血清和尿CMV-DNA定量監(jiān)測(cè)對(duì)造血干細(xì)胞移植后出血性膀胱炎的診斷意義

陸英 張祥忠 劉文達(dá) 劉貴連 袁青 林東軍

·論著·

血清和尿CMV-DNA定量監(jiān)測(cè)對(duì)造血干細(xì)胞移植后出血性膀胱炎的診斷意義

陸英1,2張祥忠1劉文達(dá)2劉貴連2袁青2林東軍1,2

目的 探討血清和尿CMV-DNA定量監(jiān)測(cè)對(duì)造血干細(xì)胞移植(HSCT)后出血性膀胱炎(HC)的診斷意義。方法 回顧性分析2011年9月至2015年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院進(jìn)行HSCT的120例受者臨床資料，自預(yù)處理前1周開始至移植后100 d，每周1次采用熒光定量PCR檢測(cè)血清CMV-DNA，對(duì)于出現(xiàn)CMV-DNA血癥或者尿路刺激征的患者同時(shí)檢測(cè)尿CMV-DNA。采用χ2檢驗(yàn)比較CMV血癥患者和CMV-DNA正常受者發(fā)生HC的比例。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 在HSCT后100 d內(nèi)，120例受者中47例(39.2%)出現(xiàn)CMV血癥，其中同時(shí)合并CMV尿癥者16例(占CMV血癥患者的34.0%)；73例血清CMV-DNA正常的受者中4例(5.5%)出現(xiàn)CMV尿癥。CMV血癥患者中，16例(34.0%，16/47)發(fā)生HC；而血清CMV-DNA正常的患者中，僅4例(5.5%，4/73)發(fā)生HC；兩組發(fā)生HC的患者比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.79，P<0.05)。 20例檢出CMV尿癥的患者均出現(xiàn)不同程度的尿路刺激征及尿常規(guī)異常，考慮為CMV相關(guān)性HC，給予抗病毒治療后獲得良好效果。結(jié)論 HSCT受者仍有較高的CMV感染率，對(duì)于出現(xiàn)CMV血癥患者，同時(shí)監(jiān)測(cè)尿CMV-DNA有助于早期診斷CMV相關(guān)性HC，提高疾病的治愈率。

巨細(xì)胞病毒； 出血性膀胱炎； 造血干細(xì)胞移植

CMV為皰疹病毒科的雙螺旋DNA病毒，在自然界中廣泛存在，人類CMV感染較普遍。在器官移植、腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合征等免疫功能受損的患者中，CMV可被激活，進(jìn)而引起一系列的臨床癥狀，甚至導(dǎo)致患者死亡。因此，CMV感染的早期診斷非常重要。

出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis，HC)是造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后并發(fā)癥之一，在異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)受者中發(fā)生率為8%～27%[1]。臨床癥狀表現(xiàn)為尿路刺激征、血尿，嚴(yán)重者可出現(xiàn)尿路梗阻以及腎功能衰竭。根據(jù)發(fā)生時(shí)間的不同，可分為早發(fā)型與遲發(fā)型HC。前者發(fā)生在預(yù)處理28～72 h內(nèi)，多與預(yù)處理相關(guān)，尤其是與包含大劑量環(huán)磷酰胺和白消安的化療方案及血小板低下相關(guān)；后者發(fā)生在預(yù)處理72 h后，多數(shù)研究表明與病毒(包括BK病毒、CMV、JC病毒、腺病毒)感染以及移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)相關(guān)[2-3]。國(guó)外報(bào)道遲發(fā)型HC與BK病毒感染有很大相關(guān)性，而國(guó)內(nèi)人群CMV潛伏感染率高，移植后CMV感染的發(fā)病率也明顯升高，我國(guó)以及亞洲多個(gè)臨床研究中心的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示CMV感染是發(fā)生遲發(fā)型HC的高危因素[4-5]。早期診斷CMV相關(guān)性HC有利于盡早使用抗病毒藥物治療，避免嚴(yán)重并發(fā)癥的出現(xiàn)，從而改善疾病預(yù)后。本研究以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HSCT受者血液以及尿液中CMV-DNA拷貝數(shù)，探討同時(shí)檢測(cè)以上兩種標(biāo)本CMV-DNA對(duì)于臨床診斷CMV相關(guān)性HC的診斷意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2011年9月至2015年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院進(jìn)行HSCT的120例受者臨床資料，其中男性69例，女性51例，中位年齡33歲(10～55歲)。原發(fā)病包括急性白血病82例，淋巴瘤13例，骨髓增生異常綜合征3例，重型再生障礙性貧血11例，多發(fā)性骨髓瘤2例，慢性粒細(xì)胞白血病9例。其中HLA相合同胞allo-HSCT 54例，HLA相合非血緣allo-HSCT 17例，自體HSCT 25例，HLA半相合同胞allo-HSCT 8例，移植物均為外周血造血干細(xì)胞；其余16例為非血緣臍血移植。移植前患者血CMV-IgM以及CMV-DNA檢測(cè)均為陰性，CMV-IgG均為陽(yáng)性。

1.2 預(yù)處理方案及病毒防治

白血病和骨髓增生異常綜合征患者采用白消安+環(huán)磷酰胺或阿糖胞苷+白消安+司莫司汀+環(huán)磷酰胺方案，淋巴瘤采用卡莫司汀+依托泊苷+阿糖胞苷+馬法蘭方案，多發(fā)性骨髓瘤采用馬法蘭單藥方案，重型再生障礙性貧血采用環(huán)磷酰胺+抗胸腺細(xì)胞球蛋白方案。其中有1例淋巴瘤以及2例高危白血病患者采用白消安+氟達(dá)拉濱+阿糖胞苷方案預(yù)處理。從患者接受預(yù)處理方案開始，常規(guī)使用更昔洛韋預(yù)防CMV感染。

1.3 CMV-DNA檢測(cè)方法

所有受者自預(yù)處理前1周開始至移植后100 d，每周1次用干燥管采集外周血，檢測(cè)血清CMV-DNA。對(duì)于血清CMV-DNA增高或者出現(xiàn)尿路刺激征的患者，收集尿液檢測(cè)尿液上皮細(xì)胞CMV-DNA。血、尿CMV- DNA檢測(cè)均由廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心完成。采用熒光定量PCR檢測(cè)CMV-DNA拷貝數(shù)，所用試劑盒為廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心的CMV核酸擴(kuò)增PCR熒光試劑盒。

1.4 CMV血癥、尿癥判定標(biāo)準(zhǔn)和HC診斷標(biāo)準(zhǔn)

由于各研究中心診斷CMV血癥、尿癥的CMV-DNA拷貝數(shù)參考值各不相同，尤其目前關(guān)于CMV尿癥的研究甚少，以下參考值是根據(jù)本中心既往經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合其他研究[6-7]制定的標(biāo)準(zhǔn)：血清CMV-DNA>2 000 拷貝/mL判定為CMV血癥，尿CMV-DNA>500 拷貝/mL判定為CMV尿癥。在排除其他疾病(如陰道出血、全身出血體質(zhì)、細(xì)菌或真菌性泌尿道感染) 情況下出現(xiàn)的持續(xù)性血尿和下泌尿道癥狀(如排尿困難、尿頻、尿急)，可臨床診斷為HC[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)表示。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)比較CMV血癥患者和CMV-DNA正常受者發(fā)生HC的比例。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CMV-DNA檢測(cè)結(jié)果和HC發(fā)生情況

在接受HSCT后100 d的監(jiān)測(cè)期內(nèi)，120例受者中47例(39.2%)被診斷為CMV血癥，其中16例同時(shí)出現(xiàn)CMV尿癥(占CMV血癥患者的34.0%)；73例血清CMV-DNA正常的受者中，4例(5.5%)出現(xiàn)CMV尿癥。

在接受HSCT后100 d的監(jiān)測(cè)期內(nèi)，20例受者(16.7%，20/120)出現(xiàn)HC。CMV血癥患者中，16例(34.0%，16/47)發(fā)生HC；而血清CMV-DNA正常的患者中，僅4例(5.5%，4/73)發(fā)生HC；兩組發(fā)生HC的患者比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.79，P<0.05)。

2.2 CMV尿癥患者的臨床特點(diǎn)

CMV尿癥患者臨床特點(diǎn)和轉(zhuǎn)歸見(jiàn)表1。20例出現(xiàn)CMV尿癥的患者中，男性12例，女性8例，中位年齡28歲；急性白血病17例，慢性粒細(xì)胞白血病1例，骨髓增生異常綜合征1例，重型再生障礙性貧血1例；同胞供者6例，無(wú)關(guān)供者14例。20例患者均出現(xiàn)不同程度的尿路刺激征，包括尿頻、尿痛、尿急，16例提示鏡下血尿，3例出現(xiàn)肉眼血尿，1例出現(xiàn)肉眼血尿并血凝塊。臨床考慮為CMV相關(guān)HC，即給予抗CMV病毒治療。治療前行尿細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，2例尿培養(yǎng)檢測(cè)出肺炎克雷伯菌。出現(xiàn)CMV尿癥的20例患者中，7例在出現(xiàn)尿路刺激征之前已檢測(cè)出CMV尿癥。

表1 CMV尿癥患者的臨床特點(diǎn)和轉(zhuǎn)歸

注：AML. 急性髓系白血??；CML. 慢性粒細(xì)胞白血病；ALL. 急性淋巴細(xì)胞白血??；AA. 再生障礙性貧血；MDS. 骨髓增生異常綜合征；血尿分度. 依據(jù)Droller標(biāo)準(zhǔn)[9]分為Ⅰ～Ⅳ度：鏡下血尿?yàn)棰穸?；肉眼血尿?yàn)棰蚨?；肉眼血尿伴小血凝塊為Ⅲ度；肉眼血尿伴血凝塊阻塞尿道需用儀器進(jìn)行血塊清除為Ⅳ度

2.3 HC的治療

在檢測(cè)出CMV尿癥后，即給予注射更昔洛韋治療(5 mg/kg，每12小時(shí)1次)，治療前行尿細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，治療期間每周1次動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清和尿CMV-DNA拷貝數(shù)。血清和尿CMV-DNA拷貝數(shù)降至參考值以下后，改為口服更昔洛韋直至連續(xù)2次CMV-DNA監(jiān)測(cè)均為陰性。血清和尿CMV-DNA均增高的16例患者中，1例CMV尿癥持續(xù)時(shí)間為7 d，11例持續(xù)14 d，4例持續(xù)21 d；僅尿CMV-DNA增高的4例患者，1例CMV尿癥持續(xù)時(shí)間為14 d，其余3例為7 d。20例HC患者中，14例經(jīng)更昔洛韋單藥治療后痊愈；3例單用更昔洛韋治療效果欠佳，在聯(lián)合膦甲酸鈉治療后痊愈；2例合并尿培養(yǎng)肺炎克雷伯菌陽(yáng)性的患者經(jīng)過(guò)抗菌及抗病毒治療后痊愈；另外1例患者經(jīng)抗病毒治療血清、尿CMV-DNA均轉(zhuǎn)為陰性后仍有肉眼血尿，考慮泌尿系統(tǒng)GVHD，加用甲潑尼龍治療后逐漸好轉(zhuǎn)。

3 討 論

CMV相關(guān)性HC的轉(zhuǎn)歸與早期抗病毒治療密切相關(guān)，因此我們需要一種可靠的方法做出早期診斷。目前，用于檢測(cè)CMV的標(biāo)本以及方法有很多種，ELISA法檢測(cè)CMV-IgG的陽(yáng)性率可達(dá)100%[10]。根據(jù)檢測(cè)手段的不同，檢測(cè)CMV的方法可簡(jiǎn)單分為非分子生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，前者包括血清學(xué)方法檢測(cè)CMV-IgG和CMV-IgM、病毒培養(yǎng)法、病毒抗原血癥法以及免疫組織化學(xué)法；后者包括PCR法、核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)以及核酸雜交法。CMV潛伏性感染時(shí)，其DNA復(fù)制水平較低；而活動(dòng)性感染時(shí)，CMV-DNA大量復(fù)制，因此對(duì)其DNA進(jìn)行定量分析可用于臨床上預(yù)測(cè)CMV疾病的發(fā)生。同時(shí)，定量PCR還能有效監(jiān)測(cè)抗病毒治療的療效，目前該技術(shù)已經(jīng)成為許多HSCT中心診斷和監(jiān)測(cè)CMV感染的標(biāo)準(zhǔn)方法。

本中心常規(guī)每周1次對(duì)接受HCST的患者進(jìn)行血清CMV-DNA監(jiān)測(cè)，對(duì)出現(xiàn)CMV血癥的患者同時(shí)監(jiān)測(cè)尿CMV-DNA。本研究中20例HC患者，7例在出現(xiàn)尿路刺激征之前即檢測(cè)出CMV尿癥，14例在出現(xiàn)臨床癥狀后檢測(cè)尿CMV-DNA，在證實(shí)合并CMV尿癥后即刻予抗病毒治療(合并細(xì)菌感染的2例患者同時(shí)使用抗生素治療)，最終19例患者均獲得了良好療效，另外1例患者經(jīng)過(guò)治療，血清、尿CMV-DNA均轉(zhuǎn)為陰性后仍有肉眼血尿，考慮泌尿系統(tǒng)GVHD，加用甲潑尼龍治療后逐漸好轉(zhuǎn)。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)[11]對(duì)非親緣allo-HSCT后并發(fā)HC的病例進(jìn)行了分析，8例HC中5例與CMV感染有關(guān)，此5例CMV相關(guān)HC的治療方法及療效與本中心相似。

本研究中20例患者根據(jù)臨床癥狀診斷為遲發(fā)型HC，排除出血體質(zhì)、血小板低等其他引起泌尿道出血的因素，血清和(或)尿CMV-DNA高于參考值，因此我們考慮為CMV相關(guān)HC。由于膀胱穿刺為有創(chuàng)檢查，在患者中難以開展，因此我們未能獲得CMV感染的病理學(xué)證據(jù)；但是從治療轉(zhuǎn)歸來(lái)看，采用更昔洛韋、膦甲酸鈉抗病毒治療獲得了良好效果，說(shuō)明HC與病毒感染有關(guān)。至于是哪一種或者哪幾種病毒感染，臨床上很難一一檢測(cè)。本研究中，雖然我們僅進(jìn)行了CMV相關(guān)檢查，并沒(méi)有檢查另外一種與HC密切相關(guān)的病毒——BK病毒，但根據(jù)治療過(guò)程分析，我們并沒(méi)有使用對(duì)BK病毒有效的西地福韋或者環(huán)丙沙星類藥物即治愈HC。因此，推測(cè)這20例患者發(fā)生HC可能與BK病毒感染無(wú)關(guān)。

尿液CMV-DNA定量檢測(cè)是用于診斷CMV感染的方法之一，主要用于嬰幼兒以及腎移植術(shù)后CMV感染的檢測(cè)[12-13]，也有用于診斷CMV相關(guān)HC的病例[14]。有研究報(bào)道尿液上皮細(xì)胞中CMV-DNA載量用于預(yù)測(cè)嬰兒CMV活動(dòng)性感染是一種簡(jiǎn)便、有效的方法，并能用于治療和監(jiān)測(cè)[12]。尚未查詢到有關(guān)血清聯(lián)合尿CMV-DNA定量監(jiān)測(cè)對(duì)HSCT后HC診斷意義的相關(guān)報(bào)道。本研究同時(shí)檢測(cè)了120例患者血和尿CMV-DNA，其中20例(16.7%)出現(xiàn)HC，與其他臨床中心的報(bào)道結(jié)果相似[4-5]。出現(xiàn)CMV血癥的患者與血清CMV-DNA正常的患者中發(fā)生HC的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CMV血癥是發(fā)生HC的高危因素。對(duì)于出現(xiàn)CMV血癥的患者，有必要同時(shí)監(jiān)測(cè)尿CMV-DNA，以利于早期診斷和早期抗病毒治療，提高CMV相關(guān)性HC的治愈率。此外，血清和尿CMV-DNA均增高的16例患者中，1例 CMV尿癥持續(xù)時(shí)間為7 d，11例持續(xù)14 d，4例持續(xù)21 d；僅尿CMV-DNA增高的4例患者中，1例CMV尿癥的持續(xù)時(shí)間為14 d，其余3例為7 d。該結(jié)果提示，對(duì)于血清和尿CMV-DNA均增高的HC患者，我們預(yù)計(jì)可能需要更長(zhǎng)療程的抗病毒治療，因此要做好減少抗病毒藥物不良反應(yīng)的相關(guān)準(zhǔn)備。

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(本文編輯：鮑夏茜)

陸英, 張祥忠, 劉文達(dá), 等. 血清和尿CMV-DNA定量監(jiān)測(cè)對(duì)造血干細(xì)胞移植后出血性膀胱炎的診斷意義[J/CD]. 中華移植雜志：電子版, 2016,10(3):122-125.

Quantitative monitoring of serum and urine cytomegalovirus after hematopoietic stem cell transplantation and its significance on diagnosing hemorrhagic cystitis

LuYing1,2,ZhangXiangzhong1,LiuWenda2,LiuGuilian2,YuanQing2,LinDongju1,2.

1DepartmentofHematology,2DepartmentofBloodTransfusion,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity, 510630Guangzhou,China

ZhangXiangzhong,Email:bradzxz@126.com

Objective To explore the significance of monitoring serum and urine cytomegalovirus (CMV) DNA on diagnosing hemorrhagic cystitis (HC) after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Methods We retrospectively analyzed clinical data of 120 HSCT recipients at the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from September 2011 to December 2015. Serum CMV DNA were tested weekly by real-time PCR from 7 days before preconditioning to 100 days after HSCT. For patients with CMV viremia or lower urinary tract symptoms, urine CMV DNA was also detected. Results Within 100 days after transplant, 47/120 (39.2%) patients developed CMV viremia and 16 patients meanwhile developed CMV uremia. Only 4 (5.5%) patients presented CMV uremia in the 73 patients with normal serum CMV DNA. All of the 20 patients with CMV uremia had complaints of lower urinary tract symptoms and were found abnormal urine routine test, then CMV related HC was diagnosed following by anti-virus treatment and obtained complete remission. Conclusions The incidence of CMV infection was still high during HSCT. For patients with CMV viremia, urine CMV DNA surveillance is necessary in order to diagnose HC early and improve the cure rate.

Cytomegalovirus; Hemorrhagic cystitis; Hematopoietic stem cell transplantation

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.03.006

廣東省自然科學(xué)基金(2014A030313138)

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科1，輸血科2

張祥忠, Email: bradzxz@126.com

2016-06-14)