淺談動物疫苗耐熱保護劑的種類及作用機理

趙燕　喻正軍

（湖南中岸生物藥業(yè)有限公司，湖南長沙410199）

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淺談動物疫苗耐熱保護劑的種類及作用機理

趙燕喻正軍

（湖南中岸生物藥業(yè)有限公司，湖南長沙410199）

摘要：隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，我國研制出了大量的滅活疫苗、弱毒疫苗以及基因工程疫苗等各類動物疫苗，其中，采用凍干技術的弱毒活疫苗在市場上占據相當大的比重。然而，熱穩(wěn)定性和保護性能差是當前國內疫苗保護劑研究領域急需解決的兩大難題；再者，產品對冷鏈的要求很高，這對疫苗的儲存和運輸造成很大挑戰(zhàn)。因此，研究和開發(fā)新型有效的耐熱保護劑對提高動物疫苗的質量至關重要。本文綜述了目前研究已發(fā)現的大量有效的耐熱保護劑種類及其作用機理，以期為研制新型動物疫苗耐熱保護劑指明方向。

關鍵詞：動物疫苗；耐熱保護劑；種類；作用機理

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，大量的滅活疫苗、弱毒活疫苗以及新型的基因工程疫苗不斷涌現出來，為我國畜牧業(yè)的發(fā)展做出了卓越貢獻。其中，凍干的弱毒活疫苗在當前國內市場上占據重要位置，然而，國內疫苗常用的保護劑大多是牛奶、蔗糖、明膠等，雖具有溶解性好、外型穩(wěn)定、保存方便和成本低廉的優(yōu)點，但也面臨著熱穩(wěn)定性差和保護功能弱的難題。市場上流通的動物疫苗大多需要在-15℃以下保存，在2～8℃條件下只能保存3～6個月，這無疑增加了疫苗儲存和運輸的難度[1]。

20世紀80年代起，發(fā)達國家便開始著手進行凍干保護劑的研究。然而，我國在該領域起步較晚，雖然中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所王棟研究員[2]研制出了一種可使疫苗在2～8℃條件下保存24個月的耐熱凍干保護劑，但截止目前新開發(fā)的疫苗凍干保護劑種類有限，且尚未得到全面推廣應用。隨著全球畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，我國動物及動物產品的進出口貿易將逐漸擴大，因此，我國科學家和研究者們致力于研究、開發(fā)和應用多種新型有效的耐熱保護劑，從而為提高動物疫苗質量，切實做好動物疫病防控工作做出貢獻。本文就目前研究者們研究和探索的大量有效的耐熱保護添加劑進行簡要綜述。

1　糖/多元醇類保護劑

糖類，又稱碳水化合物，由碳、氫、氧三種元素組成，其中氫和氧的比例為2∶1，可分為單糖、低聚糖和多糖三類；多元醇，又稱糖醇，是指含有兩個或兩個以上羥基的醇。在動物疫苗冷凍干燥和儲藏過程中，大量使用糖/多元醇來作為冷凍干燥保護劑（表1）。

由于單糖在凍結過程中所提供的穩(wěn)定作用非常微弱，而二糖能在凍結和干燥脫水過程中起到低溫保護劑和脫水保護劑的功能[3-6]，因此常用二糖作為動物疫苗的凍干保護劑。海藻糖是最常用的一種二糖類凍干保護劑，它是一種由特殊雙糖分子構成的非還原性天然糖類，能夠在高寒、高溫、干燥失水等惡劣的條件下在細胞表面形成特殊的保護膜，有效地保護生物分子的結構不被破壞，從而維持生命體的生命過程和生物特征。海藻糖因“海藻糖-蛋白質-水”微冰晶的形成而具有較高的玻璃化轉變溫度，可有效防止水對玻璃態(tài)的增塑作用，同時還具有吸濕性弱、內部氫鍵少、化學活性低等優(yōu)點。此外，在凍干海藻糖的長期儲藏過程中易形成二水化合物，這有利于防止因濕度所致的玻璃化轉變溫度降低，從而可避免蛋白質的變性[7]。

在動物疫苗的冷凍干燥過程中，比較常用的多元醇包括甘露醇、山梨醇和丙三醇等。甘露醇和山梨醇一般用作填充劑，不會與活性組分發(fā)生反應，因其在慢速凍結時會結晶，從而為活性組分提供支撐結構；丙三醇則一般用作低溫保護劑。

表1　動物疫苗冷凍干燥和儲藏過程中常用的糖/多元醇保護劑

2　聚合物類保護劑

聚合物是由簡單的小分子單體發(fā)生聚合反應形成的大分子。在動物疫苗的冷凍干燥過程中，聚合物具有能提高混合液玻璃化轉變溫度的有利因素，同時起著低溫保護劑和脫水保護劑的作用。在動物疫苗冷凍干燥過程中常用的聚合物類保護劑見表2。

在動物疫苗的冷凍干燥過程中最常用的聚合物類保護劑包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清白蛋白（BSA）、右旋糖酐（Dextran）和聚乙二醇（PEG）等。PVP常被用作澄清劑、色素穩(wěn)定劑和膠體穩(wěn)定劑，在生物制品低溫保存和脫水干燥中起到很好的保護作用和支撐填充作用。在含有緩沖劑的LDH配方中，10%的PVP因能抑制磷酸二鈉的結晶，從而抑制了系統(tǒng)的pH值降低[8]；采用PVP與其他賦形劑（如甘露醇等）聯合使用，其抗斷裂的強度可以提高3～25倍，并且可以保證凍干物料的顏色和質地均勻，沒有收縮[9]。

BSA的冷凍干燥粉末，常為白色或類白色，可溶于水，其水溶液加熱至60～70℃時，蛋白會凝固沉淀。牛血清在很低的濃度下就能起到很好的保護效果，其保護原理與PVP類似。濃度為0.05%的BSA用于LDH的低溫保存過程和冷凍干燥過程時，活性恢復率分別可以達到100%和80%[8]。近年來，考慮到牛血清可能會給蛋白質藥品帶來不良病原體，所以選擇人重組白蛋白（rHA）取代牛血清作為穩(wěn)定劑[10]。

Dextran是若干葡萄糖分子脫水的聚合產物，又叫葡聚糖，呈白色無定型粉末，無臭無味。它是一種相對分子質量較高的大分子，既不能增加摩爾滲透濃度，也不會顯著降低水溶液的冰點[11]。由于多糖溶液冷凍時形成兩相體系：一相是冰晶；另一相是由70%多糖分子和30%不可凍結水組成的玻璃態(tài)，不可凍結水是高濃度濃縮的多糖溶液的組成成分，因其黏度高，水分子的運動受到限制，而不能吸附到晶核或結晶長大的活性位置，起到抑制冰晶長大的作用，從而很好地穩(wěn)定疫苗冷凍過程。因此，右旋糖酐常被作為動物疫苗冷凍干燥中的低溫保護劑而廣泛應用。

聚乙二醇（PEG）是由乙二醇與環(huán)氧乙烷反應生成的聚合物，其在動物疫苗低溫保存和冷凍干燥中的保護能力遠大于低分子化合物，且保護效果與PEG的相對分子質量有一定相關性。在低溫保存過程中，PEG 8000在濃度≥0.01%（質量濃度）時就能完全保護LDH，PEG 400在濃度≥2.5%（質量濃度）時可實現完全保護作用，而蔗糖的保護能力遠遠不及PEG 400，即使它的濃度高達10%（質量濃度）也不能起到完全的保護效果[12]。

表2　動物疫苗冷凍干燥過程中常用的聚合物類保護劑

3　氨基酸類保護劑

氨基酸是構成蛋白質的基本結構單位，由一個氨基、一個羧基、一個氫原子和一個R基團連接在一個α碳原子所組成。由于氨基酸同時含有酸性的羧基基團和堿性的氨基基團，因此在動物疫苗的凍干過程中能夠緩沖溶液pH值的變化，從而保護活性組分不受破壞。例如，低濃度的甘氨酸能夠抑制10 mmol/L或100 mmol/L的磷酸鈉緩沖液在凍結過程中的pH值變化，避免蛋白質發(fā)生凍結變性[13]。表3為冷凍干燥過程中常用的氨基酸類保護劑。

4　抗氧化劑類保護劑

在動物疫苗的冷凍干燥過程中，為了提高凍干樣品的穩(wěn)定性和延長凍干樣品的儲藏期，在其凍干成分中常添加適量的抗氧化劑，從而防止有效的蛋白成分與空氣中的氧發(fā)生氧化反應而變質。由于抗氧化劑的作用機理多種多樣，因此，將不同類型的抗氧化劑混合起來使用可達到更好的保護效果[11]。冷凍干燥過程中常用的抗氧化劑見表4。

5　緩沖劑類保護劑

蛋白質具有兩性電解質性質，在等電點的環(huán)境下最為穩(wěn)定，然而，在極端pH值的環(huán)境下，肽鍵的部分水解或者聚集作用會導致蛋白質的不可逆性變性。在動物疫苗冷凍干燥過程中，隨著溶液的濃度逐漸提高，pH值會相應發(fā)生變化，超出一定的pH值范圍則會導致蛋白質的變性，從而使得動物疫苗失活。所以，在凍干保護劑的配方中，添加適量的緩沖劑十分必要，常見的緩沖劑如表5所示。

表3　冷凍干燥過程中常用的氨基酸類保護劑

表4　冷凍干燥過程中常用的抗氧化劑

6　表面活性劑類保護劑

表面活性劑是指由親水和親油基組成的能使溶液體系的界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化的物質，當這些物質處于空氣-水界面或油-水界面時，親水基會定位在水相，而親油基則會指向氣相或油相。在動物疫苗冷凍干燥過程中，表面活性劑不僅能在凍結和脫水過程中降低冰-水界面張力所引起的凍結和脫水變性，還能在復水過程中對活性組分起到潤濕劑和重褶皺劑的作用[14]。常用的表面活性劑有：吐溫80、曲拉通X-100、蔗糖脂肪酸酯、羥丙基-β-環(huán)糊精、十二烷基硫酸鈉和脂肪醇聚氧乙烯醚等，其中吐溫系列是最常用的非離子型表面活性劑。

7　凍干加速劑類保護劑

由于叔丁醇可在疫苗凍結時形成針狀結晶，并在冰晶升華后留下管狀通道，從而使得動物疫苗凍干過程中水蒸氣流動阻力大大減小，升華速率顯著提高[15]。因此，常常在動物疫苗中加入叔丁醇來降低干燥層阻力，從而加速干燥過程，縮短干燥時間。同時，叔丁醇還可使產品具有高的比表面積，復水性好，有效提高藥品溶液和凍干品的穩(wěn)定性。

8　小結

動物疫苗中凍干保護劑的添加減少了動物疫苗在高溫和長時間保存中可能發(fā)生的物理、化學變化，其保護功能主要受微生物因素和保護劑自身因素兩個方面的影響。因此，在研究和開發(fā)新型凍干保護劑時，要綜合考慮以上兩方面因素，合理搭配保護劑種類，反復驗證凍干溫度，制定出優(yōu)化的凍干曲線。而且，選定保護劑并制成凍干成品后，要對樣品進行保存期試驗、效價測定和安全性檢驗等對比試驗，從而根據試驗結果，不斷調整保護劑配方及凍干曲線，以期達到最佳效果[16]。為了適應全球畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，凍干保護劑需要結合更多有效的輔助技術手段來對凍干過程中物料的真實狀態(tài)進行模擬解析；同時，獸醫(yī)工作者應致力于研究動物疫苗相關蛋白質的保護機理，從而開發(fā)出具有潛能的動物疫苗凍干保護劑，為我國動物疫苗質量的提高和動物防疫工作的開展做出貢獻。

表5　冷凍干燥過程中常用的緩沖劑

參考文獻

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作者簡介：趙燕（1989-），女，漢族，山西長治人，碩士，主要研究方向為豬乙腦活疫苗耐熱保護劑、PCV2滅活疫苗及PCV2基因工程疫苗研制，E-mail：zhaoyan82882@126.com

收稿日期：2015-11-04

中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4645(2016)02-0039-05