金線蓮組培快繁條件的優(yōu)化

肖小君，王曼丁，曾楨迦，唐正義＊

（1．內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川內(nèi)江641100；2．成都市樹德中學(xué)（光華校區(qū)），四川成都610031）

金線蓮組培快繁條件的優(yōu)化

肖小君1，王曼丁2，曾楨迦1，唐正義1＊

（1．內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川內(nèi)江641100；2．成都市樹德中學(xué)（光華校區(qū)），四川成都610031）

為優(yōu)化金線蓮快繁技術(shù)體系以批量生產(chǎn)金線蓮，以其無菌苗為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物激素（6－BA，NAA，IBA）、蔗糖及活性炭等研究金線蓮不定芽增殖、生根的影響，并進(jìn)行移栽試驗(yàn)。結(jié)果表明：金線蓮不定芽增殖培養(yǎng)以MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L的效果較佳，生根培養(yǎng)以1／2MS＋I(xiàn)BA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L的效果較好，較適移栽基質(zhì)為珍珠巖∶泥炭土∶松樹皮＝1∶1∶1，成活率達(dá)98%。

金線蓮；組織培養(yǎng)；快速繁殖

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，多生長在海拔500～1 600m的陰濕森林或竹林內(nèi)［1］。其株型小，葉形優(yōu)美，葉脈金黃色呈網(wǎng)狀，除具有很高的觀賞價(jià)值外，還有藥王、金草、神藥、烏人參等美稱，可全草入藥，是名貴珍稀的中草藥［2］，具有廣闊的開發(fā)利用前景。

金線蓮的種子發(fā)育不全，由于其對生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，在野生自然條件下萌發(fā)率和繁殖率都極低［3］，加之近年來，野生資源不斷遭到破壞性采挖，以致處于瀕臨滅絕之地［4］。隨著藥效學(xué)和臨床應(yīng)用對金線蓮研究的深入，對金線蓮藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高，導(dǎo)致金線蓮的市場需求壓力增大。目前，雖然金線蓮的組培快繁技術(shù)在各個(gè)環(huán)節(jié)的研究已有報(bào)道［5－8］，但不同基因型植物其繁殖體系還不穩(wěn)定，工廠化、規(guī)?；纳a(chǎn)技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。因此，筆者結(jié)合當(dāng)?shù)毓井a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)需要，以無菌苗為試材，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)著重研究植物生長調(diào)節(jié)劑及蔗糖濃度對不定芽增殖與生根的影響，優(yōu)化金線蓮組織培養(yǎng)快繁條件，旨在為金線蓮組培苗的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1．1材料

選用長勢一致的金線蓮無菌植株作為試驗(yàn)材料，由內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組培室提供。

1．2不定芽增殖培養(yǎng)的激素濃度篩選

以MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用3因素3水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案L9（33）（表1），選取生長健壯，大小一致的金線蓮不定芽接入9種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基均加入瓊脂粉5．5g／L，pH 5．8左右，其中每個(gè)配方接種6瓶，每瓶接種6株不定芽。培養(yǎng)條件：溫度白天（23±2）℃、夜間（20±2）℃，光照時(shí)間14 h／d，光照強(qiáng)度2 000lx，室內(nèi)通氣條件良好。每周觀察不定芽的增殖情況，40d后觀察并統(tǒng)計(jì)增殖后總芽數(shù)、增殖倍數(shù)及不定芽生長情況。

表1 金線蓮不定芽增殖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（33）Table 1 Orthogonal test L9（33）of A．roxburghii adventitious buds proliferation

1．3生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

一般低濃度的無機(jī)營養(yǎng)成分有利于組培苗的根誘導(dǎo)［7］。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置6種生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選。以1／2MS為基本培養(yǎng)基，選取長2～3cm，有2～3片葉的叢生芽，切割成單芽，接種到添加不同濃度IBA和NAA生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表2），每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種6株單芽，40d后統(tǒng)計(jì)生根情況。接種方法和培養(yǎng)條件與1．2相同。

表2 金線蓮不定芽生根培養(yǎng)的配方設(shè)計(jì)Table 2 Component design of A．roxburghii adventitious buds rooting

1．4煉苗移栽

金線蓮移栽基質(zhì)要求疏松、透氣、排水性能良好。選擇以下3種基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)：1）珍珠巖∶泥炭土∶松樹皮＝1∶1∶1；2）珍珠巖∶泥炭土＝1∶1；3）泥炭土∶松樹皮＝1∶1。具體操作為待生根后的組培苗生長到3～5cm，有2～5片葉時(shí)，將培養(yǎng)瓶移到室外打開瓶蓋練苗3～5d，然后洗去小苗基部的殘留培養(yǎng)基，移入預(yù)先消毒過的珍珠巖、泥炭土、松樹皮的3種基質(zhì)中，每天葉片噴霧1次，保持環(huán)境相對濕度在80%～90%，并加強(qiáng)栽培管理，經(jīng)過4周的生長培養(yǎng)后，觀察其生長情況。

2結(jié)果與分析

2．1不同濃度激素配比金線蓮的不定芽增殖

接種1周后，1號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)培養(yǎng)基開始出現(xiàn)萌動(dòng)的現(xiàn)象，莖節(jié)開始膨大，腋芽發(fā)白，生長狀況良好；3號(hào)、8號(hào)、9號(hào)培養(yǎng)基萌動(dòng)現(xiàn)象不明顯。接種15～20d后，4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、9號(hào)培養(yǎng)基增殖效果明顯，植株周圍產(chǎn)生少量肉眼可見的突起，腋芽開始分化可觀察到乳白色的不定芽，少數(shù)莖段表面形成白色絨毛；30d后，可見明顯的叢生芽，芽體嫩綠；35d后，叢生芽繼續(xù)生長，但不繼續(xù)產(chǎn)生新的不定芽。

由表3可知：不同激素濃度配比對金線蓮叢生芽增殖的影響差異顯著。在選擇的3個(gè)因子中，隨6－BA濃度的上升，增殖后不定芽總數(shù)逐漸增加，且3個(gè)水平差異顯著；隨NAA濃度的上升，不定芽總數(shù)呈先下降后上升的趨勢；隨蔗糖濃度的上升，不定芽總數(shù)反而呈下降趨勢，且3個(gè)水平差異較大。

不同試驗(yàn)因子對不定芽繼代培養(yǎng)增殖倍數(shù)影響的極差R（表4）順序：NAA＞6－BA＞蔗糖。適量濃度的NAA有利于不定芽萌發(fā)增殖，并有利于芽體萌發(fā)后的生長健壯，以0．5mg／L最佳。從試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，配方6（MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L）對金線蓮不定芽增殖效果較佳，此時(shí)芽增殖倍數(shù)最高，達(dá)7．08，且表現(xiàn)為葉緣光滑，葉表面為黑紫色，金色葉脈明顯，苗高莖粗，長勢較好。

表3 不同激素配比處理金線蓮的不定芽增殖情況Table 3 Proliferation of A．roxburghii adventitious buds in different hormone proportion

表4 不同激素配比處理金線蓮不定芽增殖的極差Table 4 Range of A．roxburghii adventitious buds in different hormone proportion

2．2不同濃度激素金線蓮試管苗的生根

金線蓮根的生長比較緩慢，培養(yǎng)12～20d開始萌發(fā)生長。由表5可知，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)培養(yǎng)基的生根效果不理想，生根率低，根的質(zhì)量比較細(xì)弱，平均根長較短。通過分析可知，單一的生長素對根的誘導(dǎo)培養(yǎng)效果不顯著。從生根率、平均生根數(shù)、平均根長方面綜合考慮，5號(hào)培養(yǎng)基（1／2MS＋I(xiàn)BA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L）處理的生根效果最好，生根率達(dá)96%，平均生根數(shù)為2．89條。說明，NAA與IBA的配合使用有利于金線蓮不定芽生根。

表5 不同濃度激素處理金線蓮不定芽的生根Table 5 Rooting of A．roxburghii adventitious buds in different concentrations hormone

2．3煉苗移栽

從表6可知，在珍珠巖∶泥炭土∶松樹皮＝1∶1∶1混配的基質(zhì)中移栽成活率最高，達(dá)98%，生長狀況最好，植株質(zhì)量粗壯，葉正常舒展。珍珠巖密質(zhì)適中，疏松透氣，不易板結(jié)，排水能力良好，樹皮經(jīng)發(fā)酵處理，不易長菌，且保水保肥，可能是其移栽成活率高、長勢好的原因。而在其他2種基質(zhì)中金線蓮移栽的成活率則較低，2號(hào)基質(zhì)的成活率為76%，3號(hào)基質(zhì)的成活率為88%，植株生長較緩慢，植株瘦小，葉微卷曲。

表6 不同基質(zhì)金線蓮組培苗移栽的成活率Table 6 Transplanting survival rate of A．roxburghii seedlings in different matrix

3結(jié)論與討論

影響金線蓮試管苗生長發(fā)育的因素比較多。如基本培養(yǎng)基、激素成分及含量、pH、光照、溫度等。其中，激素的種類、含量及比例是最關(guān)鍵的因素。如MS＋6－BA 3．5mg／L＋KT 1．5mg／L＋NAA 0．6 mg／L組合是芽快速增殖的最佳配方，3種激素對芽繼代增殖系數(shù)影響大小為6－BA＞NAA＞KT［8－11］。何碧珠［9］通過試驗(yàn)得出：1／2MS＋BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋KT 1．0mg／L＋香蕉汁100g／L＋AC 0．2%配方為金線蓮芽增殖的最適激素組合。分析認(rèn)為，香蕉汁中含有大量的糖類和植物激素，如生長素、細(xì)胞分裂素、乙烯和赤霉素，可為植物組織細(xì)胞分裂分化提供能量。研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案優(yōu)化的最佳增殖配方為MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋蔗糖40g／L，試管苗長勢健壯，葉片伸展。

IBA和NAA在一定的濃度配比下能促進(jìn)植物的快速生長，促使莖的伸長，促進(jìn)植物生根和有效減緩根的老化［12］。適宜濃度的NAA與IBA的激素配比對金線蓮根的誘導(dǎo)效果較好。陳兆貴［10］認(rèn)為，在生根培養(yǎng)過程中加入一定量的活性炭和水解酪蛋白有利于提高生根率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，1／2MS＋I(xiàn)BA 0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋活性炭0．2g／L效果最理想，生根率最高，根的質(zhì)量最好。

25%粗松樹皮＋75%進(jìn)口泥炭土為臺(tái)灣金線蓮生長的最優(yōu)栽培基質(zhì)［13］。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上加入珍珠巖，且三者之間的比例為1∶1∶1時(shí)可使成活率達(dá)98%，且幼苗長勢旺盛。分析認(rèn)為，珍珠巖有疏松透氣、不易使土壤板結(jié)的功效，有利于金線蓮幼苗根的透氣生長。同時(shí)本研究表明，在移栽過程中要注意基質(zhì)和幼苗本身的消毒，金線蓮移栽前期階段，影響其成活率的重要因素是保證充足的水分。移栽的試管苗根較少，葉片較多時(shí)容易發(fā)生萎焉，分析可能與其蒸騰作用有關(guān)［14］。

［1］魏翠華，謝 宇，陳 沁，等．臺(tái)灣金線蓮增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［J］．亞熱帶植物科學(xué)，2012，41（4）：57－59．

［2］黃小鳳，周志東，楊 成，等．珍稀藥用植物金線蓮及其栽培技術(shù)［J］．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（5）：80－81．

［3］羅安雄，孟志霞，陳曉梅，等．福建金線蓮種子萌發(fā)及幼苗培養(yǎng)研究［J］．中國藥學(xué)雜志，2012（15）：11－13．

［4］高 燕，白燕冰，趙云翔．金線蓮組織培養(yǎng)幾種培養(yǎng)基的篩選［J］．熱帶農(nóng)業(yè)科技，2004，27（3）：12－14．

［5］魏翠華，秦建彬，謝 宇，等．應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選臺(tái)灣金線蓮快繁培養(yǎng)基［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（4）：114－117．

［6］李艷冬，葉紅霞，陳麗萍．金線連組培快繁技術(shù)體系的研究［J］．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（4）：52－54．

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［8］王雅英，林榮耀，楊忠耿，等．金線蓮快速繁殖及促根壯苗試驗(yàn)［J］．亞熱帶植物科學(xué)，2005，34（3）：40－42．

［9］何碧珠，何官榕，黃銘星，等．福建野生金線蓮快速繁育技術(shù)［J］．農(nóng)業(yè)工程，2013，3（2）：72－76．

［10］陳兆貴．金線蓮組織培養(yǎng)和移栽技術(shù)研究［J］．惠州學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，27（6）：14－17．

［11］周玉美，陳 麗，崔永一，等．臺(tái)灣金線蓮（Anoectochilus formosanus）快繁體系的構(gòu)建［J］．東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37（12）：43－47．

［12］岑秀芬，韋鵬霄，劉 芳．植物生長調(diào)節(jié)劑對臺(tái)灣金線蓮試管苗增殖和生根的影響［J］．廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（2）：19－21．

［13］謝 靜，譚嘉娜，楊俊賢，等．不同栽培基質(zhì)對金線蓮生長和生物產(chǎn)量的影響［J］．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014 （20）：33－36．

［14］馬以忠，鄧琳瓊，黃麗華．金線蓮的研究現(xiàn)狀及展望［J］．貴州科學(xué)，2006，25（2）：81－84．

（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Optimization of Tissue Culture and Rapid Propagation of Anoectochilus roxburghii

XIAO Xiaojun1，WANG Manding2，ZENG Zhenjia1，TANG Zhengyi1＊
（1．School of Life Science，Neijiang Normal University，Neijiang，Sichuan641100；2．Guanghua Campus of Chengdu Shude High School，Chengdu，Sichuan610031，China）

To optimize the technical architecture of rapid propagation of A．roxburghii，the effects on proliferation and rooting of adventitious buds were studied by adding different concentrations of plant hormones（6－BA，NAA，IBA），sucrose and charcoal，while using the aseptic seedlings as explants and MS as the basic medium，then the experiment of transplanting was conducted．The results showed that the optimum culture medium for adventitious buds proliferation was MS＋6－BA 3．0mg／L＋NAA 0．5mg／L＋sucrose 40g／L，while 1／2MS＋I(xiàn)BA0．5mg／L＋NAA 0．3mg／L＋AC 0．2g／L was better for rooting．The optimum transplanting matrix was perlite∶peat∶bark＝1∶1∶1，and the survival rate was 98%．

Anoectochilus roxburghii；tissue culture；rapid propagation

S688．2

A

1001－3601（2016）02－0053－0012－03

2015－09－09；2016－01－07修回

四川省教育廳科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)“川西珍稀植物資源保護(hù)與利用”（14TD0025）

肖小君（1982－），女，碩士，助理研究員，從事經(jīng)濟(jì)植物組織培養(yǎng)研究工作。E－mail：qianqianxxj＠126．com

＊通訊作者：唐正義（1957－），男，教授，從事遺傳毒理的研究。E－mail：tangzy9513＠163．com