多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序篩查結(jié)直腸癌中MMR基因的突變

黃　凱　陳慧杰　劉方奇　徐　燁　李　軒　南　蓬

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室　上?！?00433;2上海同達科信生物技術(shù)發(fā)展有限公司　上?！?00080;

3上海生物信息技術(shù)研究中心　上海　201203; 4復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科　上?！?00032;

5中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所　上?！?00032)

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多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序篩查結(jié)直腸癌中MMR基因的突變

黃凱1,2陳慧杰3劉方奇4徐燁4李軒5南蓬1△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室上海200433;2上海同達科信生物技術(shù)發(fā)展有限公司上海200080;

3上海生物信息技術(shù)研究中心上海201203;4復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科上海200032;

5中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所上海200032)

【摘要】目的探討多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)在結(jié)直腸癌 (colorectal cancer,CRC)中檢測錯配修復(fù) (mismatch repair,MMR)基因種系突變的應(yīng)用。方法收集17例CRC患者和14例正常人的血液并提取基因組DNA;設(shè)計和優(yōu)化寡聚核苷酸探針,使其能對5個基因MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6的73個外顯子序列進行有效的PCR擴增和富集;應(yīng)用多重PCR技術(shù)靶向富集樣本MMR基因的外顯子序列;擴增產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建和高通量測序,檢測MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6基因的突變情況。結(jié)果31個樣本共得到2.7Gb的數(shù)據(jù),平均reads數(shù)為287 048,測序數(shù)據(jù)中平均82.18%可與參考序列進行比對,外顯子序列平均覆蓋度為99.9%,平均測序深度為2 282。在MMR基因的外顯子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)13種非同義單核苷酸變異 (single nucleotide variation,SNV)、2種同義 SNV,其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R為未見報道SNV。檢測結(jié)果經(jīng)Sanger法測序驗證,結(jié)果一致。結(jié)論多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)是一套通量高、速度快、費用低、準確性高的MMR基因突變篩查方法。

【關(guān)鍵詞】錯配修復(fù)基因;Lynch綜合征;靶向富集;高通量測序

*This work was supported by the National Key Basic R&D Program of China (973 Plan,2012CB316501),the National Key Technologies R&D Program of China (863 Plan,2012AA02A602) and the National Natural Science Foundation of China (31271409,31401128).

結(jié)直腸癌 (colorectal cancer,CRC)是全世界第三大常見惡性腫瘤[1]。研究發(fā)現(xiàn)35%的CRC存在家族易感性[2],其中最常見的是Lynch綜合征,即遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌 (hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC),占所有病例的2%～5%[3]。錯配修復(fù) (mismatch repair,MMR)基因發(fā)生胚系突變是Lynch綜合征的遺傳學(xué)發(fā)病機制[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)至少5種MMR基因 (MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)的胚系突變會導(dǎo)致Lynch綜合征,其中MLH1的胚系突變占50%,MSH2占40%,MSH6占7%,剩下的基因占3%[6]。在家系中,MMR基因種系突變攜帶者為發(fā)生Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的高危人群,檢測MMR基因種系突變能很好地預(yù)測Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的發(fā)生危險[7]。

直接基因測序法是檢測MMR基因胚系突變最靈敏和最特異的方法,但Sanger法測序不僅費時而且價格昂貴。除了直接測序外的篩檢方法還有:MMR蛋白表達免疫組化分析 (immunohistoch-meistry,IHC)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (microsatellite instability,MSI)檢測。IHC檢測可以確定受累基因,從而指導(dǎo)直接測序,不足之處是某些突變只導(dǎo)致MMR蛋白功能受損,而并沒有嚴重影響到MMR的表達,此時IHC檢測可能為陰性[8-10]。另外,有些MSH6胚系突變只導(dǎo)致MMR受損但不會引起MSI[11]。

與傳統(tǒng)的Sanger法測序相比,第二代高通量測序技術(shù)具有通量高、速度快、費用低等優(yōu)點,結(jié)合特定核酸序列靶向富集技術(shù),可以實現(xiàn)對疾病最相關(guān)的基因進行深度測序。目前已有多種疾病的相關(guān)基因運用該技術(shù)進行了深度測序,并取得了一定的研究成果[12-14]。本研究對17例CRC病例和14例正常人樣本進行多重PCR靶向富集MMR基因外顯子序列,結(jié)合高通量測序技術(shù),檢測5個基因 (MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)的胚系突變,探討多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序在MMR基因胚系突變檢測中的應(yīng)用,以期為Lynch綜合征的臨床診斷和研究提供新的參考。

資 料 和 方 法

研究資料CRC患者17例,年齡63～81歲,其中男8例,女9例;健康志愿者14例,年齡30～50歲,其中男6例,女8例。CRC樣本由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供,正常人來自健康志愿者,所有患者及志愿者均知情同意,并簽署了經(jīng)上海市人類遺傳資源委員會批準的知情同意書。

靶向富集探針的設(shè)計使用在線引物設(shè)計工具探針 3設(shè)計PCR靶向富集MMR基因所需探針,對5個基因的73個外顯子總共11 419個堿基設(shè)計了87對探針,PCR擴增產(chǎn)物長度為257～528 bp,該組合探針能覆蓋5個MMR基因 (表1)的所有外顯子區(qū)域。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

MMR相關(guān)基因的靶向富集及高通量測序?qū)⒃O(shè)計和優(yōu)化的87對探針分成11組對樣本基因組DNA 進行多重PCR擴增,每組多重PCR的DNA模板量為50 ng,其中第1～8和11組使用多重PCR 5× Master Mix試劑盒(美國NEB公司)進行多重PCR擴增,第9和10組使用GB緩沖液擴增(日本TaKaRa公司LA Tag DNA聚合酶)試劑盒進行多重PCR擴增,擴增條件為:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性20 s、63 ℃退火60 s、68 ℃延伸30 s,30個循環(huán);68 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)AMpure磁珠(美國Beckman公司)純化后等量混合,取200 ng使用TflexTM快速DNA-Seq試劑盒(美國NEX公司)構(gòu)建測序文庫,然后用Miseq測序儀進行高通量測序。

表1　靶向富集探針設(shè)計參考序列信息表

生物信息學(xué)分析及Sanger測序法驗證測序數(shù)據(jù)分析使用Bowtie2軟件[15]與人類基因組參考序列 (hg19)進行比對,用SAM工具軟件[16]對結(jié)果進行突變篩查分析 (篩選條件:比對質(zhì)量>20且測序深度>100),用ANNOVAR軟件[17]對篩選的突變進行功能注釋。分析所得結(jié)果用Sanger法測序驗證。測序樣本的制備和Sanger測序由上海生工生物工程有限公司完成,測序所用試劑和儀器為BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing kit 和ABI 3730 測序儀。

結(jié)果

靶向富集及測序結(jié)果通過多重PCR靶向富集MMR基因和高通量測序,31個樣本共得到2.7 gigabases (Gb)數(shù)據(jù),平均每個樣本86 Mb,平均reads數(shù)為287 048。其中30個樣本的5個篩查基因 (MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)外顯子測序覆蓋度為100%,1個為96.8%,平均覆蓋度為99.9%,外顯子區(qū)域平均測序深度為2 284。經(jīng)過生物信息分析,31個測序樣本共發(fā)現(xiàn)13種非同義單核苷酸變異 (single nucleotide variation,SNV)、2種同義SNV,在非同義SNV中,位于MLH1基因的有3個:c.A655G:p.I219V、c.T1151A:p.V384D和c.C2101A:p.Q701K;位于MSH2基因的有3個:c.C1168T:p.L390F、c.A1690G:p.T564A和c.G2425A:p.E809K;位于MSH6基因的有3個:c.G116A:p.G39E、c.G3205C:p.G1069R和c.A3488T:p.E1163V;位于PMS2基因的有4個:c.G59A:p.R20Q、c.A1621G:p.K541E、c.C1408T:p.P470S和c.C1454A:p.T485K。2個同義SNV是MSH6基因c.T3306A和PMS2基因c.C780G;基因PMS1未檢測到SNV。這些SNV與數(shù)據(jù)庫dbSNP和InSight[18](http://www.insight-group.org/mutatioons)進行檢索,發(fā)現(xiàn)14種已經(jīng)報導(dǎo),其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R未見報導(dǎo) (表2)。

表2　MMR基因突變篩查結(jié)果

Sanger測序驗證為了驗證多重PCR靶向富集高通量測序的檢測結(jié)果,我們對每種單核苷酸變異類型選取了一個樣本進行了單管的PCR擴增,擴增產(chǎn)物純化后進行Sanger測序。單管PCR擴增及Sanger測序引物與多重PCR靶向富集高通量測序所用的引物相同。結(jié)果顯示:Sanger測序驗證結(jié)果與多重PCR靶向富集高通量測序結(jié)果一致 (圖1)。

討論

目前,新一代測序以其低成本、高通量的優(yōu)勢成為生命科學(xué)研究和臨床疾病基因檢測的重要工具,結(jié)合特定核算序列靶向富集技術(shù),可以更加高效經(jīng)濟的對疾病最相關(guān)的基因進行深度測序和研究。Keller等[19]應(yīng)用靶向富集高通量測序研究多形性成膠質(zhì)細胞瘤 (glioblastoma multiforme,GBM)SNP,結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)研究 (the genome-wide association study,GWAS)和已知的疾病相關(guān)聯(lián)SNP,發(fā)現(xiàn)一些SNP與吸煙、體質(zhì)指數(shù)、乳腺癌和高分級膠質(zhì)瘤相關(guān)聯(lián)。Ying等[20]運用目標區(qū)域捕獲高通量測序技術(shù)對6個苯丙酮尿癥相關(guān)基因 (PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1和GFRP)的所有外顯子進行了突變檢測,共發(fā)現(xiàn)了PAH基因中23個已知變異,以及6個PAH和PTS的新型突變。

CRC是我國最常見的惡性腫瘤之一,并有逐年上升的趨勢,部分CRC具有家族遺傳易感性。由于我國的計劃生育政策和城市化人口遷徙,家系正變得越來越小,家系成員也越來越趨于分散,這對遺傳性CRC的研究和診斷帶來一定的挑戰(zhàn)。因此,對普通CRC患者或健康人員進行遺傳學(xué)檢查,以確認或排除腫瘤遺傳易感性是具有一定應(yīng)用價值的。MMR基因的胚系突變被認為是最常見的遺傳性CRC-Lynch綜合征發(fā)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),檢測MMR基因種系突變能很好地預(yù)測Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的發(fā)生危險。目前檢測MMR基因突變的方法依然是單個基因逐一檢測且以一代測序為主[21-23],但此方法費時、通量低且價格昂貴,不適合臨床大樣本量的檢測,而高通量測序應(yīng)用于MMR基因檢測的報道極少。因此,我們設(shè)計了一套探針,通過多重PCR靶向富集MMR基因,結(jié)合高通量測序檢測MMR基因的胚系突變。

為了能夠有效的多重PCR靶向富集5個MMR基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2的外顯子序列,我們設(shè)計了87對探針,覆蓋了5個基因73個外顯子共11 419個堿基序列,PCR產(chǎn)物的長度為257～528 bp。設(shè)計的探針不僅包含了外顯子區(qū)域,也包含了外顯子與內(nèi)含子的結(jié)合位置,同時,這些探針具有相近的TM值,這樣多重PCR時可以使用相同的退火條件。經(jīng)過實驗優(yōu)化,我們將87對探針分成11組進行多重PCR,每組包含2～11對探針,其中第9、10組擴增區(qū)域GC含量較高,使用TaKaRa LA Tag with GC Buffer試劑盒能有效擴增,其余的多重PCR使用NEB MixMultiplex PCR 5× Master Mix試劑盒進行擴增。多重PCR反應(yīng)條件經(jīng)過多次實驗優(yōu)化后可使每對探針都能夠有效擴增,其擴增條件為:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性20 s、63 ℃退火60 s、68 ℃延伸30 s,30個循環(huán);68 ℃延伸5 min。多重PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后可進行測序文庫制備,在測序文庫構(gòu)建時加入標簽序列,可以實現(xiàn)多樣本的檢測。本研究使用了31種標簽序列,對17例CRC病例和14CRC正常人的樣本進行了標記。通過引入標簽序列,使得多樣本基因檢測更加高效快捷。以高通量測序平臺Miseq和一代Sanger測序平臺ABI 3730為例,我們將自己設(shè)計的多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序的方法和傳統(tǒng)的單管PCR-Sanger測序法檢測5個MMR基因外顯子所用時間和費用進行了比較。單管PCR-Sanger測序需對每個基因的外顯子進行單管PCR擴增,擴增產(chǎn)物純化后進行Sanger法測序,每檢測一個樣本的MMR基因胚系突變需要分別進行87個單管PCR及87個Sanger測序反應(yīng);多重PCR技術(shù)可同時擴增多個MMR基因外顯子序列,擴增產(chǎn)物純化后進行文庫構(gòu)建并測序,每檢測1個樣本只需11管多重PCR和1次文庫構(gòu)建。如表3所示:由于受合成引物費用的影響,當(dāng)檢測少量樣本時,例如檢測1個樣本,所產(chǎn)生的費用主要是引物合成費用;同時,二代測序儀運行通量高,每次運行可同時檢測上百個樣本,當(dāng)檢測單個樣本時需要和其他樣本混合測序,時間上比一代測序花費更多;但當(dāng)樣本數(shù)量達到100個或更多時,檢測時間和費用主要受限于PCR擴增和測序技術(shù),靶向富集結(jié)合高通量測序檢測MMR基因突變的時間和費用要遠遠小于單管PCR-Sanger法測序。因此,多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)是一套通量高、速度快、費用低的MMR基因突變篩查方法,適合臨床大樣本量的MMR基因突變篩查。

表3　MMR基因外顯子測序費用比較

利用多重PCR靶向富集高通量測序,我們在17例DRC病例和14例正常人的樣本中共發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域13種非同義單核苷酸變異、2種同義單核苷酸變異。與dbSNP數(shù)據(jù)庫進行檢索,發(fā)現(xiàn)MSH6的c.G3205C:p.G1069R為未報導(dǎo)的單核苷酸變異,其余14種為已報導(dǎo)單核苷酸變異。將這些已知單核苷酸變異位點進行數(shù)據(jù)庫ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)檢索發(fā)現(xiàn):位于MLH1基因第18外顯子c.C2101A:p.Q701K為致病或可能致病的突變;位于MSH2基因第14外顯子c.G2425A:p.E809K為致病性不確定的突變;其余10種非同義單核苷酸變異為可容忍的變異,可能與CRC的發(fā)生沒有關(guān)聯(lián)。致病或可能致病的突變c.C2101A:p.Q701K由范怡梅等[22]于2005年首次發(fā)現(xiàn),并在隨后的功能分析表明此變異造成MLp和PMS2互動效率降低,可能提高突變攜帶者患胃腸腫瘤的風(fēng)險[24]。在另一項研究中,c.C2101A:p.Q701K在2例腫瘤樣本中檢測出,而在100例非腫瘤對照樣本中并沒有發(fā)現(xiàn)該突變,同時對這兩例攜帶該突變的腫瘤樣本進行MSI檢測,5個常規(guī)位點檢測出4個陽性結(jié)果[25]。本研究在一例健康人 (年齡<50歲)中檢測出該突變,提示該志愿者有可能存在腫瘤遺傳易感性,應(yīng)詢問是否有患病家族史,并做進一步的檢測 (IHC或者MSI)和隨訪;致病性不確定的突變c.G2425A:p.E809K在1例CRC患者中檢測出,同時檢索1 000 Genomes Projects (2012 release)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該等位基因的頻率只有0.000 5,經(jīng)Mutation Taster預(yù)測該單核苷酸變異為有害變異[26],可能會影響MMR的功能,提示該變異可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。在本研究中新發(fā)現(xiàn)一種單核苷酸變異,即位于MSH6的第5外顯子c.G3205C:p.G1069R,此變異在1例CRC患者中檢測出,經(jīng)Mutation Taster預(yù)測該單核苷酸變異為有害變異,推測可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。然而,進一步的功能分析研究是必要的,以確認MSH2基因c.G2425A:p.E809K和MSH6基因c.G3205C:p.G1069R的臨床意義。每種類型的非同義SNV我們都挑選了一個樣本進行Sanger測序,結(jié)果與高通量測序一致,表明靶向富集高通量測序技術(shù)對于發(fā)現(xiàn)MMR基因的胚系突變具有高度的準確性。

多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)用于MMR基因的外顯子突變檢測準確且經(jīng)濟、高效,其與臨床表型對照研究,可為Lynch綜合征遺傳風(fēng)險的評估和治療方案的制定提供新的參考。

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Distinct mutations ofMMRgene in colorectal cancer by targeted enrichment and high-throughput next generation sequencing

HUANG Kai1,2,CHEN Hui-jie3,LIU Fang-qi4,XU Ye4,LI Xuan5,NAN Peng1△

(1MinistryofEducationKeyLaboratoryforBiodiversityScienceandEcologicalEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China;2Tongji-SCBITBiotechnologyCo.,Ltd.,Shanghai200080,China;3ShanghaiCenterforBioinformationTechnology,Shanghai201203,China;4DepartmentofColorectalSurgery,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China;5InstituteofPlantPhysiologyandEcology,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo detect the germline mutations of mismatch repair (MMR) genes in colorectal cancer (CRC) using targeted enrichment and high-throughput next generation sequencing,and to explore its applications in research and clinical diagnosis of Lynch syndrome.MethodsGenomic DNA was extracted from 17 patients diagnosed with colorectal cancer and 14 healthy adults, Primers,which could amplify all the 73 exons and flanking regions of 5 MMR genes (MLH1,

MSH2,MSH6,PMS1,PMS2) by multiplex PCR were designed and optimized,PCR products were then sequenced by Illumina Miseq sequencer.ResultsWe obtained approximately 2.7 giga-base sequence data,and the average reads number of individual samples was 287048.On average,82.18% of the reads could be mapped to the reference human genome (HG19).Average coverage and sequencing depth of targeted regions were 99.9% and 2282-fold respectively.After bioinformatic analysis,we found 14 previously annotated single-nucleotide variants (SNVs) in 5 mismatch repair (MMR) genes and 1 novel mutations inMSH6 genes (c.G3205C:p.G1069R).These results were confirmed by sanger sequencing.ConclusionsTargeted enrichment combined with high-throughput next generation sequencing can be used to detect mutations in MMR genes with high sensitivity and lower cost than conventional methods.

【Key words】mismatch repair gene;lynch syndrome;targeted enrichment;high-throughput sequencing

(收稿日期:2015-07-24;編輯:段佳)

【中圖分類號】R735.3，Q781

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.014

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目 (2012CB316501);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目 (2012AA02A602)；國家自然科學(xué)基金 (31271409，31401128)

△Corresponding authorE-mail:nanpeng@fudon.edu.cn