用日本島津HPLC系統(tǒng)，Shim-pack PREP-ODS (H)反相分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。以乙腈-水溶液進行如下程序的梯度洗脫：0~12 min，37.5%乙腈；12~32 min，37.5%~70%乙腈；32~42 min，70%乙腈；42~50 min，100%乙腈。流速：0.9 mL/min；柱溫：30℃，檢測波長：203 nm。

13C-NMR檢測：采用Bruker Av-600 NMR核磁共振儀，氘代甲醇(MeOD)作為溶劑，四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標。

1.2.6黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備C-K的條件優(yōu)化對黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備C-K的條件進行優(yōu)化。轉(zhuǎn)化pH分別選取4.0、5.0、6.0、7.0；反應(yīng)溫度為28℃、37℃、45℃；底物濃度為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL。轉(zhuǎn)化過程中定時取樣，用等量正丁醇萃取，正丁醇相用TLC法和HPLC法檢測轉(zhuǎn)化效率，以0 h作為空白對照。

1.2.7轉(zhuǎn)化體系的擴大將黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的體系放大至200 mL，在優(yōu)化后的最適條件下進行反應(yīng)：底物濃度：1 mg/mL；轉(zhuǎn)化溫度：28℃；轉(zhuǎn)化pH 5.0。轉(zhuǎn)化60 h后離心結(jié)束反應(yīng)，收集上清用等量正丁醇萃取2次，合并正丁醇相50℃水浴蒸干后，復(fù)溶于甲醇中，TLC和HPLC分析轉(zhuǎn)化結(jié)果。將樣品冷凍干燥后，稱重計算終產(chǎn)物C-K的收率。

2結(jié)果與分析

2.1菌種篩選與鑒定

從吉林省梨樹縣農(nóng)耕土壤中分離純化得到9株真菌，分別命名為J1~J9。對這9種真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的能力進行了研究。結(jié)果表明除J6不轉(zhuǎn)化外，其他8種真菌均能不同程度地轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1。如表1所示，J2、J5、J8和J9能將底物人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為唯一產(chǎn)物Rd，Rd不能被繼續(xù)水解。J1、J3、J4、J7能轉(zhuǎn)化Rb1至稀有人參皂苷C-K。但J3和J4的轉(zhuǎn)化途徑更為復(fù)雜，產(chǎn)物C-K將會被進一步水解，造成C-K產(chǎn)率降低。而J1的轉(zhuǎn)化效率較低。綜合比較，J7能將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為C-K，且轉(zhuǎn)化途徑清晰，轉(zhuǎn)化效率高。因此，接下來對J7進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并對其水解人參皂苷Rb1的能力進行系統(tǒng)研究。

2.2真菌J7的鑒定

如圖1所示，真菌J7的菌落形狀為圓形或橢圓形，生長初期菌落呈白色，逐漸變成黃色最后為黑色，厚絨毛狀；孢子為黑褐色，菌絲由白色變?yōu)闇\黃色。倒置顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)菌株J7的菌絲較發(fā)達，壁厚、無隔、光滑；孢子為球形，壁光滑，呈褐色；頂部有球形頂囊，其上長有球狀的分生孢子，呈黑褐色。通過比對《真菌鑒定手冊》，菌株J7符合黑曲霉的形態(tài)學(xué)特征。將562 bp的ITS序列上傳到NCBI中進行比對(GenBank登錄號KF059971)，比對結(jié)果(圖2)顯示真菌J7與黑曲霉有著高度同源性。據(jù)此可以鑒定菌株J7為曲霉屬(Aspergillus)黑曲霉菌，命名為黑曲霉Aspergillusnigersp. J7。

表1　9種土壤真菌對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化

注： “+”檢測表示有產(chǎn)物產(chǎn)生，“-”表示無產(chǎn)物產(chǎn)生。

圖1　菌株J7的電鏡形態(tài)圖Fig.1　Microscopic images of strain J7.1：分生孢子梗和頂囊(10×10倍)；2：孢子(10×40倍)；3：菌絲(10×40倍)

圖2　根據(jù)ITS序列繪制的黑曲霉J7進化樹Fig.2　The phyligenetic tree of ITS sequence of A. niger sp. J7.

2.3黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的途徑研究

對黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1的能力進行了系統(tǒng)研究。TLC方法檢測結(jié)果表明(圖3)，在12 h內(nèi)，底物Rb1出現(xiàn)了3個水解產(chǎn)物，其相對遷移率分別與人參皂苷標樣Rd、F2、C-K一致。初步推測Rb1的水解途徑為Rb1→Rd→F2→C-K。為驗證這一結(jié)果，使用HPLC-C18反相柱層析對Rb1的轉(zhuǎn)化過程進行檢測。與標樣(圖4)相比，底物Rb1經(jīng)黑曲霉J7水解后生成3種產(chǎn)物，分別與人參皂苷標樣Rd、F2、C-K的保留時間一致(圖5)。因此，確定Rb1的水解途徑為Rb1→Rd→F2→C-K。由這一轉(zhuǎn)化途徑可知，黑曲霉對人參皂苷Rb1的C-3和C-20位糖基的水解能力不同。黑曲霉優(yōu)先水解Rb1的C-20位外側(cè)葡萄糖基，形成第一個中間產(chǎn)物Rd。接著，Rd的C-3位外側(cè)葡萄糖基被切除，形成第二個中間產(chǎn)物F2。最后，F(xiàn)2 C-3位的內(nèi)側(cè)葡萄糖基被水解，形成終產(chǎn)物C-K。延長轉(zhuǎn)化時間C-K也不能被繼續(xù)水解，說明黑曲霉不能水解C-K的C-20位內(nèi)側(cè)葡萄糖基。

對終產(chǎn)物C-K的結(jié)構(gòu)進行13C-NMR鑒定，結(jié)果如圖6所示。在糖基異頭碳存在的區(qū)域，只有唯一的化學(xué)位移δ98.62。與已有研究[14]對比，該位置為二醇型皂苷C-20位內(nèi)側(cè)的葡萄糖殘基的異頭碳(C-1)。因此，可以確定該產(chǎn)物為人參皂苷C-K。

圖3　TLC分析黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1過程Fig.3　TLC analysis of the biotransformation process of ginsenoside Rb1 by A. niger sp. J7.

圖4　人參皂苷標準品的HPLC圖譜Fig.4　HPLC analysis of the ginsenoside standard.注:Rb1、Rd、F2、C-K的保留時間分別為5.085 min、10.872 min、24.872 min和37.775 min

圖5　HPLC分析黑曲霉J7對人參皂苷Rb1的轉(zhuǎn)化過程Fig.5　HPLC analysis of the biotransformation process of ginsenoside Rb1 by A. niger sp.

圖6　轉(zhuǎn)化終產(chǎn)物C-K的13C-NMR圖譜及結(jié)構(gòu)Fig.6　13C-NMR spectrum and structure of transformed products C-K.

2.4轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

2.4.1最適發(fā)酵時間黑曲霉J7在V8汁液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。分別測定不同時間點的發(fā)酵液中的β-葡萄糖苷酶酶活。由圖7可知，黑曲霉J7在36~48 h時酶活快速增加，72 h時酶活達到最高值。繼續(xù)培養(yǎng)酶活開始下降。因此確定最適發(fā)酵時間為72 h。

圖7　黑曲霉J7發(fā)酵過程中胞外β-糖苷水解酶的酶活曲線Fig.7　The enzymatic activity of glycosidase from A. niger sp. J7.

2.4.2最適轉(zhuǎn)化pH將72 h的菌液離心，收集菌絲體和孢子，用緩沖液制備成轉(zhuǎn)化液，加入人參皂苷Rb1后，分別置于不同的條件下培養(yǎng)，HPLC法計算不同條件下的C-K產(chǎn)率，結(jié)果如圖8A所示。pH 5.0時，12 h后黑曲霉J7可將人參皂苷Rb1完全轉(zhuǎn)化成C-K，速度快且?guī)缀鯖]有中間副產(chǎn)物，當pH達到7.0時幾乎沒有C-K生成。因此最適轉(zhuǎn)化pH確定為5.0。

2.4.3最適轉(zhuǎn)化溫度由圖8B可知，在28℃時，黑曲霉J7可將人參皂苷Rb1完全轉(zhuǎn)化成C-K，速度快且?guī)缀鯖]有中間副產(chǎn)物。37℃時C-K產(chǎn)率降低，45℃時幾乎沒有C-K生成。因此最適轉(zhuǎn)化溫度確定為28℃。

2.4.4最適底物濃度由圖8C可知，將轉(zhuǎn)化液中底物人參皂苷Rb1的濃度分別調(diào)節(jié)為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL。結(jié)果表明，當濃度達到2 mg/mL時，24 h內(nèi)Rb1不能實現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，當濃度小于1 mg/mL時，12 h內(nèi)Rb1即可完全轉(zhuǎn)化為C-K，且沒有其他產(chǎn)物生成?？紤]到反應(yīng)速率，因此最適底物濃度確定為1 mg/mL。

經(jīng)過一系列單因素實驗研究得出黑曲霉J7培養(yǎng)72 h后配制成的轉(zhuǎn)化緩沖液轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1最優(yōu)條件如下：轉(zhuǎn)化緩沖液pH 5.0，轉(zhuǎn)化溫度28℃，底物濃度1 mg/mL，在150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h。

2.5轉(zhuǎn)化體系的擴大

在最適條件下，將黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷制

圖8　黑曲霉J7轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1制備C-K的條件優(yōu)化Fig.8　Optimization of the conditions for preparation of C-K from ginsenoside Rb1 by A. niger sp. J7.A：不同pH下的C-K產(chǎn)率；B：不同轉(zhuǎn)化溫度下的C-K產(chǎn)率；C：不同底物Rb1濃度下的C-K產(chǎn)率

備C-K的體系放大至200 mL。60 h內(nèi)黑曲霉J7可將200 mg人參皂苷Rb1全部轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷C-K，轉(zhuǎn)化率為74.7%。

3討論

早先，研究者選用腸道菌群轉(zhuǎn)化人參皂苷制備抗腫瘤活性分子C-K。但腸道菌是厭氧菌，培養(yǎng)困難且成本較高，不利于生物轉(zhuǎn)化的放大，所以人們開始尋找其他適合的微生物來轉(zhuǎn)化人參皂苷制備C-K。前期研究結(jié)果表明，曲霉屬、根霉屬、毛霉屬、紅曲霉菌屬等霉菌具有降解人參皂苷的能力[20]，這些菌株被用于稀有人參皂苷C-K的轉(zhuǎn)化制備。崔宇等[21]從人參種植土壤中篩選得到一株鐮刀霉菌，利用該菌株轉(zhuǎn)化人參果總皂苷以制備C-K，確定了該菌的最佳生長條件和最佳轉(zhuǎn)化條件，為 C-K 的制備提供了一種可行的方法。侯耀達等[22]發(fā)現(xiàn)霉菌GS1-33能將人參根總皂苷轉(zhuǎn)化為人參稀有皂苷C-K及Rh1，C-K的最大產(chǎn)率為14%，Rh1的最大產(chǎn)率為25%。由于這些研究多以混合皂苷作為底物，導(dǎo)致產(chǎn)物中除C-K外，還混有其他皂苷成分，給C-K的純化帶來困難。因此，篩選出成本低、安全性高、專一性好的轉(zhuǎn)化菌株是目前制備人參皂苷 C-K 的首要任務(wù)。本研究從土壤中篩選到一株高效降解人參皂苷Rb1的黑曲霉，該菌向發(fā)酵液中分泌β-葡萄糖苷酶，能夠高效轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1生成稀有人參皂苷C-K。經(jīng)過條件優(yōu)化和轉(zhuǎn)化體系擴大后，在60 h內(nèi)，200 mg人參皂苷Rb1全部轉(zhuǎn)化為單一產(chǎn)物，通過13C-NMR分析，確定終產(chǎn)物為稀有人參皂苷C-K。這說明黑曲霉J7分泌的胞外水解酶依次水解人參皂苷Rb1的C-20位外側(cè)葡萄糖基、C-3位的外側(cè)葡萄糖基和C-3位的內(nèi)側(cè)葡萄糖基，中間產(chǎn)物分別為人參皂苷Rd和F2，轉(zhuǎn)化終產(chǎn)物為人參皂苷C-K。在這個過程中，黑曲霉J7不能進一步水解C-K中C-20位葡萄糖基而形成人參二醇型皂苷元，因此該菌的這一選擇性使其適用于C-K的制備。這一轉(zhuǎn)化過程中不涉及其余皂苷產(chǎn)物的生成，使產(chǎn)物C-K的純化相對簡便。此法適用于工業(yè)化制備，對稀有人參皂苷C-K的工業(yè)化制備具有重要意義。

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Enzymatic Degradation of Ginsenoside Rb1 for Preparation of Compound K byAspergillusnigersp. J7

GAO Juan1, ZHOU An-dong2, YUAN Ye1, ZHAO Tian-jiao1

1.SchoolofLifeSciences,NortheastNormalUniversity,Changchun130024,China;2.HighSchoolAttachedtoNortheastNormalUniversity,Changchun130024,China

Abstract:Minor ginsenoside Compound K (C-K) exhibited remarkable biological activities. In this study, nine fungi were isolated from soil, and their abilities of transform ginsenoside Rb1 for preparation of C-K were studied. A highly efficient ginsenoside Rb1-hydrolyzing fungus Aspergillus niger sp. J7 was screened. The strain converted ginsenoside Rb1 to C-K with the pathway of Rb1→Rd→F2→C-K. The conversion conditions of A. niger sp. J7 was optimized. Under the optimal conditions, ginsenoside Rb1 was converted to C-K completely. The transformation system was enlarged to 200 mL, in which ginsenoside Rb1 was completely converted into C-K after 60 h and the conversion rate was 74.7%. This fungus was expected to be the basis in bioactive C-K preparation.

Key words:ginsenoside; Aspergillus niger; biotransformation;β-glucosidase

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.04

作者簡介：高娟，講師，主要從事糖類化合物生物轉(zhuǎn)化研究。E-mail：gaoj199@nenu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31400299)資助。

收稿日期：2015-12-15; 接受日期：2016-01-06