120例耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與基因突變的研究

黃穎新　潘景芝　汪洋　閆娜　孫集思

【摘 要】 目的：通過對(duì)耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與耐藥基因突變的探討，初步明確耐多藥肺結(jié)核客觀化指征。方法：選擇120例耐多藥肺結(jié)核患者，利用現(xiàn)代基因芯片檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼耐藥的基因突變位點(diǎn)，并分析比較其在各中醫(yī)證候間出現(xiàn)的幾率。 結(jié)果：利福平耐多藥肺結(jié)核基因突變位點(diǎn)主要集中于rpoB-531（62.50%）和rpoB-526（19.17%）二個(gè)位點(diǎn)，其中在rpoB-531基因突變位點(diǎn)上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證比肺陰虧虛證、陰陽(yáng)兩虛證發(fā)生率顯著增高；在rpoB-526基因突變位點(diǎn)上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證發(fā)生率明顯增高。異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點(diǎn)上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證發(fā)生率顯著增高；在inhA15基因突變位點(diǎn)上，陰陽(yáng)兩虛證比肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證發(fā)生率明顯增高。結(jié)論：耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點(diǎn)rpoB-526和/或KatG315突變可作為肺陰虧虛證的辨證指征，inhA15突變作為陰陽(yáng)兩虛證的辨證指征，rpoB-531突變可作為陰虛火旺證、氣陰兩虛證的辨證指征。

【關(guān)鍵詞】 耐多藥肺結(jié)核；中醫(yī)證候；基因突變

【中圖分類號(hào)】R259 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）06-0078-03

2007年我國(guó)被世衛(wèi)組織列為全球25個(gè)耐多藥結(jié)核病和嚴(yán)重耐多藥結(jié)核病最優(yōu)先控制的國(guó)家之一，且位居第一位。耐多藥結(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）已成為世界范圍最為嚴(yán)重的流行疾病，其治療費(fèi)用多，治愈率低，死亡率高，是結(jié)核病控制所面臨的最大難題[1]。證候是中醫(yī)臨床診斷和治療的邏輯起點(diǎn)，是辨證論治的核心，加強(qiáng)揭示規(guī)律和本質(zhì)的中醫(yī)證候?qū)W研究具有重要的意義[2]。本研究選取120例耐多藥肺結(jié)核病例，應(yīng)用現(xiàn)代分子基因芯片檢測(cè)技術(shù)分析利福平、異煙肼耐藥基因突變位點(diǎn)與中醫(yī)證候的關(guān)系，初步明確耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候客觀化指征，為提高辨證論治水平奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2014年12月住院及門診耐多藥結(jié)核病患者120例，其中男97例，女23例。年齡18～65歲，平均年齡（45.64±15.55）歲，病程3～600個(gè)月，平均病程（56.24±31.52）月。所有患者均符合《耐藥結(jié)核病防治手冊(cè)》[3]關(guān)于耐多藥肺結(jié)核的診斷，以及國(guó)家中醫(yī)藥管理局頒布的《中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)》[4]、《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[5]等關(guān)于“肺癆（肺結(jié)核）”的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①罹患各系統(tǒng)重大疾病、長(zhǎng)期服用免疫調(diào)節(jié)劑等可能干預(yù)中醫(yī)證候判斷的患者；②妊娠期或哺乳期婦女、精神病患者；③合并肺外結(jié)核病者。

1.2 中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn) ①肺陰虧虛證。主癥：干咳，盜汗，手足心熱；次癥：痰中帶血絲或血點(diǎn)，咳聲短促，胸部隱隱作痛，口燥咽干，顴紅，皮膚干灼；舌紅少津，脈細(xì)或細(xì)數(shù)。②陰虛火旺證。主癥：?jiǎn)芸葰饧?、午后潮熱、盜汗；次癥：時(shí)時(shí)咯血色鮮紅，形體消瘦，五心煩熱，骨蒸，失眠，顴紅，口渴，胸脅掣痛，痰少質(zhì)粘或痰黃稠量多，口燥咽干；舌紅干，苔薄黃或見花剝苔，脈細(xì)數(shù)。③氣陰兩虛證。主癥：氣短聲低、午后潮熱、自汗與盜汗并見；次癥：咳痰清稀、咳嗽無力，痰中夾血血色淡紅，神疲乏力，畏風(fēng)怕冷，納呆，顴紅，面色晄白；舌光淡，邊有齒印，脈細(xì)弱而數(shù)。④陰陽(yáng)兩虛證。主癥：形寒肢冷，自汗，盜汗；次癥：潮熱，五更泄瀉，面浮肢腫，咳逆喘促少氣，咯痰色白，痰中帶血絲色暗淡，男子遺精，女子經(jīng)少或經(jīng)閉；舌質(zhì)光淡甚者隱紫，少津，脈細(xì)數(shù)或虛大無力。以上以主癥必備其中兩項(xiàng)，次癥兼具兩項(xiàng)以上，綜合舌、脈象即可診斷，均由三位副主任中醫(yī)師以上職稱專家共同進(jìn)行判斷。120例耐多藥肺結(jié)核患者中肺陰虧虛證者11例，其中男9例，女2例，年齡20～64歲，平均年齡（44.09±16.18）歲，病程6～580個(gè)月，平均病程（57.18±30.96）月；陰虛火旺證者49例，其中男39例，女10例，年齡18～64歲，平均年齡（46.33±14.65）歲，病程3～590個(gè)月，平均病程（56.07±29.45）月；氣陰兩虛證者46例，其中男38例，女8例，年齡18～65歲，平均年齡（45.87±16.21）歲，病程5～600個(gè)月，平均病程（57.58±31.22）月；陰陽(yáng)兩虛證者14例，其中男11例，女3例，年齡19～65歲，平均年齡（46.23±15.34）歲，病程3～590個(gè)月，平均病程（57.41±32.15）月。各組患者男女比例，平均年齡以及平均病程等一般資料比較，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間具有可比性（P>0.05）。

1.3 基因芯片方法 選用Evidenceinvestigator-生物芯片儀（英國(guó)朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司生產(chǎn)）。核酸提?。喝?2ml痰標(biāo)本于標(biāo)本消化管內(nèi)，加入NaOH-NALC 2ml。室溫靜置15min。提取1ml的標(biāo)本處理液離心5min（12000r/min）共2次。向離心管內(nèi)加入80μl核酸提取液，渦旋振蕩混勻后移入核酸提取管。將核酸提取管于超聲振蕩器中震蕩15min。待水浴鍋溫度達(dá)到 95℃以上后，將核酸提取管放入其中處理5min。取出后離心1min（12000r/min）。擴(kuò)增：將PCR擴(kuò)增試劑1、2、3分裝擴(kuò)增管中，18μl/管，每個(gè)管中加入2μl 模板DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品，做好標(biāo)記。將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀以下表的程序擴(kuò)增。雜交：根據(jù)樣品數(shù)目（n） 取2n個(gè)PCR管置于PCR架上，排成兩排，同一列編排為一組，分別向PCR管內(nèi)加入9μl雜交緩沖液；取出PCR產(chǎn)物，分別向列排管中加入反應(yīng)體系一3μl，在上側(cè)管內(nèi)加入3μl對(duì)應(yīng)體系二充分吸打混勻，在下側(cè)管內(nèi)加入3μl對(duì)應(yīng)體系三充分吸打混勻，各反應(yīng)體系共計(jì)15μl。將雜交混合物置于PCR儀上95℃加熱5min，待其變性后立即放入冰水混合物中冰浴3min。吸取13.5μl雜交混合物加入雜交反應(yīng)盒芯片點(diǎn)陣中，密封雜交盒。將雜交盒放入50℃預(yù)熱20min的雜交儀中；50℃雜交2h，轉(zhuǎn)速5r/min。讀?。喝〕鲭s交反應(yīng)盒組芯片，放入洗干儀進(jìn)行洗滌甩干。將處理好的芯片放入掃描儀，讀出結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)在中醫(yī)各證候間出現(xiàn)的幾率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 12. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析，其中計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點(diǎn)與中醫(yī)證候的相關(guān)性分析 利福平耐多藥肺結(jié)核基因突變位點(diǎn)主要集中于rpoB-531（62.50%）和rpoB-526（19.17%）二個(gè)位點(diǎn)，其中在rpoB-531基因突變位點(diǎn)上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證與肺陰虧虛證、陰陽(yáng)兩虛證比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明陰虛火旺證、氣陰兩虛證與肺陰虧虛證、陰陽(yáng)兩虛證比較，其rpoB-531基因突變發(fā)生率顯著增高，提示rpoB-531基因突變可作為陰虛火旺證和氣陰兩虛證的基因辨證特征之一；在rpoB-526基因突變位點(diǎn)上，肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證比較，其rpoB-526基因突變發(fā)生率明顯增高，提示rpoB-526基因突變可作為肺陰虧虛證的基因辨證特征之一。具體見表1。

2.2 耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候不同位點(diǎn)基因突變發(fā)生率的比較 耐多藥肺結(jié)核異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點(diǎn)上，肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著性差異（P<0.05），說明肺陰虧虛證與陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證等三型比較，其KatG315基因突變發(fā)生率更高，提示KatG315基因突變可作為肺陰虧虛證的基因辨證特征之一；在inhA15基因突變位點(diǎn)上，陰陽(yáng)兩虛證與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），說明陰陽(yáng)兩虛證與肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證比較，其inhA15基因突變發(fā)生率明顯增高，提示inhA15基因突變可作為陰陽(yáng)兩虛證的基因辨證特征之一。具體見表2。

3 討論

耐藥結(jié)核病是指經(jīng)體外藥物敏感等試驗(yàn)證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌對(duì)一種或多種抗結(jié)核化學(xué)治療藥物耐藥，目前共分四大類：?jiǎn)文退幗Y(jié)核病、耐多藥結(jié)核病、多耐藥結(jié)核病以及廣泛耐藥結(jié)核病。耐多藥結(jié)核病（簡(jiǎn)稱MDR-TB）是指結(jié)核分枝菌經(jīng)體外證實(shí)至少同時(shí)對(duì)利福平、異煙肼兩種以上抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥。結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥的機(jī)制包括靶結(jié)構(gòu)基因突變、藥物失活酶作用、細(xì)菌胞壁通透性改變和代謝途徑改變等多種模式，而目前已證實(shí)的主要機(jī)制是由于菌內(nèi)藥物作用靶編碼基因突變所致[6]。多項(xiàng)研究表明利福平的耐藥發(fā)生與RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB突變密切，異煙肼的耐藥發(fā)生與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG的缺失和突變及烯?；€原酶編碼基因inhA基因突變高度相關(guān)[7]。

基因芯片技術(shù)以其具有高通量、簡(jiǎn)便、微縮、平行化、集約化等方面的優(yōu)點(diǎn)，中醫(yī)藥臨床和研究領(lǐng)域如中醫(yī)證候研究、中藥藥理學(xué)研究、中藥有效成分篩選、中藥毒性及不良反應(yīng)研究等方面被廣泛應(yīng)用，在分子生物學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)研究之間架起了一座技術(shù)橋梁，為中醫(yī)藥客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化研究提供了技術(shù)上的保障。結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核化學(xué)治療藥物產(chǎn)生耐藥的最主要機(jī)制為細(xì)菌菌體內(nèi)藥物作用靶編碼基因的發(fā)生突變所致，利福平耐藥的產(chǎn)生與結(jié)核菌RNA聚合酶β亞基的編碼基因rpoB突變密切相關(guān)，異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG的缺失、突變及烯酰基還原酶編碼基因inhA基因突變高度相關(guān)，因此，通過利用基因芯片耐藥檢測(cè)技術(shù)，探討耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候與利福平、異煙肼耐藥基因突變位點(diǎn)之間相關(guān)性和內(nèi)在聯(lián)系，將有助于闡明基于基因水平的耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候之本質(zhì)。通過耐多藥肺結(jié)核中醫(yī)證候本質(zhì)和規(guī)律的研究，將有助于了解其疾病的病因、病機(jī)，為臨床辨證提供參考、證候標(biāo)準(zhǔn)的修訂與完善提供依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，利福平耐多藥肺結(jié)核基因突變位點(diǎn)主要集中于rpoB-531和rpoB-526二個(gè)位點(diǎn)，其中在rpoB-531基因突變位點(diǎn)上，陰虛火旺證、氣陰兩虛證比肺陰虧

虛證、陰陽(yáng)兩虛證基因突變發(fā)生率顯著增高；在rpoB-526基因突變位點(diǎn)上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證突變發(fā)生率明顯增高。異煙肼耐藥基因在KatG315基因突變位點(diǎn)上，肺陰虧虛證比陰虛火旺證、氣陰兩虛證、陰陽(yáng)兩虛證基因突變發(fā)生率顯著增高；在inhA15基因突變位點(diǎn)上，陰陽(yáng)兩虛證比肺陰虧虛證、陰虛火旺證、氣陰兩虛證基因突變發(fā)生率明顯增高。李桂蓮等[8]分析了30株利福平耐藥菌株的rpoB基因突變情況：總突變率為96.7%，其中rpoB 531突變率為70.0%，rpoB 526突變率為16.7%，利福平MIC≥32.00μg/ml與0.500～16.00μg/ml相比，菌株rpoB 531和rpoB 526基因位點(diǎn)的突變發(fā)生率高，推斷rpoB基因突變與利福平高水平耐藥有關(guān)。孫鳳丹等[9]利用PCR-SSCP方法發(fā)現(xiàn)KatG菌耐異煙肼臨床分離株是主要的基因突變類型，說明KatG在INH耐藥中起主導(dǎo)作用，但某些菌株的耐異煙肼可能與KatG無關(guān)，而與inhA基因突變有關(guān)。因此，KatG基因突變是異煙肼耐藥性的重要分子機(jī)制，inhA基因突變是重要的輔助機(jī)制。

綜上所述，耐多藥肺結(jié)核利福平耐藥基因位點(diǎn)rpoB-526和/或KatG315突變可作為肺陰虧虛證的辨證指征，inhA15突變作為陰陽(yáng)兩虛證的辨證指征，rpoB-531突變可作為陰虛火旺證、氣陰兩虛證的辨證指征。

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（收稿日期：2016.01.09）