喉腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)原代喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞體外生長

王　媚　吳春萍　曹曉娟　鄭文偉　范國康

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科　杭州　310009;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科　上?！?00071;

3復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科　上?！?00031;4嘉興學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科　嘉興　314000)

?

喉腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞促進(jìn)原代喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞體外生長

王媚1,2▲吳春萍3▲曹曉娟4鄭文偉4范國康1△

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科杭州310009;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科上海200071;

3復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科上海200031;4嘉興學(xué)院附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科嘉興314000)

【摘要】目的驗證喉腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)對原代培養(yǎng)的喉鱗狀細(xì)胞癌 (laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)細(xì)胞的體外生長是否有促進(jìn)作用。方法選取20例喉癌臨床標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng),將生長出的原代喉癌細(xì)胞中的CAFs通過差速消化法去除后繼續(xù)單獨培養(yǎng),相差顯微鏡觀察喉癌細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞儀檢測喉癌細(xì)胞在傳代過程中凋亡細(xì)胞比例的變化,Western blot檢測喉癌細(xì)胞在傳代過程中凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)水平的變化,以始終與CAFs共培養(yǎng)傳代的喉癌細(xì)胞作為對照。結(jié)果與CAFs分離后喉癌原代細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)過程中生長活性很快下降,多數(shù)在3代以內(nèi)停止生長。相差顯微鏡觀察到形態(tài)學(xué)上凋亡漂浮的喉癌細(xì)胞逐代增多,流式細(xì)胞儀檢測到的凋亡細(xì)胞比例逐代增加,Western blot檢測到的Caspase 3表達(dá)水平逐代增加;而始終與CAFs共培養(yǎng)生長的LSCC細(xì)胞在傳代過程中生長活性卻無明顯下降 (P<0.05)。結(jié)論喉腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞對體外原代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞的生長具有明顯的促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞;喉鱗狀細(xì)胞癌;原代培養(yǎng);凋亡

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境中非常重要的基質(zhì)細(xì)胞成份,通過分泌多種生長因子、炎性因子、調(diào)控抗腫瘤免疫以及與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用來調(diào)控腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移[1-4]。文獻(xiàn)表明,多種實體瘤的CAFs均能夠促進(jìn)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的體外增殖及侵襲等能力[5-7],但目前相關(guān)研究均是用實體腫瘤已建成的細(xì)胞系通過體外培養(yǎng)來進(jìn)行的,而CAFs對于相應(yīng)原代腫瘤細(xì)胞是否具有類似的調(diào)控作用國內(nèi)外尚未見報道。

我們的前期研究已經(jīng)在原代喉癌標(biāo)本組織[8]及喉癌裸鼠移植瘤標(biāo)本[9]中成功分離出了CAFs,發(fā)現(xiàn)其對于喉癌細(xì)胞系HEp-2細(xì)胞具有明確的促進(jìn)生長、侵襲及成瘤作用,本研究擬在此基礎(chǔ)之上進(jìn)一步研究喉癌標(biāo)本組織中的CAFs對喉癌原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞是否具有體外促進(jìn)生長的功能。此外,我們在之前的原代培養(yǎng)建系[10]過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)原代喉癌組織中的CAFs似乎能夠明顯抑制喉癌原代腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)時的凋亡進(jìn)程。為了證實這一假設(shè),設(shè)計了本文的研究實驗,將原代培養(yǎng)的喉癌組織中的喉癌細(xì)胞和CAFs共培養(yǎng)及分離培養(yǎng),從形態(tài)學(xué)到分子生物學(xué)水平檢測共培養(yǎng)及分離培養(yǎng)兩種條件下喉癌細(xì)胞凋亡程度的變化。我們發(fā)現(xiàn),沒有CAFs的共培養(yǎng),喉癌細(xì)胞很快發(fā)生凋亡,反之,喉癌細(xì)胞幾乎不發(fā)生凋亡,表明CAFs對原代培養(yǎng)的喉癌細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的生長可以起到?jīng)Q定性的抗凋亡作用。這樣的結(jié)果與目前文獻(xiàn)報道的CAFs對實體腫瘤細(xì)胞系的生長和侵襲僅具有部分促進(jìn)作用不同。

臨床腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中也存在著相似的現(xiàn)象。單個腫瘤細(xì)胞脫離原先生長的腫瘤微環(huán)境進(jìn)入血液循環(huán),然后進(jìn)入非腫瘤組織的“轉(zhuǎn)移灶”生長,新的“轉(zhuǎn)移灶”沒有之前適合的生長條件,轉(zhuǎn)移而來的腫瘤細(xì)胞的生長與體外原代培養(yǎng)類似,在生長增殖初期非常容易凋亡。而“轉(zhuǎn)移灶”可以有先于腫瘤細(xì)胞存在的CAFs,它們與原發(fā)腫瘤部位的CAFs有不同的起源[11-12],可能會對轉(zhuǎn)移而來的腫瘤細(xì)胞的凋亡起到強(qiáng)有力的抑制作用,進(jìn)而促進(jìn)“轉(zhuǎn)移灶”的成功生長。因此,如果能夠在轉(zhuǎn)移早期針對CAFs進(jìn)行靶向治療,將有希望抑制轉(zhuǎn)移而來的腫瘤細(xì)胞的早期增殖,將“轉(zhuǎn)移灶”消滅在萌芽狀態(tài)。本文的研究結(jié)果將為此種靶向治療提供初步的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

喉癌標(biāo)本的原代培養(yǎng)采集20例確診為喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squameus cell carcinoma,LSCC)的患者標(biāo)本,所有標(biāo)本的采集均得到復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。患者中聲門上型16例,聲門型4例,均為男性,年齡45～63歲。將所采集喉癌標(biāo)本組織用生理鹽水充分漂洗后依次在含有聚維酮碘 (1∶10稀釋)、硫酸慶大霉素 (1∶8稀釋)及鹽酸林可霉素 (1∶8稀釋)的生理鹽水中浸泡5 min,再將腫瘤組織充分剪碎至體積約1～2 mm3大小,移入含有Ⅳ型膠原酶 (200 U/mL,美國Sigma公司)的離心管，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中消化過夜。再將過夜消化后的細(xì)胞懸液離心 (147 576×g,5 min,以下同),棄去上清。然后用PBS緩沖液洗滌離心3次后加入含1%青鏈雙抗 (美國Sigma公司)及10%胎牛血清 (FBS,美國Invitrogen公司)的BEGM培養(yǎng)液 (瑞士Lonza公司)收集于6 mm培養(yǎng)皿中,置入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7天后取出，置于倒置相差顯微鏡下觀察有無污染,細(xì)菌污染可見較多活動的微生物,真菌污染可見大量真菌絲,有污染的培養(yǎng)皿立即丟棄,重新采集標(biāo)本進(jìn)行同法培養(yǎng)。

CAFs的去除及原代LSCC細(xì)胞的傳代培養(yǎng)培養(yǎng)出的原代LSCC細(xì)胞及CAFs是共生長的,當(dāng)兩者即將鋪滿培養(yǎng)皿底壁時需要進(jìn)行胰酶消化傳代培養(yǎng)。實驗組利用差速消化法去除CAFs:吸去培養(yǎng)液上清,用PBS洗滌后每6 cm培養(yǎng)皿 (美國Corning公司)加入約1～2 mL胰酶 (美國Invitrogen公司)消化液,在相差顯微鏡下觀察當(dāng)CAFs從長梭形收縮變成橢圓形,輕輕晃動可從培養(yǎng)皿底部脫落時立即加入含血清的培養(yǎng)液2 mL終止消化,棄去消化液,用PBS洗滌3次。LSCC細(xì)胞對胰酶消化反應(yīng)差,仍貼壁于培養(yǎng)皿中,加入BEGM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至匯合時可進(jìn)行傳代。對照組的培養(yǎng)皿在消化時不將CAFs去除,原代LSCC細(xì)胞及CAFs始終共同消化和接種培養(yǎng)。

LSCC細(xì)胞及CAFs免疫熒光鑒定將消化后收集的LSCC細(xì)胞及CAFs接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理后的載玻片 (武漢博士德生物工程有限公司),培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞已全部貼壁。棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌后置入4%多聚甲醛中固定15 min,再用10%羊血清封閉液 (含或不含0.3% Triton X-100)室溫封閉40 min,隨后加入如下兔抗人一抗:廣譜角蛋白 (pan-CK) (1∶400;美國Abcam公司)或波形蛋白 (vimentin) (1∶200;美國Abcam公司)或α平滑肌肌動蛋白 (α-SMA) (1∶200;美國Abcam公司)或成纖維細(xì)胞活化蛋白 (FAP) (1∶250;美國Abcam公司) 4 ℃過夜孵化。次日PBS洗滌玻片后置入FITC或CyTM3熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG (H+L) (1∶100,美國Jackson ImmunoResearch公司)室溫避光孵化1 h。PBS洗滌后常規(guī)DAPI (武漢博士德生物工程有限公司)染核,顯微鏡觀察及拍照。

傳代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察將去除了CAFs的LSCC細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化傳代培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡觀察每代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)變化并進(jìn)行拍照。凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征為細(xì)胞由原先的鵝卵石樣貼壁狀態(tài)變得非常扁平,細(xì)胞周圍折光度消失,最終失去貼壁能力而漂浮于培養(yǎng)液中。始終與CAFs共培養(yǎng)傳代的LSCC細(xì)胞為對照。

傳代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞流式細(xì)胞儀凋亡檢測利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 (南通碧云天生物技術(shù)研究所)進(jìn)行凋亡檢測,把培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液吸出置于離心管內(nèi),PBS洗滌3遍,加入胰酶消化液1～2 mL,顯微鏡下觀察至細(xì)胞收縮變圓時將之前收集的培養(yǎng)液加入并終止消化,輕輕吹打使貼壁細(xì)胞脫落,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心5 min,棄上清。PBS重懸,取5萬～10萬重懸細(xì)胞,離心,棄上清,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕吹打,重懸細(xì)胞,再加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕吹打,最后加入10 μL碘化丙啶染液,輕輕混勻。室溫避光孵育15 min,隨后置于冰浴中。上機(jī)進(jìn)行流式儀檢測。

傳代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞Caspase 3表達(dá)水平的Western blot檢測同上法收集懸于培養(yǎng)液中的細(xì)胞及貼壁細(xì)胞,離心,棄上清。加入約0.5 mL含1%PMSF的RIPA裂解液,充分吹打裂解細(xì)胞,4 ℃離心(12 000×g,5 min),取上清。BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體[兔抗人Caspase 3(1∶5 000,美國Abcam公司)及HRP標(biāo)記羊抗兔IgG (H+L)(1∶2 000,美國Jackson Immuno Research公司)]孵育及顯影。

結(jié)果

20例LSCC原代培養(yǎng)標(biāo)本中發(fā)生污染的有4例,未污染的16例,16例中與CAFs分離后LSCC細(xì)胞單獨培養(yǎng)均在4代以內(nèi)停止生長,其中1代停止生長的5例,2代停止生長的7例,3代停止生長的2例,4代停止生長的2例,以下實驗結(jié)果為4代停止生長的2例。

LSCC細(xì)胞及CAFs免疫熒光鑒定LSCC細(xì)胞為pan-CK陽性,而Vimentin陰性,表明其為上皮來源。相反,CAFs為pan-CK陰性,而Vimentin陽性,表明其為間質(zhì)來源。此外CAFs為FAP及α-SMA陽性,該兩種蛋白為CAFs特異性蛋白,進(jìn)一步證實了其CAFs身份 (圖1)。

傳代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與CAFs分離后LSCC細(xì)胞在傳代過程中形態(tài)學(xué)發(fā)生顯著變化,未傳代的原代LSCC細(xì)胞呈鵝卵石樣貼壁生長,形態(tài)飽滿,折光度好,可分散生長;傳代后LSCC細(xì)胞常成簇生長,形態(tài)逐漸變得扁平,折光度下降,胞質(zhì)出現(xiàn)較大的空泡,貼壁能力下降,最終失去貼壁能力而漂浮于培養(yǎng)液中。始終與CAFs共培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞在傳代過程中形態(tài)學(xué)無顯著變化 (圖2)。

傳代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞流式細(xì)胞儀凋亡檢測流式細(xì)胞儀檢測到脫離了CAFs單獨培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞凋亡細(xì)胞的比例隨傳代而逐代增加,傳至第3代時,其早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞的總和已達(dá)到近80%,而始終與CAFs共培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞在傳代過程中最終僅檢測到微量凋亡細(xì)胞 (P<0.05,圖3)。

傳代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞Caspase 3表達(dá)水平的Western blot檢測與CAFs分離培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞Caspase 3蛋白表達(dá)水平隨傳代而逐代增加,而始終與CAFs共培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞在傳代過程中僅檢測到微量Caspase 3表達(dá) (P<0.05,圖4)。

The LSCC cells showed positive staining of pan-CK (A) and negative staining of Vimentin (B).In addition,the CAFs showed negative staining of pan-CK (C) and positive staining of Vimentin (D), α-SMA (E),and FAP (F).

圖1LSCC細(xì)胞及其相關(guān)成纖維細(xì)胞免疫細(xì)胞熒光鑒定

Fig 1Authentication of LSCC cells and CAFs using immunocytochemical staining

The LSCC cells cocultured with CAFs showed no significant morphalogical changes at primary (A), passage 1 (B), passage 2 (C),and passage 3 (D).In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed significant morphalogical changes at primary (E), passage 1 (F), passage 2 (G),and passage 3 (H) including:increasingly flattened outline,decreased capacity to attach to the flask,and increased apoptotic cells floating in the medium.Noteworthy,apoptotic cells with huge cytoplasmic vacuolewas observed (yellow arrow).

圖2兩種方法體外傳代培養(yǎng)過程中LSCC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

Fig 2Morphalogical changes of LSCC cells in two differentinvitroculture systems

The flow cytometry detected consistently few apoptotic LSCC cells at primary (B), passage 1 (C), passage 2 (D),and passage 3 (E) when cocultured with CAFs.In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed increasingly upregulated proportion of apoptotic cells at primary (G), passage 1 (H), passage 2 (I),and passage 3 (J). A and F：Blank control. K and L：Statistical analysis of apoptotic cells in two different culture system.(1)P<0.05.

圖3兩種方法體外傳代培養(yǎng)過程中LSCC細(xì)胞凋亡比例的變化

Fig 3Changes of apoptotic LSCC cells quantified by the flow cytometry in two differentinvitroculture systems

A：The LSCC cells cocultured with CAFs showed consistently low expression of Caspase 3 at primary,passage 1,passage 2,and passage 3. B：In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed increasingly enhanced expression of Caspase 3 from primary to passage 3. C and D：Statistical analysis of relative protein expression of LSCC cells in two different culture system.(1)P<0.05.

圖4兩種方法體外傳代培養(yǎng)過程中LSCC細(xì)胞Caspase 3表達(dá)水平的變化

Fig 4Changes of LSCC cells Caspase 3 detected by Western blot in two differentinvitroculture systems

討論

CAFs是近年來腫瘤研究研究的熱點,文獻(xiàn)報道的相關(guān)研究均采用實體腫瘤的細(xì)胞系進(jìn)行體外培養(yǎng),不同類型實體瘤中的CAFs均有部分促進(jìn)相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系生長和侵襲的作用[5-7]。本文在前期研究LSCC細(xì)胞系的基礎(chǔ)上進(jìn)一步收集LSCC標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)并分離LSCC組織中的CAFs及原代LSCC細(xì)胞,用來驗證LSCC組織中的CAFs對LSCC原代細(xì)胞是否具有相似的促進(jìn)生長的作用及其強(qiáng)弱程度。本研究所選取的20例LSCC標(biāo)本原代培養(yǎng)未污染的16例,與CAFs分離后LSCC細(xì)胞傳代過程中很快凋亡,均在4代以內(nèi)停止生長,而與CAFs共培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞在體外的培養(yǎng)活性始終無明顯下降。我們分別從形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀凋亡比例檢測及Caspase 3蛋白表達(dá)水平檢測進(jìn)一步進(jìn)行了研究。

我們首先對分離培養(yǎng)的LSCC原代細(xì)胞及CAFs進(jìn)行了免疫細(xì)胞熒光鑒定,發(fā)現(xiàn)LSCC細(xì)胞為pan-CK陽性,而Vimentin陰性,表明其為上皮來源,與文獻(xiàn)報道的鱗癌免疫染色結(jié)果一致[13]。相反,CAFs為pan-CK陰性,而Vimentin陽性,表明其為成纖維細(xì)胞來源[14]。此外,根據(jù)文獻(xiàn)報道,我們還進(jìn)一步選取了FAP及α-SMA兩個CAFs特異性蛋白進(jìn)行染色[15],發(fā)現(xiàn)兩種蛋白染色均為陽性,進(jìn)一步證實了我們所培養(yǎng)LSCC組織中的成纖維細(xì)胞的確為CAFs。

我們用相差顯微鏡觀察了LSCC細(xì)胞在脫離了CAFs后單獨體外培養(yǎng)傳代時的形態(tài)學(xué)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與CAFs分離后單獨培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞在傳代過程中很快發(fā)生凋亡,伴隨著形態(tài)學(xué)的顯著變化,從之前的鵝卵石樣貼壁生長變得越來越扁平,胞質(zhì)出現(xiàn)巨大空泡,并且貼壁能力明顯下降,最終漂浮于培養(yǎng)液中。相比之下,一直與CAFs共培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞在傳代過程中形態(tài)學(xué)無顯著變化。我們在文獻(xiàn)中尚未見類似的形態(tài)學(xué)變化報道。

通過流式細(xì)胞儀定量檢測了LSCC細(xì)胞在體外傳代培養(yǎng)過程中的凋亡細(xì)胞比例變化發(fā)現(xiàn):在有CAFs共培養(yǎng)的條件下,LSCC細(xì)胞在傳代過程中始終僅檢測到微量凋亡細(xì)胞;相比之下,無 CAFs的輔助培養(yǎng),LSCC細(xì)胞在傳代過程中很快凋亡,傳至第3代時,其早期及晚期凋亡細(xì)胞的總和已達(dá)到近80% (P<0.05)。

最后,我們借助于Western blot對兩種培養(yǎng)條件下的LSCC細(xì)胞Caspase 3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)在沒有CAFs輔助培養(yǎng)的條件下,LSCC細(xì)胞Caspase 3蛋白表達(dá)水平隨傳代而逐代增加;反之,LSCC細(xì)胞在傳代過程中Caspase 3表達(dá)的表達(dá)水平無明顯變化,始終僅檢測到微量表達(dá) (P<0.05)。

綜上所述,我們在前期實驗研究結(jié)合文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)之上提出了CAFs對LSCC原代細(xì)胞的體外培養(yǎng)具有非常重要的抗凋亡作用的假設(shè),通過實驗設(shè)計進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)到細(xì)胞分子生物學(xué)水平進(jìn)行了驗證,證實了這一假設(shè)的正確性,在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見類似報道。我們的實驗發(fā)現(xiàn)與目前文獻(xiàn)報道的結(jié)果存在不同之處。已發(fā)表的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)CAFs對腫瘤細(xì)胞系起到的作用僅僅是促進(jìn)部分生長和侵襲轉(zhuǎn)移能力,而本文得到的結(jié)果卻不僅僅是促進(jìn)部分生長的能力,而是沒有CAFs的輔助培養(yǎng),脫離了原先腫瘤微環(huán)境的原代LSCC細(xì)胞無法存活。得出這樣不同結(jié)果的原因與我們所用的材料是原代培養(yǎng)的LSCC細(xì)胞而不是腫瘤細(xì)胞系有關(guān)。腫瘤細(xì)胞系與原代腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)特性上存在巨大差異,已經(jīng)建成的腫瘤細(xì)胞系幾乎能夠無限傳代而活力不減,因為它們已經(jīng)經(jīng)歷了建系的體外培養(yǎng)篩選,然而大多數(shù)原代腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)的傳代過程中增殖活性逐代下降,很快發(fā)生凋亡而在建系過程中被淘汰。例如,1973年Giard等[16]報道了200例人腫瘤標(biāo)本原代培養(yǎng)建系工作,建成腫瘤細(xì)胞系13個,總體成功率僅約6.5%。本研究用與文獻(xiàn)報道不同的研究材料——原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,得出了與文獻(xiàn)報道不同的研究結(jié)論，CAFs對LSCC原代腫瘤細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的生長起到?jīng)Q定性的促進(jìn)生長作用而不是部分促進(jìn)作用。我們認(rèn)為,這樣的結(jié)論應(yīng)該更貼近臨床LSCC患者的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性,為消滅臨床早期轉(zhuǎn)移灶的靶向治療提供了部分實驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]XING F,SAIDOU J,WATABE K.Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment[J].FrontBiosci(LandmarkEd),2010,15:166-179.

[2]POLANSK UM,OORIMO A.Carcinoma-associated fibroblasts:non-neoplastic tumour-promoting mesen-chymal cells[J].JCellPhysiol,2013,228 (8):1651-1657.

[3]SERVAIS C,EREZ N.From sentinel cells to inflammatory culprits:cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation[J].JPathol,2013,229 (2):198-207.

[4]HARPES J,SAINSON RC.Regulation of the anti-tumour immune response by cancer-associated fibroblasts[J].SeminCancerBiol,2014,25:69-77.

[5]ROUTARY S,SUNKAVALI A,BARI KA.Carcinoma-associated fibroblasts,its implication in head and neck squamous cell carcinoma:a mini review[J].OralDis,2014,20 (3):246-253.

[6]WANG J,MIN A,GAO S,etal.Genetic regulation and potentially therapeutic application of cancer-associated fibroblasts in oral cancer[J].JOralPatholMed,2014,43 (5):323-334.

[7]HUANG L,XU AM,LIU S,etal.Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors[J].WorldJGastroenterol,2014,20 (47):17804-17818.

[8]DU HD,WU CP,ZHOU L,etal.Separation and cultivation of laryngeal carcinoma-associated fibroblasts and biological influence on a laryngeal carcinoma cell line[J].ActaOtolaryngol,2013,133 (7):755-760.

[9]WANG M,WU CP,PAN JY,etal.Cancer-associated fibroblasts in a human HEp-2 established laryngeal xenografted tumor are not derived from cancer cells through epithelial-mesenchymal transition,phenotypically activated but karyotypically normal[J].PLoSOne,2015,10 (2):e117405.

[10]WU CP,ZHOU L,GONG HL,etal.Establishment and characterization of a novel HPV-negative laryngeal squamous cell carcinoma cell line,FD-LSC-1,with missense and nonsense mutations of TP53 in the DNA-binding domain[J].CancerLett,2014,342 (1):92-103.

[11]AUGSTEN M.Cancer-associated fibroblasts as another polarized cell type of the tumor microenvironment[J].FrontOncol,2014,4:62.

[12]TOMMELEIN J,VERSEL L,BOTERBERG T,etal.Cancer-associated fibroblasts connect metastasis-promoting communication in colorectal cancer[J].FrontOncol,2015,5:63.

[13]FERREIRA MB,DE SOUZA JA,COHEN EE.Role of molecular markers in the management of head and neck cancers[J].CurrOpinOncol,2011,23 (3):259-264.

[14]KALLURI R,ZEISBERG M.Fibroblasts in cancer[J].NatRevCancer,2006,6 (5):392-401.

[15]RASANEN K,VAHERI A.Activation of fibroblasts in cancer stroma[J].ExpCellRes,2010,316 (17):2713-2722.

[16]GIARD DJ,AARKONSON SA,TODARO GJ,etal.Invitrocultivation of human tumors:establishment of cell lines derived from a series of solid tumors[J].JNatlCancerInst,1973,51 (5):1417-1423.

Laryngeal cancer associated fibroblasts promote the growth of primarily cultured laryngeal squamous cell carcinoma cellsinvitro

WANG Mei1,2▲,WU Chun-ping3▲,CAO Xiao-juan4,ZHENG Wen-wei4,FAN Guo-kang1△

(1DepartmentofOtolaryngology,SecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,ZhejiangProvince,China;2DepatmentofOtolaryngology,ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China;3DepartmentofHeadandNeckSurgery,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China;4DepartmentofOtolaryngology,SecondAffiliatedHospital,JiaxingUniversityCollegeofMedicine,Jiaxing314000,ZhejiangProvince,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore whether the laryngeal cancer associated fibroblasts (CAFs) can promote the growth of primarily cultured laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) cells in vitro.MethodsTwenty LSCC specimens were collected and primarily cultured.The LSCC cells growing out of the seeded tissue fragments were separated from the CAFs by differential trypsinization and subcultured continually.The inverted phase-contrast microscope was used to observe the morphological change of the cultured LSCC cells,flow cytometry was used to quantify the proportion of Apoptotic cells,and Western blot was used to detect the protein level of Caspase 3.The LSCC cells cocultured with CAFs consistently serverd as controls.ResultsFor the LSCC cells separated from CAFs,proliferation capacity decreased rapidly in the passage culture in vitro,and the most cells were terminated within the 3 generations.The apoptotic and floating LSCC cells observed by the phase-contrast microscope,the percentage of apoptotic cells quantified by the flow cytometry,and the protein level of Caspase 3 detected by Western blot increased gradually.By contrast,no significant differences of proliferation capacity of the LSCC cells cocultured with CAFs were detected during the in vitro subculture system (P<0.05).ConclusionsThe laryngeal CAFs can promote the growth of primarily cultured LSCC cells in vitro.

【Key words】cancer associated fibroblasts;laryngeal squamous cell carcinoma;primary culture;apoptosis

(收稿日期:2015-07-24;編輯:沈玲)

【中圖分類號】R739.65

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.009

▲Co-first authors

△Corresponding authorE-mail:fanguokang@163.com