腈水解酶固定化的研究進(jìn)展

黃季維，鄒樹平，鄭裕國（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014；2.生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江杭州310014）

?

腈水解酶固定化的研究進(jìn)展

黃季維1,2，鄒樹平1,2，鄭裕國1,2
（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江杭州310014；
2.生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江杭州310014）

摘要：腈水解酶在醫(yī)藥及其中間體、農(nóng)藥及其中間體、食品、飼料添加劑等精細(xì)化學(xué)品工業(yè)生產(chǎn)中具有十分廣泛的應(yīng)用。固定化腈水解酶便于貯存和重復(fù)利用，有利于產(chǎn)物分離和連續(xù)化生產(chǎn)。介紹了常用的腈水解酶固定化方法，如包埋法、吸附法、共價法、交聯(lián)法以及新型固定化方法，如膜截留固定化法、定向固定化法。這些固定化方法對提高腈水解酶穩(wěn)定性和重復(fù)使用批次起著重要的作用。

關(guān)鍵詞：腈水解酶；固定化；研究進(jìn)展

腈水解酶催化的水解反應(yīng)條件溫和、催化效率高、選擇性好、產(chǎn)物的光學(xué)純度高、對環(huán)境污染小且符合原子經(jīng)濟(jì)和綠色化學(xué)的理念。固定化生物催化劑有利于大規(guī)模的生物轉(zhuǎn)化過程的連續(xù)化，提高酶的穩(wěn)定性，增強(qiáng)使用效率，降低生產(chǎn)成本。同時，催化劑的固定化有助于產(chǎn)物的分離提取，降低了下游過程的分離成本，保障產(chǎn)品的質(zhì)量。越來越多學(xué)者對腈水解酶固定化方法進(jìn)行了研究，以期提高腈水解酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，使之更適合于大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。以下就幾種常用的腈水解酶固定化方法作一一介紹。

1　包埋固定化法

包埋法反應(yīng)條件溫和、有較高的酶包埋量、酶蛋白結(jié)構(gòu)不會遭到破壞、酶活回收率高，且對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至微生物細(xì)胞都可以進(jìn)行包埋固定化，是應(yīng)用最廣泛的固定化方法。

1.1海藻酸鈉包埋

海藻酸與二價以上的鹽類形成不溶性鹽，由此可形成耐熱性凝膠或被膜，這是海藻酸固定化凝膠形成的最重要特性，一般用鈣離子與海藻酸根螯合形成海藻酸鈣凝膠。海藻酸鈉完全無毒，相比其他高分子材料更為清潔，同時海藻酸鈉不能被絕大多數(shù)微生物分解或作為底物，所以是一種理想的生物固定化載體。

Almatawah等［1］利用海藻酸鈣包埋腈水解酶細(xì)胞Bacillus pallidus Dac521，在50 g/L海藻酸鈉，24 mg/mL細(xì)胞濃度，0.1 mol/L氯化鈣和pH 8.0 Tris-HCl緩沖液固定化條件下，其酶活回收率高達(dá)98%。在小型流化床中連續(xù)合成煙堿酸，100 mmol/L底物濃度下連續(xù)使用10個批次后酶活殘留70%。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞在60℃下溫度穩(wěn)定性得到明顯提高。然而單純用海藻酸鈉珠子包埋細(xì)胞存在機(jī)械強(qiáng)度低，反應(yīng)過程中珠子容易破裂等問題，一些科研人員對常見材料復(fù)合固定化進(jìn)行了研究?？紤]到海藻酸鈉質(zhì)脆且耐水性較差，重復(fù)使用性不好等問題，柳志強(qiáng)等［2］利用聚乙烯醇的親水性基團(tuán)以及強(qiáng)韌性來提高海藻酸鈉的抗水性能和改善質(zhì)脆的缺點。將海藻酸鈉結(jié)合聚乙烯醇復(fù)合包埋腈水解酶全細(xì)胞應(yīng)用于亞氨基二乙酸的生產(chǎn)。在10 g/L海藻酸鈉溶液，80 g/L聚乙烯醇溶液、10 g/L氯化鈣溶液和5 g/L濕細(xì)胞濃度下酶活回收率達(dá)到98.1%，在75 mmol/L底物濃度下使用10批后酶活殘留40%。同樣由于聚乙二醇具有廣泛的相容性，較高的穩(wěn)定性和不易變質(zhì)的特點，金利群等［3］在25 g/L海藻酸鈉溶液，100 g/L聚乙二醇溶液，60 g/L細(xì)胞懸浮液和25 g/L氯化鈣溶液條件下復(fù)合包埋腈水解酶全細(xì)胞。結(jié)果表明酶活回收率80%以上，在40 mmol/L底物濃度下合成蛋氨酸羥基類似物，連續(xù)操作100 h后酶活殘留80%，產(chǎn)物純度達(dá)到99.1%，總收率達(dá)到97%。此外由于殼聚糖具備較高的生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性、無毒的特點，許正宏等［4］利用聚乙烯醇-殼聚糖為復(fù)合材料固定化產(chǎn)腈水解酶的赤霉菌。在30 g/L聚乙烯醇溶液、60 g/L殼聚糖溶液固定化條件下酶活回收率高達(dá)100%。在100 mmol/L底物濃度下生產(chǎn)煙酸可連續(xù)操作25個批次。除此之外包埋結(jié)合交聯(lián)法也能進(jìn)一步提高固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性。薛亞平等［5］將此方法應(yīng)用于Alcaligenes faecalis ZJUTB10腈水解酶全細(xì)胞固定化中，在20 g/L海藻酸鈉溶液，10 g/L氯化鈣溶液，2 g/L PEI-HCl和1%（體積比）GA條件下制備固定化細(xì)胞。酶活回收率為45.8%，在20 mmol/L底物濃度下連續(xù)生產(chǎn)R-（-）-扁桃酸重復(fù)使用19批次后酶活殘留90%，在填充床中反應(yīng)16 h，時空產(chǎn)率達(dá)到8.87 mmol/（L·h），最終經(jīng)過80 h，R-（-）-扁桃酸積累量達(dá)到550 mmol/L，e.e.＞99%。

1.2瓊脂糖包埋

瓊脂是由海藻中提取的多糖體，具有凝固性、穩(wěn)定性，能與一些物質(zhì)形成絡(luò)合物等物理化學(xué)特性，可用作增稠劑、凝固劑、穩(wěn)定劑等。瓊脂主要由瓊脂糖和瓊脂果膠組成，其中瓊脂糖是線性多聚物，在水中一般加熱到90℃以上溶解，溫度下降到35～40℃時形成良好的半固體狀的凝膠，它具有良好的生物相容性，一般利用這些性質(zhì)作為細(xì)胞溶膠-凝膠的固定化載體。Nigam等［6］采用瓊脂糖包埋腈水解酶細(xì)胞Streptomgces sp. MTCC7546，瓊脂糖濃度為20 g/L，制成直徑為4 mm，含有干細(xì)胞重量為0.001 g的珠子，在100 mmol/L底物濃度下連續(xù)生產(chǎn)丙烯酸25批次后酶活殘留65%。

1.3聚乙烯醇包埋

聚乙烯醇（PVA）是聚醋酸乙烯酯的水解產(chǎn)物，它對水的溶解性與醇解度、聚合度和溫度有關(guān)。一般情況下醇解度越高，濃度越高，聚合度越大，溫度越低則PVA水溶液黏度越大。Bauer等［7］采用聚乙烯醇包埋腈水解酶細(xì)胞Rhodococcus sp. ATCC39484。當(dāng)細(xì)胞濃度為1 g/mL以及PVA濃度為200 g/L時，在飽和硼酸溶液中保存2 h，酶活回收率高達(dá)100%，在填充床上實現(xiàn)了100 mmol/L底物濃度下連續(xù)反應(yīng)100 min制備丙酸。

1.4卡拉膠包埋

卡拉膠是從海藻中提取出來的一種多糖，它的產(chǎn)品一般為灰白或淺黃褐色的粉末，無臭無味，具有特殊的凝固性。使用卡拉膠作為載體具有操作簡單、活性高、半衰期長、機(jī)械強(qiáng)度好等優(yōu)點。Cooling等［8］利用卡拉膠包埋Acidovorax facilis 72w腈水解酶細(xì)胞并結(jié)合聚乙烯亞胺和戊二醛交聯(lián)，在0.05 g/mL卡拉膠，1.1 g/mL細(xì)胞濃度，0.008 g/ mL GA（0.25 g/mL）和0.036 g/mL PEI（0.11%g/ mL）條件下制得固定化細(xì)胞，在150 mmol/L底物濃度下經(jīng)過67次循環(huán)，4-氰基戊酸銨鹽濃度達(dá)到1.3 mol/L，使用4批后酶活殘留80%。

1.5鄰苯二酚-殼聚糖包埋

Ni等［9］發(fā)明這種新型材料通過二羥基苯甲醛上的醛基與殼聚糖上的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)生成鄰苯二酚殼聚糖溶液，然后將鄰苯二酚溶液加入菌懸液使細(xì)胞聚集，隨著pH上升將腈水解酶全細(xì)胞E. coli M15/BCJ2315包埋，所得固定化細(xì)胞用于連續(xù)生產(chǎn)R-（-）-扁桃酸，在1 mg/mL鄰苯二酚殼聚糖溶液，0.005 g/mL細(xì)胞濃度以及pH 7.0固定化條件下酶活回收率達(dá)到76.3%，在100 mmol/L底物濃度下連續(xù)使用16個批次后酶活殘留80%，而且相對于游離細(xì)胞在35～55℃范圍內(nèi)明顯提高了其溫度穩(wěn)定性，在pH 6～10范圍內(nèi)明顯提高了其pH穩(wěn)定性。

1.6二氧化硅包埋

Swartz等［10］利用仿生硅化法設(shè)計了一種快速生成氧化硅納米顆粒包埋腈水解酶的工藝，利用四甲氧基硅烷作為氧化硅的前驅(qū)體，使用樹枝狀高聚大分子（PAMAM）介導(dǎo)的仿生硅化將腈水解酶包埋于氧化硅納米顆粒中。當(dāng)酶和氧化硅比例為0.86時，經(jīng)過仿生固定化的腈水解酶酶活回收率達(dá)到92.3%，氧化硅基質(zhì)不會產(chǎn)生底物擴(kuò)散限制，在5 mmol/L底物濃度下用于連續(xù)生產(chǎn)煙堿酸重復(fù)使用10次后活力維持在90%。

吸附法操作簡便易實現(xiàn)，固定化條件溫和，固定化載體廉價易得且可以重復(fù)利用，但是吸附法也有缺陷，酶與載體之間結(jié)合能力弱，酶易發(fā)生脫落，導(dǎo)致活力下降并污染反應(yīng)產(chǎn)物。

Vejvoda等［11］利用丁基瓊脂糖柱吸附菌株Aspergillus niger k10，流動相和洗脫液均為0.8 mol/L的硫酸銨溶液，吸附和洗脫流速分別為0.25 mL/min和0.5 mL/min。此條件下酶的負(fù)載量相對未吸附前提高了18倍，實現(xiàn)了高的轉(zhuǎn)化率。在

2　吸附固定化法

10 mmol/L底物濃度下合成煙堿酸，連續(xù)使用19批次后酶活殘留80%。

3　共價固定化法

酶的氨基、羧基、酚基、巰基、羥基、咪唑基等功能基團(tuán)可以參與共價結(jié)合，其中以氨基和羧基的結(jié)合法最為常見，通常該方法得到的固定化酶中酶與載體之間結(jié)合牢固，不易發(fā)生酶脫落現(xiàn)象，但是酶蛋白高級結(jié)構(gòu)易在比較劇烈的反應(yīng)條件下遭到破壞。周小華等［12］發(fā)明了一種制備固定化酶的方法，以D155樹脂為基體，通過二環(huán)己基碳二亞胺與賴氨酸縮合，制備出L-D155樹脂，再以L-D155樹脂為載體，通過戊二醛分別與載體和腈水解酶形成席夫堿制備固定化腈水解酶，當(dāng)樹脂：菌懸液體積：戊二醛體積為1 g：2.5 mL：0.7 mL時，酶活回收率達(dá)到60%，相對于游離酶其熱穩(wěn)定性明顯提高，且連續(xù)生產(chǎn)R-（-）-扁桃酸5個批次后酶活殘留85%。

4　交聯(lián)固定化法

交聯(lián)法制備的固定化細(xì)胞或酶穩(wěn)定性良好，可使用時間長，但是由于交聯(lián)反應(yīng)條件劇烈，酶分子的多個基團(tuán)被交聯(lián)，導(dǎo)致酶活損失比較大［34］。戊二醛是最常見的交聯(lián)劑，它是通過具有雙功能醛基的小分子物質(zhì)能夠與細(xì)胞或酶上的官能團(tuán)氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)將細(xì)胞或酶交聯(lián)，進(jìn)而達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞或酶結(jié)構(gòu)的目的。張志軍等［13］用戊二醛直接交聯(lián)腈水解酶全細(xì)胞E. coli，當(dāng)細(xì)胞濃度為8 g/ L，戊二醛濃度為70 mmol/L，交聯(lián)時間為20 min時，酶活回收率達(dá)到85%。在100 mmol/L底物濃度下生產(chǎn)R-（-）-扁桃酸，反應(yīng)15批后活力無明顯損失，在30、40、50℃條件下相對游離細(xì)胞半衰期分別提高4.5、5.3、5.1倍。Kaul等［14］用85%異丙醇沉淀酶，然后加入30 mmol/L戊二醛交聯(lián)酶聚體制備固定化酶，酶活回收率達(dá)到80%。在10 mmol/L底物濃度下重復(fù)使用5個批次，酶活殘留90%，相對酶在可溶性狀態(tài)下的交聯(lián)過程，將酶沉淀出來后再交聯(lián)其固定化酶活力在30、60℃條件下提高了5倍。

5　其他固定化方法

除了上述所述的固定化方法，還有膜截留固定化法，即酶可以被半透膜、中空纖維膜、超濾膜等截留而產(chǎn)物可以透過的固定化方式。這種固定化方法成本低廉、操作簡單、條件溫和、無內(nèi)擴(kuò)散影響，克服了傳統(tǒng)技術(shù)中存在的嚴(yán)重傳質(zhì)受限等問題，具有良好的生物相容性。金屬螯合載體定向固定化即利用金屬螯合配體表面的金屬離子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+等過渡金屬離子）與蛋白質(zhì)表面供電子氨基酸殘基（特別是組氨酸）以配位作用緊密結(jié)合，從而將酶固定到載體的表面。這種方法具有酶與載體之間結(jié)合牢固、結(jié)合位置單一的特點，對酶分子來說是理想的固定化結(jié)合位點。吳洋等［15］以瓊脂粉為基質(zhì)制備金屬螯合載體并用于固定重組腈水解酶。研究發(fā)現(xiàn)制備金屬螯合載體最合適的金屬離子為Zn2+，當(dāng)Zn2+濃度為0.3 mol/L，添酶量為15.6 mg/g，固定化pH為8.0，溫度為40℃時，制備的固定化酶活性最優(yōu)，在100 mmol/L底物濃度下生產(chǎn)R-（-）-扁桃酸使用8批后活力保持在45%。

6　展望

腈水解酶是一個非常具有工業(yè)化應(yīng)用價值的酶。生物催化劑的固定化有利于大規(guī)模生物催化過程的連續(xù)化、提高生物催化劑的操作穩(wěn)定性和使用效率，方便產(chǎn)物提取純化，降低生產(chǎn)成本。目前腈水解酶/細(xì)胞的固定化還面臨著載體基質(zhì)傳質(zhì)受限制，以及載體機(jī)械強(qiáng)度不高導(dǎo)致操作穩(wěn)定性較差等問題。這些因素限制了其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，在今后的研究中可以從腈水解酶固定化方法上加以改進(jìn)，如開發(fā)降低傳質(zhì)限制的無載體固定化技術(shù)，增加酶和載體專一性的定向共價固定化技術(shù)等。

參考文獻(xiàn)：

［1］ALMATAWAH Q A，COWAN D A. Thermostable nitrilase catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine［J］. Enzyme and microbial technology，1999，25（8）：718-724.

［2］LIU Zhiqiang，ZHOU Ming，ZHANG Xinhong，et al. Biosynthesis of iminodiacetic acid from iminodiacetonitrile by immobilized recombinant Escherichia coli harboring nitrilase［J］. Journal of molecular microbiology and biotechnology，2012，22（1）：35-47.

［3］JIN Liqun，LI Zongtong，LIU Zhiqing，et al. Efficient production of methionine from 2 -amino -4 -methylthiobutanenitrile by recombinant Escherichia coli harboring nitrilase［J］. Journal of industrial microbiology and biotechnology，2014，41（10）：1479-1486.

［4］許正宏，楊濤，李恒，等.一種固定赤霉菌生物轉(zhuǎn)化制備煙酸的包埋-交聯(lián)方法：103627745A［P］. 2014-03-12.

［5］XUE Yaping，XU Ming，CHEN Hongsheng，et al. A novel integrated bioprocess for efficient production of（R）-（-）-mandelic acid with immobilized Alcaligenes faecalis ZJUTB10 ［J］. Organic process research and development，2013，17（2）：213-220.

［6］NIGAM V K，KHANDELWAL A K，GOTHWAL R K，et al. Nitrilase -catalysed conversion of acrylonitrile by free and immobilized cells of Streptomyces sp.［J］. Journal of biosciences，2009，34（1）：21-26.

［7］BAUER A，LAYH N，SYLDATK C，et al. Polyvinyl alcoholimmobilized whole-cell preparations for the biotransformation of nitriles［J］. Biotechnology letters，1996，18（3）：343-348.

［8］COOLING F，F(xiàn)AGER S，F(xiàn)ALLON R，et al. Chemoenzymatic production of 1，5 -dimethyl-2-piperidone［J］. Journal of molecular catalysis B：enzymatic，2001，11（4）：295-306.

［9］NI K，WANG H，ZHAO L，et al. Efficient production of（R）-（-）-mandelic acid in biphasic system by immobilized recombinant E. coli［J］. Journal of biotechnology，2013，167（4）：433-440.

［10］SWARTZ J D，MILLER S A，WRIGHT D. Rapid production of nitrilase containing silica nanoparticles offers an effective and reusable biocatalyst for synthetic nitrile hydrolysis［J］. Organic process research and development，2009，13（3）：584-589.

［11］VEJVODA V，KAPLAN O，BEZOU?KA K，et al. Mild hydrolysis of nitriles by the immobilized nitrilase from Aspergillus niger K10［J］. Journal of molecular catalysis B：enzymatic，2006，39 （1）：55-58.

［12］周小華，張杰，康宏寬，等.一種制備固定化腈水解酶的方法：102517274A［P］. 2012-06-27.

［13］ZHANG Zhijun，PAN Jiang，LI Chunxiu，et al. Efficient production of（R）-（-）-mandelic acid using glutaraldehyde cross-linked Escherichia coli cells expressing Alcaligenes sp. nitrilase［J］. Bioprocess and biosystems engineering，2014，37 （7）：1241-1248.

［14］KAUL P，STOLZ A，BANERJEE U E C. Cross-linked amorphous nitrilase aggregates for enantioselective nitrile hydrolysis［J］. Advanced synthesis and catalysis，2007，349（13）：2167-2176.

［15］吳洋，薛亞平，鄭裕國.金屬螯合載體固定重組腈水解酶［J］.生物加工過程，2012，10（4）：47-53.

（責(zé)任編輯：朱小惠）

Research progress in the immobilization of nitrilase

HUANG Jiwei1，2，ZOU Shuping1，2，ZHENG Yuguo1，2

（1. Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；

2. Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Abstract：Nitrilase is widely used in industrial biocatalytic synthesis of pharmaceuticals and their intermediates，agrochemicals，food additives，and other fine chemicals. Its immobilization not only solves the problems of long-time storage and reuse，but also be conducive to products separation and continuous production. In this paper，the commonly used immobilization methods of nitrilase are introduced，including embedding，adsorption，covalent binding and cross-linking. Moreover，some newly developed immobilization methods in recent years such as membrane intercept immobilization，orientation-controlled immobilization are also described. These methods play an important role in improving the stability and reusability of nitrilase.

Keywords：nitrilase；immobilization；research progress

作者簡介：黃季維（1988—），男，四川自貢人，碩士，研究方向為生物催化與轉(zhuǎn)化，E-mail：hjw_5566@sina.com.通信作者：鄭裕國教授，E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn.

基金項目：國家自然科學(xué)基金（21176224）

收稿日期：2015-04-29

中圖分類號：Q814.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-2214（2016）02-0114-04