體內(nèi)和細胞內(nèi)的活性物種的測定方法

李菲

自由基和其他活性O(shè)、N、Cl粒子，被廣泛認為對于許多與年齡有關(guān)的病的發(fā)展有作用?；蛘?，它甚至可以通過氧化和氧化損害對老化過程本身起作用。許多研究已經(jīng)顯示，對于老年癡呆癥病人腦中所有主要種類生物分子的不斷增加的氧化損害，其他氧化損害牽涉到的疾病，包括癌癥、動脈硬化癥以及其他神經(jīng)退化疾病和糖尿病。在這篇報道中，我們將調(diào)查測定活性物種的可行性方法，并特別強調(diào)對人類研究的應用。

許多誘人的技術(shù)，例如，L-譜帶具有硝酰探針的電子自旋共振成像自旋陷阻，在所有動物中直接測定活性物種還有待發(fā)展。但是目前為止，還沒有探針適合人類使用。大部分活性物種在體內(nèi)僅僅持續(xù)很短的時間，并且無法直接測定。有幾個例外：包括H2O2（下面將討論），或者還有NO。在某種意義上NO2-漿液水平已經(jīng)被要求脈管合成。

基本上有兩種方法來檢測短暫的活性物種：

●嘗試去阻止這些物種并測定這些被阻物種的水平。

●測定由活性物種引起的損害的水平，那就是說，氧化損害的量。

有些時候，也會用其他的方法。他們包括測定紅血球抗氧化損害和所有抗氧化物在體內(nèi)的流動活性，這些參數(shù)的降低常常作為氧化脅迫的證明。紅血球不能合成蛋白質(zhì)。然而，他們的抗氧化酶的水平隨著他們在循環(huán)中的老化也會下降。因此，他們含量的變化更能夠反映出血液中紅細胞在更新中的變化。如果這個變慢了，循環(huán)的紅血球?qū)⒃谄骄缴献兝匣⑶铱寡趸杆揭矊⒈憩F(xiàn)出降低趨勢。反之亦然，如果一種變化加速了血紅細胞的消除或者是增加了紅細胞生成素，紅細胞中抗氧化成分的水平將上升。然而，這樣的數(shù)據(jù)應該謹慎闡述。

介于用于測定它的方法，盡管不同的方法測定不同的物種，血漿或血清的總體抗氧化能力通常包括來自尿酸和白蛋白的主要貢獻。因此，例如，如果血漿白蛋白的水平下降了，TAC將降低，如果尿酸水平上升了，TAC將上升。血液中化學的多重變化發(fā)生在病人身上就意味著TAC變化謹慎說明了。TAC也同樣會受飲食影響，通常因為某食物的消耗可能會在血漿中或尿酸水平上產(chǎn)生變化。

唯一的能直接和詳細地“看見”自由基的技術(shù)是電子自旋共振，因為它能檢測出未成對電子的存在。然而，ESR僅能檢測相對不太活潑的原子團。因為活潑的原子團不能積累到一個足夠高的水平上來被測定。解決這個問題的一個方法是增加陷阻或探針，來攔截自由基，同它們反應來形成一個穩(wěn)定的基團，它能夠被ESR檢測到。全身ESR技術(shù)用于動物身上，但是現(xiàn)在由于缺少關(guān)于探針在人體上的安全數(shù)據(jù)，因此，現(xiàn)在無法應用于人類。很廣范圍的陷阻是可以用于動物和細胞組織的，不僅僅是試驗過和測試過的N-叔丁基-α苯基硝酸靈和5，5-二甲基-1-吡咯啉，N-氧化物，還有像1，1，3-三甲基-異吲哚，N-氧化物，DECPO，EPPN，DEPMPO，BMPO之類相對的新物質(zhì)。潛在的問題由Rosen以及其他人綜述概括了。一個通常未得到正確評價的問題是反應產(chǎn)品給予ESR的信號能迅速的在體內(nèi)和培養(yǎng)的細胞中消除，通過酶代謝或直接由VC等物質(zhì)降低。例如，當DMPO用于阻止OH-時，任何抗壞血酸鹽的出現(xiàn)都能夠直接減少DMPO-OH-加合物的量到ESR檢測不到的水平。許多文獻已經(jīng)提出了多種復合物抗氧化反應的例證，在基團產(chǎn)生體系的存在下，當化合物同DMPO或其他自旋陷阱加合時，通過測定ESR信號的減少這個結(jié)果在體外評定出的。這些文獻很少報道關(guān)鍵控制：增加的復合物是否會與產(chǎn)生原子團的系統(tǒng)發(fā)生沖突，分解H2O2或與Fe2+/H2O2鰲合，或者它是否直接與自旋陷阻加合物反應，把它降低到ESR檢測不到的物種。

Rizzi及其他人已經(jīng)引進了三甲基自由基，TAMOXO63，在含水條件下作為探測O2-的探針。在這種情況下，O2-同探針反應導致了ESR信號的丟失。TAMOXO63的一個優(yōu)點是它不受如Vc或降谷胱甘肽這類物質(zhì)降低的控制。

探測器的寬系列可以用來研究許多細胞項目，比如說pH變化，離子運動、識別各種各樣的細胞器。例如CCA的增多往往伴隨著氧化脅迫的提高。許多報紙雜志稱RS的產(chǎn)生可影響離子探針，或者離子探針對RS的形成有貢獻。比如說鈣黃綠素[69]線粒體追蹤器，一種用來鑒定線粒體的熒光探針，能刺激線粒體ROS的產(chǎn)生。

不管你用什么方法來追蹤活性物種或測定氧化性損傷，都必須考慮以下幾個方面：這個方法怎么操作，怎樣合成和它能達到什么樣的規(guī)模、數(shù)量。充分理解了這幾點，錯誤可以降低到最少并且自由基研究的活力領(lǐng)域可以繼續(xù)向前推進。

編輯 董慧紅