人自身抗原52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70,SSB-La的原核表達及純化鑒定

李　欣，吳淡娟，李海俠，褚　帥，康　霞，裘宇容

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 檢驗科，廣東 廣州510515)

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人自身抗原52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70,SSB-La的原核表達及純化鑒定

李欣※，吳淡娟※，李海俠，褚?guī)洠迪?，裘宇?

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院 檢驗科，廣東 廣州510515)

摘要：目的制備重組人自身抗原52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La，為建立自制抗核抗體熒光免疫層析快速檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。 方法在NCBI上查詢?nèi)?2-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70，SSB-La的堿基序列和氨基酸序列，運用軟件預測抗原表位，選擇抗原表位并對密碼子進行偏嗜性改造，采用人工合成方法合成抗原表位序列并插入至原核表達載體pET30a中。將重組質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導表達，表達的重組蛋白用鎳離子親和層析柱純化，用熒光免疫法測定重組蛋白活性。 結(jié)果重組人自身抗原SSB-La是可溶性表達，52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1以及Scl-70是包涵體形式表達；純化產(chǎn)物經(jīng)熒光免疫法測定活性，結(jié)果顯示：SSB-La，Scl-70 以及Jo-1具有較高的抗原活性，52-kDRo/SSA，rRNP以及SmD1抗原活性較弱。 結(jié)論成功制備了重組人自身抗原52-KDRoSSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La，為下一步研究開發(fā)自制抗核抗體熒光免疫層析快速檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：重組人自身抗原；抗核抗體；抗原表位；熒光免疫法

(ChinJLabDiagn,2016,20:0364)

自身免疫性疾病(Autoimmune Diseases，AID)是泛指機體免疫效應細胞或免疫效應分子，針對自身組織或細胞出現(xiàn)異常免疫應答反應，導致組織損壞或功能障礙的疾病，是一類發(fā)病率高、致殘率高、致死率高，可侵襲全身系統(tǒng)，嚴重危害人類健康的疾病。AID 疾病的種類很多，比如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，干燥綜合征(SS)，硬皮病等，這類疾病特點之一便是病人血液中存在高效價的自身抗體。

抗核抗體(antinuclear antibody,ANA)是一組將自身真核細胞的各種細胞成分為靶抗原的自身抗體總稱。ANA在大多數(shù)AID疾病中呈陽性，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的ANA的陽性率約為90%-100%，干燥綜合征患者陽性率約為60%-80%，類風濕性關(guān)節(jié)炎患者的ANA陽性率為30%-50%。ANA在AID疾病出現(xiàn)明顯臨床癥狀之前就可存在，且病情穩(wěn)定后其滴度逐漸下降，因此ANA檢測對于AID疾病的早期篩查，診斷以及治療效果的觀察和指導臨床用藥等方面具有重要意義，是臨床上一項極其重要的AID篩查試驗。結(jié)合臨床表現(xiàn)，ANA陽性可疑者進一步檢測明確抗體類型，如抗U1RNP抗體是混合性結(jié)締組織病的標志性抗體[1]，抗Sm抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的標志性抗體[2]，而抗SS-A(Ro)抗體和抗SS-B(La)抗體則多出現(xiàn)于干燥綜合征患者等。

目前常用的檢測ANA方法主要有兩種：間接免疫熒光法(IIF)和ELISA法。IIF法一直是臨床常規(guī)的篩選試驗方法，該方法檢測靈敏度高。EILSA法，可進行半定量檢測，臨床經(jīng)常根據(jù)其濃度的變化判定病人的好轉(zhuǎn)與否，從而制定下一步的治療方案。但IIF法和EILSA法，均存在出報告時間長，耽誤病人即時就醫(yī)，從而影響疾病診治情況。針對上述臨床存在問題，本課題在當今檢驗醫(yī)學發(fā)展提出的POCT(Point Of Care Testing)，即即時檢驗新領(lǐng)域背景下，致力于開發(fā)一種新的檢測試劑即熒光免疫層析快速檢測試劑盒，使用小型熒光免疫分析儀進行檢測，花費時間在15 分鐘左右，因此簡單、便捷，標本即到即檢，既能解決病人等待時間長之問題，又能解決臨床醫(yī)生執(zhí)行自身免疫性疾病臨床診斷的路徑問題，可以在臨床推廣使用，以提高自身免疫疾病的診治水平。

ANA熒光免疫層析快速檢測試劑盒需要利用人自身抗原作為檢測底物來完成檢測過程，為大量獲得人自身抗原，本文采用基因工程方法，利用原核表達系統(tǒng)，制備臨床常見的人自身抗原52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La。

1材料和方法

1.1材料

大腸桿菌BL21(DE3)本實驗室保存，電泳儀購自北京六一儀器廠，掃描儀購自上海中晶科技有限公司,高速冷凍離心機購自日本HITACHI公司，多功能微孔板熒光檢測儀Infinite F200購自瑞士TECAN公司。

1.2方法

1.2.1抗原表位的選擇以及重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

抗原表位的選擇：

1)從NCBI上查詢出人自身抗原52-kDRo/SSA，rRNP，Jo-1，SmD1，Scl-70以及SSB-La的堿基序列和氨基酸序列。

2)通過ABCpred Prediction Server，BcePred Prediction Server，BepiPred 1.0b Server，DNASTAR等軟件對上述六個人自身抗原的抗原表位進行綜合預測分析

3)結(jié)合有關(guān)文獻[3-9]，選擇抗原性較好的表位肽，并將表位肽集中區(qū)域的氨基酸序列截取出來拼接成一條多肽鏈，總共構(gòu)成了六條多肽鏈即每個人自身抗原一條多肽鏈。

4)結(jié)合抗原表位多肽鏈的分子量以及等電點情況，將分子量較小且等電點接近的兩條多肽鏈52-kDRo/SSA和rRNP，Jo-1和SmD1拼接成一條多肽鏈。總共形成了四條多肽鏈：52-kDRo/SSA +rRNP，Jo-1+SmD1，Scl-70以及SSB-La。

重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建：

從人自身抗原的堿基序列中找出上述四條多肽鏈對應的堿基編碼序列，對密碼子進行偏嗜性改造，用人工合成方法合成基因片段，之后連入pET30a載體，構(gòu)建了四個重組表達質(zhì)粒：pET30a-52-kDRo/SSA +rRNP，pET30a- Jo-1+SmD1，pET30a- Scl-70以及pET30a-SSB-La。

1.2.2重組自身抗原的誘導表達

將重組表達質(zhì)粒導入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素)中，37℃培養(yǎng)過夜。次日按1∶100接種于300 ml新鮮的同種培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至A600為0.5-0.6時，將菌液冰浴0.5 h，然后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，同時設(shè)不加IPTG的陰性對照，20℃過夜誘導表達。4℃，12 000 g離心收集菌體細胞，置于冰浴中超聲破碎，破碎完全后，取細胞破碎液，沉淀以及上清進行15%的SDS-PAGE。

1.2.3重組自身抗原的純化

將誘導表達后的菌體細胞用適量緩沖液重懸，細胞置于冰浴中超聲破碎，破碎完全后，4℃，12 000 g離心收集上清，將上清通過鎳離子親和層析柱提純，步驟具體如下：

1)向?qū)游鲋屑尤?倍柱體積的0.1 mol/L NiCl2溶液，滴凈后加入5倍柱體積雙蒸水沖洗，再加入5倍柱體積緩沖液平衡鎳離子親和層析柱。

2)將收集的上清加入到親和層析柱中，待上清滴凈后再加入5倍柱體積的緩沖液，然后加入含50 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫未結(jié)合的雜蛋白至洗脫干凈，再用含500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫收集，得到提純的目的蛋白。

3)將提純的目的蛋白溶液裝入透析袋中，用夾子夾緊透析袋兩端后放入透析液中，4℃透析8-10 h，中間更換新鮮透析液3-4次。透析完畢后，4℃，12 000 g離心30 min，獲得透析后的蛋白溶液，備用。

1.2.4重組自身抗原的活性檢測

獲得提純的重組自身抗原后，用熒光免疫技術(shù)檢測其抗原活性，步驟具體如下：

1)用熒光微孔板包被抗原

每孔加入100 μL抗原溶液，并設(shè)置空白對照(包被PBS緩沖液)和陽性對照(包被質(zhì)控抗體)，在4℃條件下過夜吸附。吸附結(jié)束后倒去孔內(nèi)液體并甩干，然后用PBST緩沖液清洗4次。

2)封閉

每孔加入200 μl封閉液，在37℃條件下孵育2 h，倒去孔內(nèi)液體并甩干，然后用PBST緩沖液清洗4次。

3)孵一抗

每孔加入100 μl質(zhì)控抗體，在37℃條件下孵育1.5 h，倒去孔內(nèi)液體并甩干，用PBST緩沖液清洗4次。

4)加二抗

每孔加入100 μl生物素標記的鼠抗人IgG，在37℃條件下孵育1.5 h，倒去孔內(nèi)液體并甩干，用PBST緩沖液清洗4次。

5)加熒光蛋白

每孔加入 100 μl熒光蛋白(CSAPEB)溶液，在37℃條件下孵育1.5 h，倒去孔內(nèi)液體并甩干，用PBST緩沖液清洗4次。

6)測定結(jié)果

每孔加入100 μl PBS緩沖液，將熒光微孔板置于多功能微孔板熒光檢測儀內(nèi)，以540 nm波長光源激發(fā)，在590 nm濾鏡下檢測熒光，同時測量熒光微孔板的背景值。

2結(jié)果

2.1重組表達質(zhì)粒DNA序列測定

DNA序列測定結(jié)果表明重組表達質(zhì)粒中所含的目的基因片段同我們所選擇的抗原表位序列(優(yōu)化后序列)一致，證明目的基因片段已經(jīng)成功插入到表達質(zhì)粒中。

2.2表達產(chǎn)物的鑒定

表達的重組自身抗原進行15%SDS-PAGE分析：從圖1A可知，在相對分子質(zhì)量約為45 KD處出現(xiàn)了目的條帶，大小與52-kDRo/SSA +rRNP相符，重組蛋白以包涵體形式表達，上清無表達；從圖1B可知，在相對分子質(zhì)量約為35KD處出現(xiàn)了目的條帶，大小與Jo-1+SmD1相符，重組蛋白以包涵體形式表達，上清無表達；從圖1C可知，在相對分子質(zhì)量約為55 KD處出現(xiàn)了目的條帶，大小與Scl-70相符，重組蛋白以包涵體形式表達，上清無表達；從圖1D可知，在相對分子質(zhì)量約為40 KD處出現(xiàn)了目的條帶，大小與SSB-La相符，重組蛋白以可溶性和包涵體兩種形式表達，上清和沉淀中均有重組蛋白出現(xiàn)。

A:52-kDRo/SSA +rRNP，B:Jo-1+SmD1，C:Scl-70，D:SSB-La，1：不誘導的細胞破碎液，2：不誘導的細胞破碎后沉淀，3：不誘導的細胞破碎后上清，4：IPTG誘導的細胞破碎液，5：IPTG誘導的細胞破碎后沉淀，6：IPTG誘導的細胞破碎后上清，M：蛋白Marker，從上到下的大小依次為130 KD,95 KD,72 KD,55 KD,43 KD,34 KD,26 KD,17 KD,10 KD

圖1重組自身抗原表達產(chǎn)物的鑒定

2.3純化產(chǎn)物的鑒定

重組自身抗原52-kDRo/SSA +rRNP，Jo-1+SmD1以及Scl-70由于是包涵體形式表達，所以采用包涵體變性方式通過鎳離子親和層析柱純化，然后透析復性。重組自身抗原SSB-La由于能夠以可溶性方式存于上清液中，則直接用上清液通過鎳離子親和層析柱純化。

純化的重組自身抗原進行15%SDS-PAGE分析：從圖2 A,B,C可知，采用包涵體變性純化方式，提純到了目的蛋白52-kDRo/SSA +rRNP，Jo-1+SmD1和Scl-70；從圖2D可知，可溶性的SSB-La用上清液直接純化同樣提純到了目的蛋白。

2.4重組自身抗原活性的鑒定

將提純的重組自身抗原利用熒光免疫法檢測活性，SSB-La濃度為0.5 mg/ml，Scl-70濃度為0.5 mg/ml，Jo-1+SmD1濃度為1.0 mg/ml，52-kDRo/SSA +rRNP濃度為1.0 mg/ml。檢測結(jié)果如表1所示：重組自身抗原SSB-La，Scl-70以及Jo-1具有較高的抗原活性，SmD1，52-kDRo/SSA以及rRNP抗原活性較弱。

3討論

ANA檢測作為自身免疫性疾病的篩選檢測項目一直是臨床上的首選項目，其陽性為判斷AID疾病可能性提供了重要的支持性證據(jù)。

表1　重組自身抗原熒光免疫檢測結(jié)果

A:52-kDRo/SSA +rRNP，B:Jo-1+SmD1，C:Scl-70，D:SSB-La

1：上清，2：用緩沖液洗脫一倍柱體積后的收集液，3：用50 mM咪唑洗脫一倍柱體積后的收集液，4：用500 mM咪唑洗脫，收集的純化樣品a，5：用500 mM咪唑洗脫，收集的純化樣品b，6：用500 mM咪唑洗脫，收集的純化樣品c，M：蛋白Marker，從上到下大小依次為130 KD,95 KD,72 KD,55 KD,43 KD,34 KD,26 KD,17 KD,10 KD

圖2重組自身抗原純化產(chǎn)物的鑒定

自1957年首次應用IIF檢測ANA以來，許多研究者對ANA檢測方法進行大量的研究。目前國際上通常采用Hep-2細胞作為ANA檢測底物(因為它具有廣泛的抗原)，作為間接免疫熒光法的抗原底物，進行ANA篩查。國外應用間接免疫熒光法檢測ANA的試劑廠家主要是來自德國歐盟(EUROIMMUN)公司，美國科醫(yī)(SCIMEDX)公司；以酶聯(lián)免疫法檢測ANA 的試劑盒有來自德國(HUMAN)IMTEC公司，美國SCIMEDX公司，西班牙BioSystems公司，美國Calibiotech公司，美國Cusabio公司等。目前國內(nèi)醫(yī)院大多采用的是進口試劑盒進行ANA篩查實驗，但是價格昂貴，使用成本較高。國內(nèi)研究者針對該項目也開發(fā)了相應的診斷試劑盒，例如北京和杰創(chuàng)新公司已成功研制出了利用間接免疫熒光法檢測ANA的試劑盒，并已在臨床上使用，深圳市安群生物工程有限公司也已開發(fā)出應用酶聯(lián)免疫法定量檢測ANA的試劑盒，上海信然生物技術(shù)有限公司以及福建藍天波海有限公司則利用膠體金法定性檢測ANA等。國產(chǎn)試劑盒雖然有價格上的優(yōu)勢，但是產(chǎn)品穩(wěn)定性差，靈敏度低，因而臨床的使用率很低。

我們研發(fā)的ANA熒光免疫層析快速檢測試劑盒，首次將熒光法與免疫層析相結(jié)合，利用熒光免疫分析儀進行檢測。不僅檢測方法操作簡便、快速，若制備開發(fā)出標準品還可進行定量檢測。此外，熒光蛋白與鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)的結(jié)合應用使得該試劑盒穩(wěn)定性好，靈敏度高。檢測方法的成本相較國外試劑也低，有望在臨床上得到廣泛應用。

研發(fā)ANA熒光免疫層析快速檢測試劑盒的 第一要務是獲得高純度的人自身抗原，利用基因重組技術(shù)是實現(xiàn)這一目的的有效手段，本文利用原核表達系統(tǒng)，成功表達了人自身抗原52抗抗原活性很好，足以滿足ANA熒光免疫層析快速檢測試劑盒的需要。而52-kDRo/SSA，rRNP，SmD1抗原活性相對較弱，還需要進一步提高其活性，抗原活性的強弱可能同重組自身抗原的可溶性，抗原的表位選擇，以及蛋白表達系統(tǒng)有關(guān)，下一步準備通過實驗來一一驗證，力求獲得高活性的重組自身抗原，為開發(fā)ANA熒光免疫層析快速檢測試劑盒奠定堅實的基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and purification identification of human auto-antigen 52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70,SSB-La

LIXin，WUDan-juan,LIHai-xia,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheSouthHospitalofSoutherMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Abstract:ObjectiveTo obtain recombinant human autoantigen 52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70 and SSB-La,for the preparation of antinuclear antibody immunofluorescence chromatography rapid detection kit.MethodsNucleotide and amino acid sequences of 52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70 and SSB-La were found on NCBI.After codon optimization,the epitope sequences selected by using epitope prediction software were linked into prokaryotic expression vector pET-30a to get recombinant vectors which then were transformed into BL21.The recombinant proteins were got by IPTG induction.After nickel column purification,Recombinant protein activity was measured by fluorescence immunoassay assay.ResultsSSB-La is a soluble protein,the others are insoluble proteins.Fluorescence immunoassay assay results show:SSB-La,Jo-1 and Scl-70 have high activity,but the activity of 52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1 and SmD1 is low.ConclusionRecombinant human autoantigen 52-kDRo/SSA,rRNP,Jo-1,SmD1,Scl-70 and SSB-La are successfully obtained in this study,which lays the foundation for ntinuclear antibody immunofluorescence chromatography rapid detection kit.

Key words:ecombinant human autoantigen;antinuclear antibody;epitope;fluorescence immunoassay assay

(收稿日期：2015-08-06)

作者簡介：李欣，30歲，女，碩士，初級技師，主要從事自身抗體檢測在臨床上的應用方面的研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R392.11

文章編號：1007-4287(2016)03-0364-05

*通訊作者;※并列第一作者

基金項目：廣東省教育部產(chǎn)學研結(jié)合項目(2012B091100461)