亞低溫治療對(duì)大鼠缺血再灌注損傷腦組織中Survivin和Bcl-2基因表達(dá)的影響

姜堯佳,徐振宇,王澤宇,劉永剛,魏春杰*,盛寶英

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯154000；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

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亞低溫治療對(duì)大鼠缺血再灌注損傷腦組織中Survivin和Bcl-2基因表達(dá)的影響

姜堯佳1,徐振宇2,王澤宇1,劉永剛1,魏春杰1*,盛寶英1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 佳木斯154000；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的觀察亞低溫治療對(duì)大鼠缺血再灌注損傷腦組織細(xì)胞中Survivin和Bcl-2基因表達(dá)的影響。方法90只wister大鼠制作大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)腦缺血再灌注損傷模型。隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組，對(duì)照組(建模后常溫處理)和觀察組(建模后亞低溫處理)。將對(duì)照組和觀察組大鼠大腦中動(dòng)脈缺血處理2，4，8小時(shí)，再灌注3 h，24 h，48 h，7 d，14 d后處死。亞低溫組于缺血20分鐘后亞低溫處理5小時(shí)。用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Survivin和Bcl-2在缺血再灌注損傷腦組織細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果大鼠神經(jīng)功能評(píng)分：假手術(shù)組(0.15±0.04)分，對(duì)照組(3.54±0.36)分，觀察組(3.72±0.55)分。亞低溫處理后Survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)增加。結(jié)論亞低溫治療后的大鼠腦缺血組織中的Survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)增加，對(duì)大鼠的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，改善大鼠再灌注治療的預(yù)后。

關(guān)鍵詞：亞低溫治療； Bcl-2； Survivin； 缺血再灌注損傷

(ChinJLabDiagn,2016,20:0352)

腦缺血會(huì)造成神經(jīng)細(xì)胞的程序性死亡和壞死。亞低溫治療可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減輕缺血再灌注對(duì)腦組織的損傷，促進(jìn)損傷神經(jīng)功能恢復(fù)。Benjamin發(fā)現(xiàn)亞低溫治療對(duì)大腦缺血再灌注損傷有治療作用[1]。本次研究著重探討亞低溫治療對(duì) 大鼠腦缺血再灌注損傷中Survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)影響。

1材料與方法

1.1材料佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的日齡為40 d的Wister大鼠90只，平均體重 (215±13)g。隨機(jī)分為假手術(shù)組，對(duì)照組(建模后常溫處理)和觀察組(建模后亞低溫處理)，每組各30只。

1.2方法

1.2.1建模方法用改良longa法建立大鼠大腦缺血再灌注模型：用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，固定，消毒，備皮，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。根部結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈；近心端結(jié)扎頸總動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端打一松扣，然后用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉。在靠近頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎處剪一V形小口，將魚線圓球端伸入頸總動(dòng)脈，切口遠(yuǎn)端用絲線結(jié)扎[2]。打開(kāi)動(dòng)脈夾，輕輕將圓球推入頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向，稍有阻力即停止。此時(shí)圓球端在大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，距離分叉處18 mm左右，將皮膚縫合，線殘端留于體外，并局部使用抗生素防止感染。再灌注時(shí)，將圓端拔出至頸總動(dòng)脈開(kāi)口結(jié)扎處，模擬缺血的腦組織的再灌注治療。假手術(shù)除不進(jìn)行缺血處理外，操作與另外兩組相同。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法觀察組在大腦缺血處理20 min后用冰袋對(duì)腦部進(jìn)行亞低溫處理5 h，使腦組織溫度保持在32-33℃。對(duì)照組和觀察組在缺血4 h后，將各組大鼠隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只，分別在對(duì)照組和觀察組再灌注3 h，24 h，48 h，1周，2周后處死。假手術(shù)組在上述五個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選擇6只大鼠處死。

1.2.3造模成功評(píng)分[3]0分:無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；1分:對(duì)側(cè)前肢持續(xù)屈曲；2分:轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；3分:行走時(shí)向一側(cè)傾倒；4分:行走困難，意識(shí)障礙；5分：死亡。

1.2.4腦組織切片標(biāo)本制作用1%戊巴比妥鈉將大鼠過(guò)度麻醉，4%多聚甲醛灌注后，斷頭取腦，在視交叉前后2 mm處做冠狀切片，將所取腦組織石蠟包埋，常規(guī)切片。

1.2.5Survivin和Bcl-2蛋白免疫組化檢測(cè)利用免疫組織化學(xué)法(S-P法)對(duì)切片標(biāo)本中Survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Survivin和Bcl-2蛋白一抗采用小鼠抗大鼠的Survivin和Bcl-2單克隆抗體，試劑盒購(gòu)于SANTA CRUZ 公司。Survivin陽(yáng)性和Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿胞核表達(dá)均呈棕黃色。每張切片在400倍鏡下取4個(gè)不重疊視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，對(duì)Survivin，Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.5軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，對(duì)計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，P<0.05有顯著差異。

2結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分大鼠死亡情況：假手術(shù)組0只，對(duì)照組17只，觀察組4只，假手術(shù)組(0.15±0.04)分，對(duì)照組(3.54±0.36)分，觀察組(3.72±0.55)分。

2.2Survivin和Bcl-2蛋白免疫組化結(jié)果假手術(shù)組極少表達(dá)(<1個(gè))，故未計(jì)入，常溫缺血組及亞低溫缺血組Survivin和Bcl-2蛋白在神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿中表達(dá)(P<0.01)。Survivin和Bcl-2蛋白的表達(dá)隨再灌注治療時(shí)間延長(zhǎng)而增加，48 h時(shí)達(dá)到最大值，后呈下降趨勢(shì)，觀察組各時(shí)間點(diǎn)Survivin蛋白和Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1和表2。

表1　Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況(個(gè))

注：與對(duì)照組相比,*P<0.01

表2　Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況(個(gè))

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01

3討論

腦卒中的再灌注治療有狹窄的治療時(shí)間窗。因大腦是耗氧量最大的器官，短時(shí)間的缺氧即可造成腦細(xì)胞的變性，凋亡，壞死[4]。延長(zhǎng)治療時(shí)間窗可以有效的改善腦卒中患者的預(yù)后。

亞低溫治療是使局部組織溫度在32-34℃[5]。研究表明亞低溫可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡，降低大腦的耗氧量，調(diào)節(jié)腦血流，減少腦組織的炎癥反應(yīng)，減少腦細(xì)胞的損傷，減輕缺血再灌注對(duì)腦組織的損傷，可以顯著延長(zhǎng)治療時(shí)間窗。

凋亡抑制蛋白(IAP)是一種抑制細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞因子，它具有高度的遺傳保守性[6]。Bcl-2和Survivin蛋白是重要的抗細(xì)胞凋亡蛋白。提高Bcl-2和 Survivin在細(xì)胞中的表達(dá)可以有效的恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的功能，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷。國(guó)外研究表明，亞低溫可以提高梗死灶中Bcl-2和Survivin 蛋白的表達(dá)。

Bcl-2家族基于機(jī)體保護(hù)機(jī)制在缺血早期表達(dá)增加，對(duì)神經(jīng)元有抗缺血損傷作用，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[7]。隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，凋亡和壞死的神 經(jīng)細(xì)胞增加，激活凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞損傷加重。Bcl-2蛋白通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活。本次實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果表明，亞低溫處理可以增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，減少腦細(xì)胞的凋亡和壞死，有利于缺血再灌注后腦細(xì)胞的功能恢復(fù)。

Survivin蛋白也抑制細(xì)胞的凋亡。Edward等科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在大鼠的大腦缺血再灌注模型中，Survivin蛋白會(huì)在缺血病灶和病灶周邊特異性的表達(dá)增加。 Survivin蛋白的表達(dá)增多由PKt / AKT 信號(hào)通路激活，有利于抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減輕缺血再灌注損傷[8]。本次實(shí)驗(yàn)可觀察到，亞低溫可以誘導(dǎo)Survivin蛋白表達(dá)增多，減輕缺血再灌注對(duì) 神經(jīng)細(xì)胞的損害。

實(shí)驗(yàn)中，用亞低溫治療大鼠的生存率明顯提高，神經(jīng)損害癥狀明顯減輕。說(shuō)明亞低溫治療可以通過(guò)增加Bcl-2和Survivin 蛋白的表達(dá)，減少腦神經(jīng)的凋亡。Lifei在研究中認(rèn)為這可能與亞低溫選擇性的調(diào)控蛋白合成有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[9]。故亞低溫可以有效延長(zhǎng) 腦缺血的有效治療時(shí)間窗，在臨床應(yīng)用中可能改善腦卒中病人的預(yù)后，這與閆曉明的研究結(jié)果一致[10]。

從本研究結(jié)果中可以看出，亞低溫治療后的大鼠腦缺血組織中的Survivin和Bcl-2蛋白表達(dá)增加，對(duì)大鼠的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，改善大鼠再灌注治療的預(yù)后。

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Effect of mild hypothermia on the expression of Survivin and Bcl-2 gene in brain tissue of rats with ischemia reperfusion injury

JIANGYao-jia，XUZhen-yu，WANGZe-yu，etal.

(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity，Jiamusi154000,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of mild hypothermia therapy on regulation of cerebral ischemia reperfusion injury in rats and the expression of Survivin gene in Bcl-2 tissues and cells.MethodsRandomly selected 90 Wister rats are used for establish middle cerebral artery occlusion (MCAO) in cerebral ischemia reperfusion injury model.The rats were divided into sham operation group,control group (normothermic ischemia group) and observation group (mild hypothermia ischemia group).In the observation group and the control group of rats with middle cerebral artery ischemia treatment 2,4,8 hours,then reperfuse 3h,24h,48h,1 week,2 weeks.Mild hypothermia group reperfuse for 5 hours after ischemia mild hypothermia treatment for 20 minutes.Detection of Survivin and Bcl-2 cells by immune group content.ResultsThe score of neural function in rats:sham operation group is (0.15±0.04),control group is (3.54±0.36),the observation group (3.72±0.55) points.Comparison between groups with great difference.Mild hypothermia treatment increases the expression of Survivin and Bcl 2 gene.ConclusionThe expression of Survivin and Bcl-2 protein increased in tissue of rats after mild hypothermia treatment,and the treatment has a positive effect on rat neural cell,which can improve the prognosis of rats.

Key words:Mild hypothermia treatment;Bcl-2;Survivin;Ischemia reperfusion injury

(收稿日期：2015-06-27)

作者簡(jiǎn)介：姜堯佳(1976-),男,內(nèi)科主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士,研究方向：缺血性腦血管病的防治。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R364.1+2

文章編號(hào)：1007-4287(2016)03-0352-03

*通訊作者

基金項(xiàng)目：佳木斯大學(xué)科技項(xiàng)目(S2013-039)