丙泊酚對膿毒癥小鼠脾臟樹突細(xì)胞亞群比例及IFN-γ、IL-10的影響

王桂嶺　劉艷麗　劉　曉　劉慶陽　徐凱智

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院　河北唐山　063000；①北京煤炭總醫(yī)院

?

丙泊酚對膿毒癥小鼠脾臟樹突細(xì)胞亞群比例及IFN-γ、IL-10的影響

王桂嶺劉艷麗劉曉劉慶陽①徐凱智

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院河北唐山063000；①北京煤炭總醫(yī)院

[摘要]①目的探討丙泊酚對膿毒癥小鼠脾臟樹突細(xì)胞亞群比例及炎癥細(xì)胞因子-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)的影響。②方法采用盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)制作膿毒癥模型，將60只C57BL/6小鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、丙泊酚組(Propofol 5mg/kg，P組)和生理鹽水組(normal saline，NS組)。模型制備成功后P組和NS組分別給予等量的1%丙泊酚和生理鹽水腹腔內(nèi)注射，分別在給藥后0、6、12、24、36h眼球取血后頸椎離斷法處死小鼠，無菌條件下取出小鼠脾臟，磁珠分選獲得樹突細(xì)胞(DC)，流式細(xì)胞儀檢測樹突細(xì)胞亞型比例改變，ELISA法檢測各組小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-r、IL-10水平。③結(jié)果與NS組比較，6h時P組R1經(jīng)典樹突細(xì)胞R1數(shù)量變化不顯著，而在12h，P組的R1數(shù)量較NS組降低，在12、24、36h時調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞R2數(shù)量顯著增加；與此同時，細(xì)胞因子水平檢測結(jié)果是：各時間點與Sham組相比，P組和NS組IFN-γ和IL-10水平均顯著增加(P<0.05)；而與NS組相比，從6h開始P組各時間點的IFN-γ降低，IL-10水平升高(P<0.05)。④結(jié)論膿毒癥早期細(xì)胞因子分泌均增加，丙泊酚在一定程度上可以通過增加R2比例及增加具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10含量來抑制早期炎癥反應(yīng)，從而降低膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)而影響預(yù)后。

[關(guān)鍵詞]丙泊酚樹突細(xì)胞免疫炎癥細(xì)胞因子白介素

膿毒癥是由感染因素誘發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，是繼發(fā)于嚴(yán)重?zé)隣C傷、休克及大手術(shù)等的常見并發(fā)癥，成為臨床危重患者的主要死亡原因之一。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，但是膿毒癥依舊是目前ICU病房面臨的棘手問題。大量的研究顯示，膿毒癥的發(fā)生與免疫功能紊亂密切相關(guān)[1]。樹突細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是唯一能激活初始T淋巴細(xì)胞的功能強大的專職抗原遞呈細(xì)胞，同時也是機體免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞，在建立T細(xì)胞免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用[2]。近年來, 有實驗從白細(xì)胞介素(IL-10)轉(zhuǎn)基因小鼠和正常BALB/c、C57BI/6小鼠的脾臟內(nèi)分離出一個DC亞群CD11clowCD45RBhighDCs，該亞群與傳統(tǒng)DC的區(qū)別主要是低表達(dá)CD11C和共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子，高表達(dá)CD45RB，激活后主要通過分泌IL-10發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能[3]。丙泊酚作為ICU危重患者的鎮(zhèn)靜治療藥物，近年來越來越受到重視，并且隨著對丙泊酚研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其除了麻醉效應(yīng)之外還存在一些其他效應(yīng)，包括器官保護作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抑制血小板聚集、抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化作用等[4]。本研究擬從樹突細(xì)胞亞群角度對比觀察丙泊酚能促進早期膿毒癥小鼠脾臟樹突細(xì)胞向調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞亞型分化，并能影響炎癥細(xì)胞因子-γ(IFR-γ)、IL-10分泌從而驗證其對膿毒癥的免疫調(diào)節(jié)作用，為丙泊酚的進一步臨床應(yīng)用提供理論支持。

1實驗動物與方法

1.1實驗動物雄性清潔級BalB/c小鼠60只,體質(zhì)量(20±1)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司)，常規(guī)喂養(yǎng)，實驗前12h禁食，自由飲水。

1.2試劑膠原酶D(美國Sigma公司)，小鼠淋巴細(xì)胞分離液(北京昊成天翔商貿(mào)有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液與熱滅活胎牛血清(北京思塞因科技有限公司)，DC陰選試劑盒(美國BD公司)，小鼠抗DC(CD11c微磁珠)，DC表面單克隆熒光抗體Fc阻斷劑-純化大鼠抗小鼠CD16/CD32(FcγIII/II-R)抗體、抗CD11c單克隆抗體-別藻藍(lán)蛋白(CD11c-APC)、抗CD45RB單克隆抗體-藻紅蛋白(CD45RB-PE)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠CD40、CD80、CD86、I-a/e(美國BD Biosciences Pharmingen公司)。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組。膿毒癥模型制備及分組：將60只BalB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為3組：Sham組、丙泊酚組(P組)和生理鹽水組(NS組)。每組20只，其中P組和NS組按盲腸結(jié)扎穿孔法(Cecal ligation puncture， CLP)制備膿毒癥模型，Sham 組僅開腹翻動盲腸。術(shù)后禁食12h，自由飲水。造模成功，NS組和丙泊酚組分別給予等量的生理鹽水和丙泊酚(5mg/mL)腹腔注射,Sham組不作任何處理。所有動物按0、6、12、24、36h被評價，每個時間點為4只小鼠。

1.3.2標(biāo)本采集與處理。分別在每個時間點摘除眼球取血0.5～1.0mL，離心后留血清-20℃下保存待測。之后，固定小鼠于仰臥位，沿腹中線依次切開皮膚、腹壁各層進入腹腔，暴露脾臟，鈍性取去被膜脾臟，置入盛有PBS液的平皿中用于提取樹突狀細(xì)胞。

1.3.3小鼠脾細(xì)胞的分離及單個核細(xì)胞的制備。留取脾臟，剪碎組織，用研磨棒于220目金屬網(wǎng)上研磨。將細(xì)胞懸液貼15mL離心管壁小心加入到小鼠淋巴細(xì)胞分離液上，20℃、1500r/min離心15min，吸取中層絮狀物，置于離心管中，加4倍D-PBS緩沖液重懸，4℃、1000r/min離心10min，去除多余的淋巴細(xì)胞分離液，所得細(xì)胞即為小鼠脾臟單個核細(xì)胞。

1.3.4磁珠孵育和磁性分選脾臟CD11clowCD45RBhighDCs。使用DCs陰選試劑盒分選獲得DCs，具體操作嚴(yán)格按說明書進行。富集的小鼠脾臟DCs不含抗體及磁珠，細(xì)胞計數(shù)后用于后續(xù)實驗。CD11clowCD45RBhighDCs的純化通過抗CD11c磁珠選出。

1.3.5熒光抗體染色。將4中的CD11clowCD45RBhighDCs孵育24h，連同孵育液一并加入流式管，離心，吸取上清，-70℃保存。加入100μL PBS重懸離心后沉淀的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個/mL，加入Fc阻斷劑1μL，4℃孵育15min；分別加入5μL CD11c-APC、CD45RB-PE、CD40-FITC、CD80-FITC、CD86-FITC、I-a/e-FITC，避光孵育15min；加入2mL PBS洗滌1次，離心后去上清，加入0.4mL PBS，采用流式細(xì)胞儀檢測相關(guān)標(biāo)記物。

圖1小鼠脾臟DCs經(jīng)CD11c及CD45RB抗體染色的細(xì)胞亞群流式細(xì)胞圖，PE代表前向角，APC代表側(cè)向角，R1表示CD11chighCD45RBlowDCs，R2表示CD11clowCD45RBhighDCs。

1.3.6血清中細(xì)胞因子水平的檢測。所有全血立即37℃恒溫孵育15min，離心(3000rpm)10min，分離血清，按照 ELISA 試劑盒說明書檢測 IL-10及IFN-γ的表達(dá)水平，每組設(shè)3復(fù)孔。

2結(jié)果

2.1小鼠脾臟DC分離與亞群鑒定用標(biāo)染的CD11c-APC和CD45RB-PE對分選所得的DC同時進行染色，染色滿意后采用流式細(xì)胞儀進行分析，結(jié)果顯示所得DC分為3群，即CD11clowCD45RBhighDC、CD11chighCD45RBlowDC和CD11clowCD45RBlowDC。采用磁珠分選技術(shù)獲取CD11clowCD45RBhighDC，流式細(xì)胞術(shù)檢測存活率>90%，見圖1。

2.2丙泊酚刺激后小鼠脾臟中DCs亞群分化的比例變化與 NS組比較，6h時丙泊酚處理組R1數(shù)量變化不顯著，R2數(shù)量顯著增加，而在12h，丙泊酚處理組的R1數(shù)量較NS組降低，在12、24、36h時，R2數(shù)量顯著增加，見表1。

表1　丙泊酚組與NS組不同時間點小鼠脾臟DCs亞群比例±s,n=4只)

注：與NS組相比,*P<0.05

2.3丙泊酚刺激后膿毒癥小鼠血清中細(xì)胞因子的變化膿毒癥小鼠血清中IL-10、IFN-γ水平較SHam組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過丙泊酚的刺激后，P組血清中INF-γ水平較NS組小鼠明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、表3。

表2　3組不同時間點血清中IL-10水平的比較只)

注：與Sham組相比；*P<0.05；與NS組相比較，#P<0.05

表3　3組不同時間點血清中IFN-γ水平比較只)

注：與Sham組相比較；*P<0.05，與NS組相比較，#P<0.05

3討論

膿毒癥是病原微生物與機體免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)間相互作用，造成機體多器官功能損害的臨床綜合征，是一種高致病性疾病，每年奪走數(shù)以萬計患者的生命,是危重病醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點和難點問題[5]。膿毒癥時細(xì)胞因子的釋放呈級聯(lián)“瀑布”效應(yīng)，形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，釋放大量的炎癥因子，除了促炎癥細(xì)胞因子之外還有下調(diào)炎癥反應(yīng)的抗炎細(xì)胞因子如IL-10等[6]。促炎和抗炎細(xì)胞因子二者相互制約，影響膿毒癥時全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)展。當(dāng)機體遇到應(yīng)激源刺激后，IFN-γ和TNF-α是應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生早期的和核心作用的炎癥介質(zhì)，具有早期合成釋放的特點[7]。IL-10是內(nèi)源性抗炎介質(zhì)，可由促炎因子和內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生，能抑制免疫應(yīng)答，抑制巨噬細(xì)胞抗原呈遞，抑制多基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制多種炎癥細(xì)胞的分泌功能及炎癥因子的生成，對LPS誘導(dǎo)的促炎癥介質(zhì)的釋放有明顯的抑制作用[8]。

膿毒癥死亡患者的尸檢顯示，細(xì)胞凋亡在膿毒癥的發(fā)病中具有十分重要的作用，大量淋巴細(xì)胞凋亡是機體發(fā)生免疫抑制的重要原因之一[9]。最新的研究顯示，在膿毒癥中除了大量淋巴細(xì)胞凋亡之外，DC細(xì)胞的凋亡和亞群及表面分子改變也占有重要地位[10]。丙泊酚目前廣泛應(yīng)用于ICU膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷等危重患者的鎮(zhèn)靜治療，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)研究證實丙泊酚具有抗炎抗氧化作用[11]。Aniguchi等[12]發(fā)現(xiàn)丙泊酚可抑制內(nèi)毒素所致的促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并能減輕中性粒細(xì)胞的浸潤。目前，丙泊酚對不同樹突細(xì)胞亞群免疫功能的影響及具體調(diào)節(jié)機制并不是十分清楚，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外有關(guān)丙泊酚與樹突細(xì)胞二者關(guān)系的研究甚少，為探討丙泊酚與樹突細(xì)胞二者之間是否有關(guān)聯(lián)特進行本次實驗。

本實驗結(jié)果表明，無論是腹腔注射生理鹽水還是注射丙泊酚，兩組的IL-10和IFN-γ水平都是升高的，說明此時小鼠體內(nèi)正處于促炎反應(yīng)與抑炎反應(yīng)的失衡狀態(tài)；而與NS組相比，P組的IL-10升高相對于IFN-γ的降低占據(jù)絕對優(yōu)勢。丙泊酚能抑制膿毒癥早期促炎因子IFN-γ等的分泌，同時增加IL-10的分泌，可減少組織炎癥損傷，保護機體器官功能。同時CD11clowCD45RBhighDC的比例升高，由此可以看出丙泊酚既可以促進CD11clowCD45RBhighDC的活化，同時能促進IL-10的分泌，而樹突細(xì)胞亞型-CD11clowCD45RBhighDC以分泌IL-10為主，由此可以推斷丙泊酚介導(dǎo)機體的免疫抑制活性可能是通過刺激CD11clowCD45RBhighDC活化增加抑制因子IL-10分泌來發(fā)揮作用，為其應(yīng)用于損傷早期控制過度炎癥反應(yīng)提供理論依據(jù)。但是由于實驗局限性，本實驗并未涉及濃度梯度的丙泊酚對小鼠CD11clowCD45RBhighDC不同比例的探討，因此二者之間的劑量效應(yīng)關(guān)系有待進一步實驗研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Angus DC,Linde-Zwirble WT,Lidieker J,et al.Epidemiology of severese Psis in the United States:analysis of ineidence, outeome, and assoosiatedeosts of feare[J].Crit Care Med,2001,1,29:1303-1310

[2]Dubsky P, Ueno H, Piqueras B,et al Human dendritic cell subsets for vaccination J Clin Immunol, 2005,25(6):551-558

[3]Liu QY, Yao YM, Zhang SW, et al. Naturally existing CD11clowCD45RBhigh dendritic cells protect mice from acute severe inflammatory response induced by thermal injury. Immunobiology, 2010，accepted. (SCI IF 3.46)

[4]林蘭英，林財珠.丙泊酚對老年術(shù)后早期認(rèn)知功能與炎癥因子的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2011，27(3):254-256

[5]孔圓，江濱.樹突狀細(xì)胞與血液腫瘤的免疫治療[J].中國綜合臨床,2003，19(11):965-966

[6]丁寧，姜勇．巨噬細(xì)胞LPS相關(guān)模式識別受體的研究進展[J].中國病理生理雜志，2008,24(8):1650-1655

[7]盛志勇，姚永明.加強對膿毒癥免疫功能障礙及其監(jiān)測的研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011，36(1)：8-10

[8]太光平.白介素-10對感染性休克保護作用研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)《創(chuàng)傷與外科基本問題分冊》，2000，20：12-15

[9]Liu Y J. Dendritic cell subsets and lineages and their functions in innate and adaptive immunity.Cell,2001,106(3):259-263

[10]Hotchkiss RS，Nicholson DW. Apoptosis and caspases regulate death and inflammation in sepsis.Nat Rev Immunol, 2006, 6(11):813-817

[11]雷賢英，甘辭海.丙泊酚聯(lián)合地塞米松對早期膿毒癥大鼠炎癥因子的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2011，22(19)：12-14

[12]Aniguchi T, Yamamoto K,Ohmoto N, et al. Effects of Propofol on hemodynamic and inflammatory response to endotoxemia in rats[J].Ctit Care Med, 2000, 28:1101-1106

(岳靜玲編輯)

Effect of propofol on splenic dendritic cells and level of IFN-r、IL-10 in septic mice

WANGGuiling,LIUYanli,LIUXiao,et

al(AnesthesiologyDepartment,AffiliatedWorkersHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effect of propofol on splenic dendritic cells and the level of IFN-r、IL-10 in septic mice.MethodsSesis models were made by cecal ligation and puncture(CLP) in C57BL/6 mice.Sixty mice were divided into three groups as follows:Sham group,NS group and Propofol (5mg/kg) treatment group.After model making successfully,the NS group was given 0.9% saline and the propofol group was given equal amount of propofol intraperitoneal injection respectively.Then,the mice were sacrificed after the 0,6,12,24 and 36 hours respectively,with four animals at each time point.DCs were isolated by Magnetic microbeads from mice.The phenotypes of cells were analyzed with flow cytometry,and the cytokine levels of IL-10 and IFN-r were measured by ELISA.ResultsCompared with the results of the NS group, the proportion of R2(regulatory DC cells) in Propofol group significantly increased at 12,24 and 36 hour point(P<0.05).Compared with the results of the sham group,the level of IL-10 and IFN-r in NS group and Propofol group both increase markedly(P<0.05).In addition,compared with the results of the NS group,the level of IL-10 increases largely and the level of IFN-r decreases significantly(P<0.05).ConclusionThe level of IFN-r and Il-10 both increase in early sepsis.To a certain extent,propofol could inhibit the early inflammatory response by altering the release of inflammatory factor and increasing the proportion of regulatory DCs to reduce inflammation and improve the prognosis of sepsis.

[KEYWORDS]Propofol.Dendritic cells.Regulatory dendritic cells.Immunity

[中圖分類號]R 614.1 R392.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)02-88-04

【通訊作者】徐凱智。

【作者簡介】王桂嶺(1987-)，女，碩士研究生,住院醫(yī)師。研究方向：膿毒癥免疫與器官保護。