一株海洋貝類腸道瓊膠降解菌的篩選與鑒定

張林林, 江玉姬, 張龍濤, 鄭寶東, 張　怡, 王培森, 李慶旺

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

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一株海洋貝類腸道瓊膠降解菌的篩選與鑒定

張林林, 江玉姬, 張龍濤, 鄭寶東, 張怡, 王培森, 李慶旺

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

摘要:以瓊膠為唯一碳源，從海洋貝類腸道微生物共篩選出44株降解瓊膠的海洋細(xì)菌，通過(guò)初篩和DNS法測(cè)定酶活得到一株產(chǎn)酶最高的菌株A-001，酶活力可達(dá)到13.01 U·mL(-1).菌落形態(tài)為乳白色，革蘭氏陰性菌，呈彎曲短桿狀，通過(guò)微生物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌A-001具有運(yùn)動(dòng)性.據(jù)生理生化特征和16SrDNA序列可鑒定A-001為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus).

關(guān)鍵詞:貝類; 瓊膠酶; 細(xì)菌; 篩選; 鑒定

瓊膠，還被稱為瓊脂，具有水溶性，是一種復(fù)雜的混合物，三大海藻多糖之一.由于瓊膠具有較好的穩(wěn)定性與膠凝性等特性，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用十分廣泛[1].隨著海藻多糖工業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展，對(duì)瓊膠多糖降解酶的研究深度與廣度也在不斷加大.瓊膠酶及降解瓊膠的菌株也成為近年來(lái)海洋生物資源研究、開(kāi)發(fā)的焦點(diǎn)之一.

目前產(chǎn)瓊膠酶的海洋微生物主要是從海水中富集篩選而獲得的.海洋雜食動(dòng)物中的貝類多以藻類為食物來(lái)源，其腸道微生物具有較高的藻類多糖降解酶，開(kāi)發(fā)潛力較大.但目前為止，在無(wú)脊椎腸腔中篩選產(chǎn)多糖降解微生物的報(bào)道較少，僅見(jiàn)劉江濤等[2]從鮑腸道篩選出可降解瓊膠的多食鞘氨醇桿菌.本研究主要是從海洋貝類腸道中篩選出產(chǎn)瓊膠酶的菌株，以期獲得具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)酶菌株，為后續(xù)研發(fā)奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1試驗(yàn)原料花蛤、文蛤和海蚌(購(gòu)自福建省福州市馬尾海產(chǎn)品交易市場(chǎng))；瓊脂粉(分析純，購(gòu)自于北京康倍斯科技有限公司).

1.1.2主要儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)RXZ-280B，新江南儀器有限公司)，恒溫培養(yǎng)搖床(型號(hào)ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司)，紫外分光光度計(jì)(型號(hào)722，北京譜析通用有限責(zé)任公司)，滅菌鍋(型號(hào)HCO14-11-01)，Tbermal Cycler PCR儀(型號(hào)S1000)，超凈工作臺(tái)(型號(hào)SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，BIO RAD核酸電泳儀，冷凍離心機(jī)(型號(hào)Alleqra X-30R，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，超低溫冰箱(型號(hào)TSE240V，賽默非世爾科技公司)，高檔電子數(shù)顯卡尺(上海茳樺工量具有限公司)，微生物生理生化鑒定試劑盒(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，DNA試劑盒(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司).

1.1.3培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母抽提粉5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH調(diào)為約7.5.

2216E固體培養(yǎng)基(購(gòu)自中國(guó)青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)：蛋白胨5 g·L-1，酵母浸粉1 g·L-1，檸檬酸鐵0.1 g·L-1，氯化鈉19.45 g·L-1，氯化鎂5.98 g·L-1，硫酸鈉3.24 g·L-1，氯化鈣1.8 g·L-1，氯化鉀0.55 g·L-1，碳酸鈉0.16 g·L-1，溴化鉀0.08 g·L-1，氯化鍶0.034 g·L-1，硼酸0.022 g·L-1，硅酸鈉0.004 g·L-1，氟化鈉0.0024 g·L-1，硝酸鈉0.0016 g·L-1，磷酸氫二鈉0.008 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH 7.6±0.2.

斜面培養(yǎng)基：同2216E固體培養(yǎng)基.

分離篩選培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g·L-1，氯化鈉20 g·L-1，七水硫酸鎂0.5 g·L-1，硝酸鈉2 g·L-1，磷酸氫二鉀1 g·L-1，七水硫酸亞鐵0.02 g·L-1，氯化鈣0.2 g·L-1，pH 7.5.

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g·L-1，氯化鈉35 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，酵母浸膏10 g·L-1，七水硫酸鐵0.1 g·L-1，去離子水1 L，pH 7.

種子發(fā)酵培養(yǎng)基：同液體發(fā)酵培養(yǎng)基相同，pH約為7.5.

上述培養(yǎng)基均采用121 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌；所有試驗(yàn)試劑均為分析純或生化試劑.

1.1.4主要試劑pH 7磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液；DNS試劑；魯戈氏碘液(碘1 g；碘化鉀2 g；蒸餾水300 mL).

1.2樣品處理

采用75%的酒精對(duì)海蚌、文蛤與花蛤的表面進(jìn)行擦拭消毒處理，然后在超凈工作臺(tái)里分別獲得該三種海產(chǎn)品的腸道，放入無(wú)菌的研缽里，加入1 mL的無(wú)菌生理鹽水，快速研磨，靜置5 min后吸取上清液1 mL進(jìn)行梯度稀釋為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8備用.

1.3菌株篩選

1.3.1分離培養(yǎng)在2216E平板的上面分別接入稀釋度不同的菌液0.2 mL，涂勻，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，然后從平板上挑取單菌落在新鮮無(wú)菌的平板上再次進(jìn)行劃線分離純培養(yǎng)，純化后的菌株保存于2216E斜面培養(yǎng)基上并編號(hào).

1.3.2初篩從2216E平板上共分離到90株菌株，將2216E斜面培養(yǎng)基上保存的90株菌株進(jìn)行活化，將活化的菌株用無(wú)菌牙簽接種到篩選培養(yǎng)基上，于28 ℃倒置培養(yǎng)48 h后，觀察菌落周圍現(xiàn)象，把周圍有顯著凹陷或者透明圈的菌落挑選出來(lái)，并在2216E斜面培養(yǎng)基上保存，得到可以降解瓊膠的菌株.

1.3.3染色復(fù)篩將具有降解瓊膠的菌株用無(wú)菌牙簽接種在篩選培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h后，用魯戈氏碘液進(jìn)行染色觀察.如果菌株產(chǎn)瓊膠酶可以降解瓊膠，則瓊膠被降解后不會(huì)被染色，而菌落周圍將形成透明圈[3]，測(cè)定透明圈的直徑.

1.3.4測(cè)酶活復(fù)篩取經(jīng)過(guò)純化的可降解瓊膠菌株，按無(wú)菌操作各挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有25 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶里，于28 ℃、150 r·min-1的搖床中震蕩培養(yǎng)24 h，再分別取10 mL種子培養(yǎng)液接種到90 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，150 r·min-1搖床震蕩培養(yǎng)32 h，將發(fā)酵好的培養(yǎng)液于5000 r·min-1、4 ℃條件下離心15 min，取上清液作為胞外酶粗酶液測(cè)定酶活力，篩選出酶活最高的菌株.

1.4酶活力測(cè)定

瓊膠酶活性測(cè)定采用DNS(3,5二硝基水楊酸)法[4-5]，以原糖增加量作為指標(biāo)：取1 mL粗酶液加入裝有20 mL 0.2%瓊膠底物的三角瓶中，于35 ℃搖床內(nèi)震蕩反應(yīng)60 min，對(duì)照組用1 mL滅酶液和20 mL 0.2%瓊膠底物混合液在同樣條件下反應(yīng)相同的時(shí)間.反應(yīng)結(jié)束后，取2 mL反應(yīng)液加入2 mL的DNS試劑于沸水中反應(yīng)5 min，迅速冷卻至室溫，然后定容至6 mL并充分混勻，以滅酶的反應(yīng)液為參比，于520 nm處測(cè)定吸光值.酶活力單位的定義：溫度為35 ℃時(shí)，1 min內(nèi)產(chǎn)生1 μg還原糖(以半乳糖計(jì))所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位(U).

△A：吸光度；n：稀釋倍數(shù)；t：反應(yīng)時(shí)間60min；7.3：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；0.2526：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距.

1.5菌株鑒定

1.5.1形態(tài)觀察和生理生化鑒定對(duì)生長(zhǎng)48h后A-001菌體的形態(tài)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行革蘭氏染色.生理生化的鑒定試驗(yàn)按照第八版《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]進(jìn)行，本試驗(yàn)選用的是弧菌科細(xì)菌鑒定管(購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，根據(jù)GYZ-9V鑒定系統(tǒng)，一共有9項(xiàng)生化試驗(yàn)，分別是：賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、葡萄糖產(chǎn)氣、蔗糖、甘露醇、水楊苷、6%氯化鈉和枸櫞酸鹽.這些生化實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)鄰單胞菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬和屬內(nèi)不同的種進(jìn)行區(qū)別.按本鑒定系統(tǒng)的要求，首先要確定被鑒定的菌株是弧菌科的，否則將無(wú)法鑒定.弧菌科細(xì)菌的代謝為發(fā)酵型，氧化酶為陽(yáng)性，但在弧菌屬中梅氏弧菌比較特殊，為氧化酶陰性.故在用GYZ-9V鑒定系統(tǒng)鑒定細(xì)菌前，須先確認(rèn)分離菌株為氧化—發(fā)酵(OF)型代謝和氧化酶陽(yáng)性.

1.5.216SrDNA序列測(cè)定及同源性分析對(duì)A-001菌株進(jìn)行培養(yǎng)后收集菌體細(xì)胞，使用DNA試劑盒提取細(xì)菌全基因組，以提取得到的細(xì)菌基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增16SrDNA，采用細(xì)菌鑒定的通用引物：正向引物為27F：5′-GAAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-GGTTACCTTACGACTT-3′.PCR反應(yīng)體系(25uL)：2×EcoTaqPCRSuperMix(+dye)12.5μL(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2倍)；20μmol·L-1上下游引物各0.5μL；細(xì)菌DNA模板1.0μL；ddH2O10.5μL.擴(kuò)增的條件為94 ℃預(yù)變性5min，94 ℃變性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10min.取PCR產(chǎn)物7μL上樣于1%的瓊脂糖凝膠孔中，于100V電壓下電泳30min后，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)目的條帶.將PCR產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌基因測(cè)序，再將測(cè)定的16SrDNA基因序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上進(jìn)行比對(duì).

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)瓊膠酶菌株的初篩與復(fù)篩

從90個(gè)菌株通過(guò)篩選培養(yǎng)基篩選得到44株降解瓊脂的細(xì)菌，將這44株菌進(jìn)行復(fù)篩，獲得6株具有較大透明圈的菌株A-001、A-007、A-014、D-002、J-003、J-004，其透明圈的直徑分別為29.00、26.17、28.00、13.23、14.71、27.29mm，其中A-001和A-014經(jīng)魯戈氏碘液染色后的透明圈最大，如圖1所示.

2.2瓊膠酶活的測(cè)定

將魯戈氏染色后透明圈較大的6株菌，采用DNS法測(cè)定瓊膠酶活性(表1).其中，A-001菌株具有較高的酶活性，酶活為13.01 U·mL-1，由表1可知酶活最高的菌株A-001是酶活最低菌株J-004的1.94倍.

表1　不同菌株產(chǎn)瓊膠酶的活性

2.3菌落形態(tài)觀察

菌株A-001在分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落濕潤(rùn)，顯乳白色，邊緣整齊，圓形，如圖2所示.菌株培養(yǎng)72 h菌落直徑為2.6 mm.革蘭氏染色為陰性，顯微鏡下觀察菌體為彎曲短桿狀.

2.4生理生化鑒定

在使用弧菌科細(xì)菌生化鑒定編碼(GYZ-9V)系列之前，對(duì)A-001菌株進(jìn)行了0-F試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn).結(jié)果表明：A-001菌株為F(發(fā)酵型)型，氧化酶陽(yáng)性.因此，屬于弧菌科細(xì)菌.結(jié)合生理生化特性(表2)，可判定A-001菌株為弧菌屬.

表2　菌株A-001的生理生化特性1)

1)“+”為陽(yáng)性；“-”為陰性.

2.516SrDNA序列分析及同源性分析

將提取的A-001菌株總DNA，利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對(duì)照為2000 bp的Mark，根據(jù)電泳條帶可知，菌株A-001的16SrDNA基因長(zhǎng)度約為1500 bp，送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，確定16SrDNA基因序列長(zhǎng)度為1420 bp.將測(cè)得的基因序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),相似度在98%以上的菌株見(jiàn)表3.

表3　核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)中與A-001相似度為98%以上的菌株

菌株A-001的16SrDNA序列與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)中的14株弧菌(Vibriosp.)的16SrDNA序列相似度均達(dá)到98%以上，因此可以判斷A-001菌株是弧菌屬.由于A-001與Vibrioalginolyticus; V20007145,Vibrioalginolyticus; KVD-HL42,Vibrioalginolyticus; L67的同源性分別為99.8%、99.4%、99.3%，可以認(rèn)為A-001是一株溶藻弧菌.雖然國(guó)內(nèi)外從海水中已分離出多株可以降解瓊膠的弧菌，如劉麗莉[4]在海水中分離到一株產(chǎn)瓊膠酶的弧菌，酶活為32.1 U·mL-1；Wang et al[8]在海水中分離到的產(chǎn)瓊膠酶弧菌的酶活為310 U·mL-1，雖然A-001酶活不高，但是在貝類腸道微生物篩選出可降解瓊膠的溶藻弧菌，國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道.本研究從貝類腸道篩選到的溶藻弧菌具有特異性，對(duì)于貝類養(yǎng)殖具有潛在應(yīng)用價(jià)值.目前已據(jù)報(bào)道可以降解瓊膠的弧菌，有杜宗軍等[9]從海水里得到Vibriotubiashii; Aoki et al[10]從海水里得到海洋細(xì)菌Vibriosp. AP-2；Sugano et al[11]得到Vibriosp. strain JT0107，因?yàn)樵诤颂求w基因庫(kù)中沒(méi)有找到這些菌株的16SrDNA序列，因此無(wú)法進(jìn)行同源性比對(duì).

3結(jié)論

本研究從海洋貝類腸道分離到多株降解瓊膠的菌株，經(jīng)過(guò)比較各菌株產(chǎn)生透明圈的大小和DNS法測(cè)胞外酶活判斷其降解瓊膠的能力，得到了瓊膠酶活最高的菌株是A-001，酶活力達(dá)到13.01 U·mL-1.通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)和16SrDNA序列比對(duì)分析，可知該菌株與溶藻弧菌的同源性最高，初步鑒定為溶藻弧菌，命名為溶藻弧菌A-001.我們將對(duì)該菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究與誘變，以提高其產(chǎn)酶能力和酶活性，應(yīng)用于生產(chǎn).

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Screening and identification of agarase-producing microbes in sea shellfish gut

ZHANG Linlin, JIANG Yuji, ZHANG Longtao, ZHENG Baodong, ZHANG Yi, WANG Peisen,LI Qingwang

(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Abstract:Agarase-producing microbes becomes hotspot for research and development on marine resources as agarase is mainly produced by microbes in sea shellfish gut. Agarose was used as the only carbon source. Forty-four strains of agar-degrading bacteria were initially screened from marine shelfish gut. Then 6 strains, which presented bigger transparent circle around colony by Lugosi iodine liquid staining than the rest, were re-screened. Among them, strain A-001 showed the maximum enzyme activity at 13.01 U·mL(-1) by DNS method. For the colony morphology, the strain A-001 was ivory, gram-negative and short rod. Through the dynamic experiment, the strain A-001 showed motility. Based on physiological and biochemical characteristics and 16SrDNA sequencing results, strain A-001 was identified as Vibrio alginolyticus.

Key words:shellfish; agarase; bacteria; screening; identification

DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.01.015

中圖分類號(hào):Q939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1671-5470(2016)01-0089-05

作者簡(jiǎn)介:張林林(1987-)，女，碩士研究生.研究方向：食品加工與安全.Email：zhanglinlin801@163.com.通訊作者江玉姬(1966-)，女，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：食品微生物、食用菌.Email：jyi1209@163.com.

基金項(xiàng)目:海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08).

收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-09-21