提高L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)水平的幾種方法

O 黃 平

（福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心 福建 350008）

提高L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)水平的幾種方法

O 黃 平

（福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心 福建 350008）

目前,國(guó)內(nèi)L-纈氨酸工業(yè)化生產(chǎn)還存在著許多問題，例如：產(chǎn)酸率低、雜酸比例高、易染菌等，這與日本等國(guó)的生產(chǎn)水平還有較大差距。本文歸納了國(guó)內(nèi)纈氨酸產(chǎn)業(yè)化過程采取的一些方法，對(duì)于L-纈氨酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的參考意義。

L-纈氨酸；發(fā)酵生產(chǎn)fv

L-纈氨酸是人體必需的一種支鏈氨基酸，具有多種生理功能。它被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)，例如，纈氨酸可以作為食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和增香劑；在醫(yī)藥工業(yè)中用于制造復(fù)合氨基酸注射液和用來合成纈沙坦等藥物；在飼料行業(yè)中可以作為一種限制性氨基酸添加劑，提高動(dòng)物的生產(chǎn)品質(zhì)。

由于其用途廣泛，市場(chǎng)上高純度的L-纈氨酸處于供不應(yīng)求局面，因此，相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)都在努力提高纈氨酸的生產(chǎn)水平。

一、分子改造

目前，國(guó)內(nèi)多數(shù)企業(yè)使用的L-纈氨酸生產(chǎn)菌株來源反復(fù)誘變，遺傳背景十分不清晰，很難通過進(jìn)一步誘變來提高纈氨酸的生產(chǎn)水平。

近年來，隨著谷氨酸棒桿菌的全基因組測(cè)序及基因功能分析的完成，分子改造已被廣泛用于構(gòu)建纈氨酸高產(chǎn)菌株，成為提高L-纈氨酸發(fā)酵生產(chǎn)水平的有效方法。利用已知的谷氨酸棒桿菌遺傳學(xué)信息，采用基因工程技術(shù)改造谷氨酸棒桿菌以提高纈氨酸的產(chǎn)量。

一些適用于用于谷氨酸棒桿菌的表達(dá)載體已經(jīng)被構(gòu)建，這些表達(dá)載體一般為大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌的穿梭載體，有的屬于誘導(dǎo)性表達(dá)，有屬于組成型表達(dá)。由于同一啟動(dòng)子在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中的活性差別比較大，所以針對(duì)谷氨酸棒桿菌中啟動(dòng)子的研究也已經(jīng)展開，與此同時(shí)，在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基困敲除的各種方法也被建立。目前，有學(xué)者已經(jīng)從優(yōu)化啟動(dòng)子、抑制雜酸合成、解除反饋抑制、增加抗性等方面構(gòu)建出一些高產(chǎn)L-纈氨酸的工程菌。

圖1 谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGC42

福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心課題組通過分子改造優(yōu)化了啟動(dòng)子并在質(zhì)粒pGC42中增加了卡那霉素抗性，質(zhì)粒圖譜見圖1，構(gòu)建了一株L-纈氨酸的工程菌V3，搖瓶產(chǎn)酸由出發(fā)菌株的2.3%提高到3.3%，效果十分明顯。

二、培養(yǎng)基優(yōu)化

優(yōu)良的菌種也需要最佳的培養(yǎng)基條件相匹配才能發(fā)揮其生產(chǎn)性能，在纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，玉米漿、酵母膏和生物素(VH)是非常重要的組成成分。

玉米漿成分非常復(fù)雜，為微生物生長(zhǎng)代謝提供所需的各種氨基酸、有機(jī)磷、生長(zhǎng)因子、核酸等。若玉米漿用量不足，菌體生長(zhǎng)繁殖受到限制，菌體濃度達(dá)不到高密度要求，對(duì)產(chǎn)酸不利；用量過多，則菌體濃度大，消耗過多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，雜酸比例增多，影響纈氨酸的積累。本課題組經(jīng)過大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玉米漿的質(zhì)量會(huì)顯著影響纈氨酸的產(chǎn)量，當(dāng)玉米漿中的有機(jī)磷含量低于2%就會(huì)顯著影響纈氨酸的產(chǎn)量，一般來說有機(jī)磷含量在3%以上的玉米漿質(zhì)量較為理想。

酵母浸膏富含完全蛋白質(zhì)，多種氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等，是最為理想的生物培養(yǎng)基原料和發(fā)酵工業(yè)中的主要原料，可以大大提高菌種的生產(chǎn)速率及發(fā)酵產(chǎn)品得率。在纈氨酸種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的酵母膏可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，但酵母膏過量則會(huì)導(dǎo)致菌體密度過大，影響纈氨酸積累。

生物素的濃度會(huì)影響細(xì)胞壁的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的分泌。當(dāng)生物素用量過少時(shí)，細(xì)胞壁合成不足，不利于菌體的生長(zhǎng)；用量過多則使細(xì)胞壁合成過量，添加影響氨基酸分泌到胞外。

此外，有研究表明，在培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉能顯著降低枯草芽胞桿菌代謝途徑中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力，檸檬酸和葡萄糖的聯(lián)合代謝還會(huì)減弱糖酵解途徑，從而抑制有機(jī)雜酸的生成。本課題組在此研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，在谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的檸檬酸鈉，配方見表1，在30L罐試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸的產(chǎn)量可以由原來的6.7%提高到8.2%，雜酸比例由原來的28%降低到15%，效果非常明顯。

表1 纈氨酸發(fā)酵配方

三、搖瓶菌種篩選

搖瓶培養(yǎng)技術(shù)問世于二十世紀(jì)30年代，由于其簡(jiǎn)便、實(shí)用，很快便被發(fā)展成為微生物培養(yǎng)中極重要的技術(shù)而普及，并廣泛用于工業(yè)微生物菌種篩選、實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模發(fā)酵試驗(yàn)、種子培養(yǎng)等，也常用于生產(chǎn)工藝的改良和工藝參數(shù)的優(yōu)化。

由于生產(chǎn)菌種是先經(jīng)過甘油管保藏后再提供大生產(chǎn)使用，在保藏過程中很有可能出現(xiàn)退化的情況，因此需要重新挑取一定數(shù)量單菌落進(jìn)行篩選，以篩選出生長(zhǎng)情況最穩(wěn)定、產(chǎn)酸水平最高的菌種提供給大生產(chǎn)。

搖瓶篩選的培養(yǎng)基應(yīng)與大罐發(fā)酵培養(yǎng)基保持一致，培養(yǎng)條件也應(yīng)盡量與大生產(chǎn)相匹配。搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后通過鏡檢各搖瓶菌種的生長(zhǎng)情況、測(cè)定各搖瓶培養(yǎng)基pH值和產(chǎn)酸情況以確定最佳菌種保證提供給大生產(chǎn)。

四、30L小罐菌種驗(yàn)證

菌種的小罐驗(yàn)證也是氨基酸放大生產(chǎn)過程中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。提供大生產(chǎn)的菌種雖然經(jīng)過搖瓶篩選，但依然有可能會(huì)出現(xiàn)“水土不服”的情況,表現(xiàn)為菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酸減少甚至直接導(dǎo)致倒罐等嚴(yán)重情況。

原因是搖瓶篩選的條件和大罐生產(chǎn)的條件是兩個(gè)不同尺度考量的問題，搖瓶產(chǎn)酸高并不完全意味著在發(fā)酵罐上會(huì)表現(xiàn)良好。

通過30L小罐驗(yàn)證，淘汰產(chǎn)酸不穩(wěn)定的菌種就可以大大降低此類事情發(fā)生的概率，菌種驗(yàn)證是本課題組保障大生產(chǎn)菌種安全穩(wěn)定的一個(gè)重要工作環(huán)節(jié)。

五、展望

目前，國(guó)內(nèi)生物技術(shù)的發(fā)展也促使發(fā)酵行業(yè)的飛速發(fā)展，使得L-纈氨酸的生產(chǎn)工藝由以前的技術(shù)含量低、勞動(dòng)強(qiáng)度大、能耗高、轉(zhuǎn)化率低發(fā)展到現(xiàn)在的技術(shù)含量高，自動(dòng)化程度高、能耗低、轉(zhuǎn)化率高。隨著國(guó)內(nèi)生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，纈氨酸的生產(chǎn)水平會(huì)逐步提高，逐步達(dá)到日本等發(fā)達(dá)國(guó)家的水平。

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Several methods of improving the fermentation production level of L- valine

Huang Ping
（Fujian research center of Fuzhou Province, province, Mai Dan biological Group Co., Ltd.,Fujian,350008）

At present, domestic L-valine industrial production still exist many problems, for example: acid production rate low, heteropoly acid ratio is high, easy to be infected by bacteria and other, the production level of this with Japan and other countries there is a large gap. This paper sums up the domestic valine industrialization process to adopt some methods, for the large-scale industrial production of L-valine has certain reference significance.

L- valine；fermentation FV

T

A

黃平（1982～），男，福建省麥丹生物集團(tuán)有限公司福州研究中心，研究方向：生物化工、發(fā)酵工程。