丙酮萃取分光光度法測(cè)定水中葉綠素a實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

李旭冉，梅鵬蔚，王琳，姜偉

(天津市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津 300191)

丙酮萃取分光光度法測(cè)定水中葉綠素a實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

李旭冉，梅鵬蔚，王琳，姜偉

(天津市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，天津 300191)

基于丙酮萃取分光光度法，對(duì)葉綠素a測(cè)定方法進(jìn)行深入研究，并通過單因素重復(fù)試驗(yàn)對(duì)凍存時(shí)間、凍存溫度、萃取時(shí)間、萃取溫度、細(xì)胞破碎方式、萃取劑濃度及萃取混合液提取方式等7方面的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件為：水樣經(jīng)過抽濾后，置于-25 ℃低溫冰箱中凍存12 h后取出，在常溫下加入分析純丙酮，用力振搖2 min至濾膜充分粉碎后定容到10 mL，靜置不超過0.5 h，在離心機(jī)內(nèi)以4 000 r/min的速度離心，取上清液進(jìn)行比色。

葉綠素a；丙酮萃??；分光光度法

在養(yǎng)料豐富、流動(dòng)緩慢的水中，浮游植物的大量繁殖及死亡是水體富營養(yǎng)化、水生生態(tài)系統(tǒng)失衡的主要誘因[1-3]。葉綠素a含量是反應(yīng)浮游植物生物量和初級(jí)生產(chǎn)力水平最直接有效的指標(biāo)[1]。故葉綠素a含量可作為評(píng)價(jià)湖泊富營養(yǎng)化的指標(biāo)之一。

葉綠素a的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、熒光光度法和分光光度法等。環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用最廣的是丙酮萃取分光光度法[4]。該法靈敏度高，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作也簡(jiǎn)便。但存在在反復(fù)研磨過程中葉綠素a易發(fā)生光解，丙酮極易揮發(fā)并污染環(huán)境，浸提保存的時(shí)間和溫度規(guī)定范圍過于寬泛，具體操作的約束條件不夠嚴(yán)格統(tǒng)一等問題，從而易引入較大誤差，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。已有研究顯示，用丙酮萃取葉綠素a，不同的萃取時(shí)間、萃取劑配比、萃取溫度以及過濾方式均對(duì)葉綠素a的測(cè)定結(jié)果有影響[6-8]。因此，對(duì)丙酮萃取分光光度法分析葉綠素a的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

DR6000型分光光度計(jì)(美國哈希)；LD4-8型低速離心機(jī)(雷勃爾)；DJP-2001-1型真空泵(北京國環(huán)高科自動(dòng)化技術(shù)研究所)；GLC-6型多聯(lián)不銹鋼過濾器(北京國環(huán)高科自動(dòng)化技術(shù)研究所)；組織勻漿器；乙酸纖維濾膜(孔徑0.45μm)。

碳酸鎂粉末，丙酮(分析純)。

1.2 樣品采集

按照國家地表水相關(guān)水樣采集技術(shù)規(guī)范采集水樣。采樣地點(diǎn)為天津市水上公園東湖，每批樣品采集不少于5個(gè)平行樣，單個(gè)水樣體積不少于1L，采樣后立即加入1%的碳酸鎂試液固定，并在4 h內(nèi)進(jìn)行制樣。

1.3 樣品制備

通過抽濾，將水樣中的浮游植物濃縮于乙酸纖維濾膜上后，將帶有浮游植物的濾膜凍存一定時(shí)間，取出濾膜，在90%丙酮中通過研磨、靜置等方式提取葉綠素a，然后通過離心、過濾等方式純化萃取液，將上清液匯入容量瓶中定容后待測(cè)。

1.4 樣品測(cè)定

將上清液置于1 cm光程的比色皿中，分別讀取750，663，645和630 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度測(cè)定，對(duì)樣品吸光度進(jìn)行校正。根據(jù)文獻(xiàn)[9]計(jì)算水中葉綠素a質(zhì)量濃度。

2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1 凍存時(shí)間

同批次采集30個(gè)平行樣，隨機(jī)分為6組，分別在-25 ℃凍存0，6，12，24，48和72 h，測(cè)得葉綠素a的結(jié)果見圖1。由圖1可見，凍存12 h葉綠素a的測(cè)定結(jié)果最大，標(biāo)準(zhǔn)偏差最小。這是因?yàn)閮龃?2 h，濾膜中剩余的水分已大部分升華，而浮游植物細(xì)胞的酶解反應(yīng)尚未明顯增強(qiáng)，故而對(duì)葉綠素a提取量的影響較小。因此，確定凍存時(shí)間為12 h。

圖1 不同凍存時(shí)間下葉綠素a的測(cè)定結(jié)果

2.2 凍存溫度

同批次采集15個(gè)平行樣，隨機(jī)分為3組，分別在-16，-20和-25 ℃凍存6 h，葉綠素a測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖2可見，樣品在-25 ℃凍存比在-16 ℃和-20 ℃凍存，葉綠素a的測(cè)定值更高，標(biāo)準(zhǔn)偏差更小。這是由于-25 ℃濾膜中浮游植物細(xì)胞內(nèi)的酶活性被進(jìn)一步抑制，酶解反應(yīng)進(jìn)一步減緩，減少了葉綠素a的損失。說明在更低溫度下進(jìn)行樣品的凍存有助于得到更加滿意的葉綠素a提取結(jié)果。故選擇凍存溫度為-25 ℃。

圖2 不同凍存溫度下葉綠素a的測(cè)定結(jié)果

2.3 萃取時(shí)間

同批次采集25個(gè)平行樣，隨機(jī)分為5組，分別在常溫條件下用90%丙酮萃取10 min，0.5，1，2和4 h，葉綠素a測(cè)定結(jié)果見圖3。由圖3可見，當(dāng)萃取時(shí)間在0.5 h以內(nèi)時(shí)，測(cè)定結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差較小；當(dāng)萃取時(shí)間超過0.5 h后，樣品中葉綠素a的提取量明顯降低，其測(cè)定結(jié)果也越來越不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差均較大。故萃取時(shí)間不宜超過0.5 h。

圖3 不同萃取時(shí)間下葉綠素a的測(cè)定結(jié)果

2.4 萃取溫度

同批次采集10個(gè)平行樣，隨機(jī)分為2組，分別在常溫[(20±5)℃]和50 ℃水浴條件下用90%丙酮萃取10 min，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可見，常溫下葉綠素a的測(cè)定值更高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差更小。說明升高萃取溫度并不能提高葉綠素a的萃取效率，相反，萃取溫度升高到50℃左右時(shí)，會(huì)加速丙酮的揮發(fā)，并破壞葉綠素a的分子結(jié)構(gòu)，降低方法的穩(wěn)定性。故確定萃取溫度為常溫，即(20±5)℃。

表1 不同萃取溫度下葉綠素a的測(cè)定結(jié)果

2.5 細(xì)胞破碎方式

同批次采集15個(gè)平行樣，隨機(jī)分為3組，分別采用組織勻漿器研磨、大功率超聲儀超聲處理 30 min和蓋嚴(yán)蓋子后在比色管中用力振搖2 min 3種方式進(jìn)行細(xì)胞破碎，葉綠素a測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，3種細(xì)胞破碎方式所得結(jié)果無明顯差異，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均<5%，表明3種細(xì)胞破碎方式均具有較高的方法穩(wěn)定性及精密度。只處理一個(gè)樣品時(shí)，超聲法耗時(shí)最長(zhǎng)，手搖振蕩法最短，組織勻漿器法操作更加劇烈，易使溶劑飛濺，造成玷污。因此，當(dāng)樣品量較少時(shí)，手動(dòng)振蕩2 min方式最省時(shí)，當(dāng)樣品量較大時(shí)，超聲30 min更便于對(duì)樣品進(jìn)行批量處理。

表2 不同細(xì)胞破碎方式下葉綠素a的測(cè)定結(jié)果

2.6 萃取劑濃度

同批次采集10個(gè)平行樣，隨機(jī)分為2組，分別以90%丙酮溶液和分析純丙酮作為萃取劑，二者對(duì)應(yīng)葉綠素a的測(cè)定結(jié)果無明顯差異(見表3)。由此可推知，在對(duì)水中浮游植物體內(nèi)的葉綠素a進(jìn)行提取時(shí)，二者在萃取效率、萃取體系的穩(wěn)定性等方面均比較接近。因此，可以嘗試以分析純丙酮代替90%丙酮對(duì)此類樣品進(jìn)行葉綠素a的提取。

2.7 萃取液提取純化方式

同批次采集10個(gè)平行樣，隨機(jī)分為2組，分別通過4 000 r/min離心和0.45 μm濾膜過濾的方式得到萃取物上清液，對(duì)應(yīng)葉綠素a測(cè)定結(jié)果見表4。由表4可見，濾膜過濾法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差更大(>10%)，這說明通過0.45 μm濾膜濾去萃取體系中殘?jiān)姆绞捷^不穩(wěn)定。這可能是由于濾膜中的某些物質(zhì)與丙酮溶劑相互作用，使濾膜部分溶解，使進(jìn)行比色的濾液濁度明顯增高而導(dǎo)致的。

表4 不同萃取液純化方式下葉綠素a的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果討論

葉綠素a測(cè)定值的偏低主要由葉綠素a的降解引起。當(dāng)細(xì)胞完全干燥時(shí)，引起降解的因素主要為光解和酶解[10]。通常狀態(tài)下，葉綠素酶是一種潛狀態(tài)酶，這種潛狀態(tài)是由葉綠素酶與其底物葉綠素在空間位置上的隔離造成的[11]。當(dāng)浮游植物細(xì)胞在體外尚未完全干燥時(shí)，過量的活性氧會(huì)加重細(xì)胞膜脂的過氧化程度和膜通透性，從而破壞這種“隔離”。“隔離”的崩壞促使葉綠素酶催化葉綠素及其衍生物側(cè)鏈酯鍵進(jìn)行水解，從而開啟葉綠素酶促降解代謝過程[12]。

含葉綠素a的濾膜在經(jīng)過抽濾和凍存后，仍含有少量的水分，在后續(xù)處理(如細(xì)胞破碎、萃取等)中發(fā)揮作用，使部分葉綠素降解，從而降低測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。這一影響會(huì)在樣品低溫干燥時(shí)，因水分隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升華而逐漸減弱。與此同時(shí)，隨凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，受酶解反應(yīng)影響，凍存中的浮游植物的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)越來越不穩(wěn)定，其所含的葉綠素a損失量也越來越多。故葉綠素a的提取量主要受凍存溫度和凍存時(shí)間的共同影響。

基于以上研究可知，優(yōu)化細(xì)化操作步驟和實(shí)驗(yàn)條件可以有效提升丙酮萃取分光光度法測(cè)定葉綠素a的提取效率，增加方法的穩(wěn)定性。

4 結(jié)語

通過單因素重復(fù)試驗(yàn)的方式，基于丙酮萃取分光光度法，在凍存時(shí)間、凍存溫度、萃取時(shí)間、萃取溫度、細(xì)胞破碎方式、萃取劑濃度、萃取液分離提純方式等7個(gè)方面對(duì)葉綠素a測(cè)定方法進(jìn)行了深入探討。建議采用如下途徑進(jìn)行葉綠素a的測(cè)定：水樣經(jīng)過抽濾后，置于-25 ℃低溫冰箱中凍存12 h后取出，在常溫下加入分析純丙酮，用力振搖至濾膜充分粉碎后定容到10 mL，靜置不超過0.5 h，在離心機(jī)內(nèi)以4 000 r/min的速度離心，取上清液進(jìn)行比色。

手動(dòng)劇烈振搖對(duì)濾膜中浮游植物細(xì)胞進(jìn)行破碎，在樣品量較少的情況下有效地提高了試驗(yàn)效率。

優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件有效降低了濾膜中殘存水分及所含雜質(zhì)對(duì)葉綠素a測(cè)定的影響。后續(xù)研究，將嘗試以凍干機(jī)內(nèi)的快速冷凍干燥替代冰箱內(nèi)凍存的步驟，進(jìn)一步提高葉綠素a的提取效率。

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Optimization of the Experimental Parameters in the Determination of Chlorophyll-a in Water using Acetone Extraction Spectrophotometry

LI Xu-ran，MEI Peng-wei，WANG Lin，JIANG Wei

(TianjinEnvironmentalMonitoringCenter，Tianjin300191，China)

Based on acetone extraction spectrophotometry， the determination of chlorophyll-a was investigated in depth. Seven experimental parameters were optimized through single factor repeat experiments， including freezing time， extraction time and temperature， cell lysis approaches， extractant concentrations and extraction approaches. The optimized experimental procedures were as follows. Water samples were filtered and stored at -25 ℃ for 12 h. The samples were then allowed to restore to room temperature before adding acetone and shaken vigorously for 2 min until the membrane was crushed completely. Samples were diluted to 10 mL and rested aside for less than 0.5 h. Finally， the samples were centrifuged at 4 000 r/min and taken the supernatant for colorimetry.

Chlorophyll-a; Acetone extraction; Spectrophotometry

2015-10-18；

2016-03-21

李旭冉(1985—)，男，工程師，碩士，主要從事環(huán)境監(jiān)測(cè)工作。

O657.32

B

1674-6732(2016)03-0025-03