左旋多巴對(duì)帕金森病大鼠海馬區(qū)酪氨酸羥化酶及α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

許文年

(濟(jì)南軍區(qū)第四五六醫(yī)院藥械科，山東　濟(jì)南　250031)

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左旋多巴對(duì)帕金森病大鼠海馬區(qū)酪氨酸羥化酶及α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

許文年

(濟(jì)南軍區(qū)第四五六醫(yī)院藥械科，山東濟(jì)南250031)

〔摘要〕目的探討左旋多巴(L-dopa)對(duì)帕金森病(PD)大鼠海馬區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)及α-突觸核蛋白(α-Syn)表達(dá)的影響。方法選取96只健康雄性Wistar大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、PD模型組和L-dopa干預(yù)組各32只；各組再隨機(jī)分為4 d和8 d兩個(gè)亞組，各16只。對(duì)PD模型組和L-dopa干預(yù)組大鼠皮下注射魚藤酮乳液(2 mg/kg)建立大鼠PD模型，對(duì)照組皮下注射等劑量的葵花油。造模成功后對(duì)L-dopa干預(yù)組大鼠灌胃給予L-dopa干預(yù)治療，對(duì)照組及PD模型組大鼠灌胃給予生理鹽水，各組中兩個(gè)亞組均分別持續(xù)4 d和8 d。采用Y型電迷宮試驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，海馬區(qū)TH和α-Syn的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及表達(dá)水平的檢測(cè)分別采用免疫組化法及Western蛋白印跡法。結(jié)果PD模型組大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力顯著低于對(duì)照組，而L-dopa干預(yù)組較PD模型組明顯提升(P<0.05)；PD模型組及L-dopa干預(yù)組大鼠的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，L-dopa干預(yù)組高于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組高于4 d亞組(P<0.05)；PD模型組及L-dopa干預(yù)組的α-Syn表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，L-dopa干預(yù)組低于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組低于4 d亞組(P<0.05)。結(jié)論魚藤酮可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生PD，使其學(xué)習(xí)與記憶能力顯著下降，L-dopa可通過(guò)增強(qiáng)海馬區(qū)的TH表達(dá)水平，抑制α-Syn的表達(dá)，從而治療PD。

〔關(guān)鍵詞〕帕金森??；左旋多巴；酪氨酸羥化酶；α-突觸核蛋白；海馬

帕金森病(PD)的發(fā)病機(jī)制與黑質(zhì)紋狀體多巴胺(DA)缺乏有關(guān)，其典型病理改變?yōu)楹谫|(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)路易小體(LB)的形成。酪氨酸羥化酶(TH)是由酪氨酸合成DA過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，與PD密切相關(guān)〔1〕。α-突觸核蛋白(α-Syn)是LB的主要結(jié)構(gòu)成分，可抑制DA的釋放，研究顯示α-Syn與PD相關(guān)，可作為診斷PD的一種生物學(xué)標(biāo)志物〔2〕。PD的臨床治療以藥物治療為主，左旋多巴(L-dopa)是目前治療PD的最重要的藥物之一，其本身無(wú)活性，須經(jīng)氨基酸脫羧酶的作用轉(zhuǎn)化為DA而發(fā)揮藥理學(xué)作用。研究顯示〔3〕，L-dopa可影響大鼠結(jié)腸TH及α-Syn的表達(dá)，研究旨在探討L-dopa對(duì)海馬區(qū)TH及α-Syn表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取96只健康雄性Wistar大鼠(由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，月齡3~4個(gè)月，體重250~350 g，未出現(xiàn)特定病原菌級(jí)(SPF級(jí))。于山東大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫(23.0±2.0)℃，濕度50%~75%，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑

1.2.1儀器臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Y型電迷宮(自制)，奧林巴斯BX63全自動(dòng)顯微鏡掃描系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)，電泳儀(北京華陽(yáng)分析儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)(廣州易測(cè)儀器有限公司)

1.2.2試劑L-dopa(美國(guó)Sigma公司)，魚藤酮(陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司)，葵花油，兔抗TH單克隆抗體及兔抗α-Syn多克隆抗體(美國(guó)CST公司)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(中國(guó)中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(華美生物公司)，即用型免疫組化SP試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)，快速Western blotting試劑盒(上海易利生物科技有限公司)

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組將96只大鼠按照隨機(jī)分組方法分為對(duì)照組、PD模型組、L-dopa干預(yù)組各32只；每組再隨機(jī)分為模型制備成功后4 d、8 d兩個(gè)亞組各16只。其中8只用于免疫組化法檢測(cè)，8只用于Western印跡法檢測(cè)。

1.3.2PD動(dòng)物模型制備采用頸背部皮下注射魚藤酮方法對(duì)PD模型組和L-dopa干預(yù)組大鼠制備PD模型：(1)魚藤酮乳液配制：以葵花油溶解魚藤酮配制濃度為2 mg/ml的乳液，充分震蕩混勻后避光保存。(2)皮下注射：以2 mg/kg劑量計(jì)算各只大鼠的魚藤酮乳液用量，碘伏消毒后，捏起大鼠頸背部皮膚，用1 ml注射器皮下注入。(3)造模成功大鼠篩選：觀察大鼠的行為學(xué)變化，參照相關(guān)文獻(xiàn)〔3〕，以行為學(xué)評(píng)分2~6分為大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)對(duì)照組大鼠頸背部皮下注射同劑量的葵花油。

1.3.3處理方法對(duì)L-dopa干預(yù)組大鼠給予15 mg/kg L-dopa灌胃，2次/d；對(duì)照組及PD模型組大鼠均給予2 ml的生理鹽水灌胃，2次/d，各組的兩個(gè)亞組大鼠均分別持續(xù)4 d和8 d。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力檢測(cè)將各組大鼠進(jìn)行Y型電迷宮測(cè)試〔4〕，電壓為40 V，采用不固定次數(shù)隨機(jī)法(即安全區(qū)以無(wú)規(guī)則的次序變換)。學(xué)習(xí)能力：將大鼠靜置于起步區(qū)3 min后電擊，大鼠逃至安全區(qū)，燈光持續(xù)15 s后熄滅休息，45 s后重新開始下一次操作，以連續(xù)10次試驗(yàn)中9次正確為達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。記憶能力：24 h后以相同方法測(cè)試大鼠記憶保存情況。

1.4.2TH和α-Syn陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用免疫組化法對(duì)TH和α-Syn陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)：(1)海馬組織提?。焊骨痪徛谱?0%水合氯醛溶液3 ml/kg麻醉大鼠，斷頭處死。迅速打開大鼠顱腔，取出完整全腦，取海馬組織，清洗干凈后迅速放入液氮中，然后放入EP管中-80℃保存。(2)腦干標(biāo)本制作：取2~3 g腦干組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)包埋、切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)；0.3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性氧化酶20 min；1%山羊血清封閉20 min，分別加入Ⅰ抗(兔抗α-Syn多克隆抗體，兔抗TH單克隆抗體)，4℃孵育過(guò)夜；再分別加入生物素Ⅱ抗及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，均于37℃孵育30 min；以上操作均用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3次，5 min/次，后DAB顯色。(3)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。從各亞組大鼠腦干標(biāo)本中隨機(jī)選取不重疊的6視野進(jìn)行TH及α-Syn陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，光鏡下陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，胞核呈淺藍(lán)色或紫藍(lán)色，高倍鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)變化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.3TH和α-Syn水平測(cè)定采用Western蛋白印跡法：(1)蛋白樣品處理。取海馬組織按40 mg/kg加入蛋白裂解液，電動(dòng)勻漿器勻漿，冰浴中靜置30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液-20℃保存。經(jīng)蛋白定量后分裝，用4℃預(yù)冷的PBS液調(diào)蛋白濃度及SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液至上樣量一致，沸水浴加熱3~5 min，使蛋白質(zhì)充分變性；(2)上樣、電泳。將樣品冷卻至室溫后直接上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，放置電泳裝置內(nèi)，電壓設(shè)置100 V，電泳時(shí)間100 min。聚偏氟丙烯(PVDF)轉(zhuǎn)模、封閉，后參照說(shuō)明書進(jìn)行Ⅰ抗、Ⅱ抗孵育；(3)表達(dá)量分析。洗模，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，在Image J圖像分析軟件下觀察目的蛋白條件及內(nèi)參的光密度值，兩者的比值反映目的蛋白的相對(duì)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS14.0軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力檢測(cè)三組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PD模型組大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力顯著低于對(duì)照組，而L-dopa干預(yù)組較PD模型組明顯提升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠TH和α-Syn陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較PD模型組及L-dopa干預(yù)組大鼠的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組，而L-dopa干預(yù)組分別高于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組中的8 d亞組TH細(xì)胞數(shù)高于4 d亞組(P<0.05)；此外，PD模型組及L-dopa干預(yù)組的α-Syn陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組，而L-dopa干預(yù)組分別低于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組低于4 d亞組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠腦干TH和α-Syn表達(dá)水平比較PD模型組及L-dopa干預(yù)組大鼠的TH表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組，而L-dopa干預(yù)組分別高于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組中的8 d亞組TH表達(dá)水平高于4 d亞組(P<0.05)；此外，PD模型組及L-dopa干預(yù)組的α-Syn表達(dá)水平均高于對(duì)照組，而L-dopa干預(yù)組分別低于PD模型組，且L-dopa干預(yù)組的8 d亞組低于4 d亞組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1　各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力測(cè)試結(jié)果〔n=32，n(%)〕

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與PD模型組比較：2)P<0.05

表2　各組大鼠TH和α-Syn陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與PD模型組比較：2)P<0.05；與8 d亞組比較：3)P<0.05，下表同

表3　各組大鼠腦干TH和α-Syn表達(dá)水平比較

3討論

PD是一種常見(jiàn)的錐體外系疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能異常，同時(shí)可伴隨學(xué)習(xí)、記憶能力降低等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，約有4%~93%的PD患者在發(fā)病中晚期會(huì)呈現(xiàn)PD性癡呆，臨床表現(xiàn)為記憶力、視覺(jué)空間、認(rèn)知能力等受損〔5〕，其機(jī)制可能與大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)神經(jīng)元變性有關(guān)。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致〔4〕，說(shuō)明PD模型組大鼠經(jīng)魚藤酮染毒后海馬區(qū)可能發(fā)生神經(jīng)元退變，而導(dǎo)致海馬區(qū)功能受損。

目前PD的發(fā)病原因尚不明確，大部分學(xué)者認(rèn)為與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和免疫異常等有關(guān)。其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變，導(dǎo)致DA的缺乏。目前臨床上PD主要以L-dopa替代治療為主，也有越來(lái)越多的研究提出不同的治療方法〔6〕，如營(yíng)養(yǎng)因子治療、干細(xì)胞移植治療等，但應(yīng)用于臨床仍面臨高費(fèi)用、長(zhǎng)期療效不確定等問(wèn)題〔7〕。L-dopa本身沒(méi)有活性，其由血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)經(jīng)過(guò)酶的催化作用合成DA而發(fā)揮效應(yīng)，TH是DA合成過(guò)程中的重要催化酶，α-Syn也是PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要構(gòu)成成分。

本研究結(jié)果提示魚藤酮誘發(fā)大鼠產(chǎn)生PD疾病癥狀，且其可能通過(guò)抑制TH酶水平及激發(fā)α-Syn成分的產(chǎn)生而促進(jìn)PD疾病的發(fā)生發(fā)展。魚藤酮是一種細(xì)胞毒性化合物，其主要生化效應(yīng)是抑制細(xì)胞呼吸鏈對(duì)氧的利用，造成內(nèi)呼吸抑制性缺氧。體外研究發(fā)現(xiàn)，魚藤酮對(duì)DA細(xì)胞的毒性作用多樣，既可增強(qiáng)DA細(xì)胞對(duì)其他有害因素的敏感性，又可直接誘發(fā)DA細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)促進(jìn)DA神經(jīng)元的釋放經(jīng)自身氧化作用而損傷DA神經(jīng)元〔8〕。此外，L-dopa可以通過(guò)激發(fā)TH酶水平，抑制α-Syn的產(chǎn)生而發(fā)揮治療PD的作用，顯著改善PD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，且治療時(shí)間與療效呈正比。這與以往的研究結(jié)果相似〔3〕?？赡苁荓-dopa可通過(guò)增強(qiáng)TH酶水平表達(dá)，及抑制α-Syn釋放的作用，從而促進(jìn)酪氨酸合成為DA及抑制體內(nèi)LB的生成，達(dá)到延緩PD發(fā)展的目的。但對(duì)于L-dopa的臨床副作用還有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1何珊.帕金森病模型大鼠腦內(nèi)TH表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)碩士論文,2014.

2李鑫,馮濤,郜麗妍,等.α-突觸核蛋白聚集作為帕金森病生物學(xué)標(biāo)記物的研究進(jìn)展〔J〕.中華老年心腦血管病雜志,2014;16(9):1004-6.

3畢樹立,劉斌,高海英.左旋多巴對(duì)帕金森病模型大鼠結(jié)腸酪氨酸羥化酶和α-突觸核蛋白表達(dá)的影響〔J〕.疑難病雜志,2014;29(10):1047-50.

4邢紅霞,袁燕,劉勝,等.帕金森病大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力與左旋多巴的關(guān)系〔J〕.中國(guó)組織工程研究,2014;18(7):1069-75.

5王樂(lè),畢勝,范曉雪,等.維生素D及其受體在帕金森病中的作用〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015;15(3):594-7,518.

6李雨濛,于會(huì)艷,秦斌.帕金森病的治療現(xiàn)狀及未來(lái)〔J〕.中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2015;23(3):215-9.

7林劍霞,潘瑤,李妍.帕金森病的研究進(jìn)展〔J〕.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2015;36(2):144-7.

8畢樹立,高海英.司來(lái)吉蘭聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯對(duì)帕金森病模型大鼠結(jié)腸TH,α-Syn表達(dá)的影響〔J〕.河南中醫(yī),2015;35(3):512-4.

〔2015-10-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R749

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)07-1556-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.009

第一作者：許文年(1971-)，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)方面的研究。