昆明動物園圈養(yǎng)長臂猿糞便可培養(yǎng)細菌分析

李 蓮 馬國強 劉 麗 劉安榮 師 婧 周杰瓏 王秀艷

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明650224；2.國家林業(yè)局昆明勘察設計院，云南昆明650216；3.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明650224；4.昆明動物園，云南昆明650224）

昆明動物園圈養(yǎng)長臂猿糞便可培養(yǎng)細菌分析

李 蓮1馬國強2劉 麗3劉安榮4師 婧4周杰瓏1王秀艷1

（1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明650224；2.國家林業(yè)局昆明勘察設計院，云南昆明650216；3.西南林業(yè)大學林學院，云南昆明650224；4.昆明動物園，云南昆明650224）

以昆明動物園7只圈養(yǎng)長臂猿為研究對象，通過傳統(tǒng)微生物檢測和分子生物學方法相結(jié)合，對其新鮮糞便可培養(yǎng)細菌進行分離、鑒定與分析。結(jié)果表明：分離得到的15株細菌中，有9株細菌可鑒定到種，分別屬于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、海氏腸球菌、耐鹽短桿菌和弗氏志賀菌4個種；有6株細菌可以鑒定到屬，分別屬于奈瑟菌屬和大腸桿菌2個屬；其中優(yōu)勢菌為耐鹽短桿菌和大腸桿菌。

長臂猿；糞便；細菌；優(yōu)勢菌；動物園

長臂猿作為我國國家一級保護動物，與黑猩猩（Pan trog lodytes）、猩猩（Pongo pygmaeus）和大猩猩（Gorilla beringei）同屬類人猿。雖然我國政府在20世紀80年代初設立多個保護區(qū)對長臂猿進行保護，但保護現(xiàn)狀不容樂觀。目前我國的長臂猿保護工作迫在眉睫。白掌長臂猿（Hylobates lar）可能已經(jīng)從中國消失；東黑冠長臂猿（Nomascus nasuts）和海南長臂猿（Nomascus hainanus）的數(shù)量均不足30只，已接近滅絕邊緣；東白眉長臂猿（Hoolock leuconedys）數(shù)量不足200只；即使是數(shù)量最多的西黑冠長臂猿（Nomascus concolor），也僅有1 000多只［1］。在遷地保護中，患病死亡是長臂猿數(shù)量減少一個不可忽視的因素，人工圈養(yǎng)常出現(xiàn)長臂猿幼子腹瀉致死的情況，且這種情況一旦發(fā)生，無法治愈。究其原因，可能是關于長臂猿的腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成還有待了解，當遇到腸道菌群紊亂導致腹瀉時，一味地采用家養(yǎng)動物的治療方式和藥物，達不到“對癥下藥”，自然就無療效可言。在對動物腸道菌群研究中，常規(guī)方法容易忽略了不可培養(yǎng)微生物，分析時往往低估了腸道菌群的多樣性，很難全面反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征［2-3］。

近年來，基于16S rRNA建立的一系列分子生物學分析方法，對多種動物腸道微生物的分析研究已有報道，但關于傳統(tǒng)方法與分子生物學結(jié)合對長臂猿腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化方面的研究較少。為此，本研究通過對昆動物園7只長臂猿鮮糞便進行可培養(yǎng)細菌鑒定與分析，初步分清種類和數(shù)量，確定優(yōu)勢菌。研究結(jié)果可為今后其健康狀況監(jiān)測，以及腸道微生態(tài)制劑等深入研究提供參考，為指導長臂猿等野生動物正確防治腹瀉類腸道疾病方面提供借鑒，提高遷地保護成效。

1 材料與方法

1.1 試驗動物來源

長臂猿7只，由昆明動物園飼養(yǎng)，具體情況見表1。

表1 昆明動物園長臂猿情況Tab.1 Gibbons cases in Kunming zoo

1.2 試驗試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基，均參照文獻［4］準備；革蘭氏染色液、MR試劑、VP試劑等均按常規(guī)方法配制；基因組DNA快速提取試劑盒，蛋白酶K，瓊脂糖等購自北京百泰克生物有限公司；Tris-base，EDTA，冰乙酸，無水乙醇等常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣 糞便采集時間為春夏秋3個季節(jié)的早、中、晚，每個季節(jié)采樣2次。每次采集時均用滅過菌的竹簽或是筷子取新鮮糞便20 g立刻裝入無菌采樣袋中，放入裝有冰袋的采樣盒保存，于30 min內(nèi)運回實驗室進行樣品的稀釋、培養(yǎng)等處理。

1.3.2 稀釋與培養(yǎng) 將采集的樣品稱5 g放入裝有45mL稀釋液的錐形瓶中，并放入搖床上30min，37℃，稀釋度為10-1。從錐形瓶中吸取樣品100μL注入盛有900μL無菌水的離心管中，吹打均勻。重復以上步驟，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等各種稀釋度。

分別吸取15μL 10-4、10-5、10-6稀釋后的菌液放入配置好的LB培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基上，并用涂布棒涂布均勻；分別吸取15μL 10-3、10-4、10-5稀釋后的菌液放入配置好的EC培養(yǎng)基上，并用涂布棒涂布均勻。每種培養(yǎng)基上接種3個培養(yǎng)皿，并設1個空白對照。所有操作均在超凈工作臺上進行，涂布完成后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 計數(shù) 取菌落數(shù)在30～300個的平板進行計數(shù)，若只有1個稀釋度的菌落數(shù)符合此范圍，即以該菌落數(shù)記錄；若有2個稀釋度的菌落數(shù)符合，則由兩者菌落數(shù)的比值來決定，比值≤2應記錄其平均數(shù)，若＞2則記錄其中菌落數(shù)較少的值；若3個稀釋度的菌落數(shù)均為30～300個，則樣品應重新進行稀釋培養(yǎng)，直至只有1個或2個稀釋度菌落數(shù)在此范圍內(nèi)；若所有稀釋度的菌落數(shù)均＞300個，則按稀釋度最高的菌落數(shù)記錄；若所有稀釋度的菌落數(shù)均＜30個，則按稀釋度最低的菌落數(shù)記錄；若所有稀釋度的菌落數(shù)均不在30～300個之間，其中1個稀釋度＞300個，而相鄰的另一稀釋度＜30個，則以接近30個或300個的菌落數(shù)記錄。

1.3.4 細菌分離與鑒定

1）細菌分離。根據(jù)細菌計數(shù)試驗平板中菌落的生長表現(xiàn)，即菌落的大小、形狀、顏色、邊緣、表面隆起、光滑度、透明度等性狀，將相同的菌落歸為一類，并統(tǒng)計出該菌落在所有樣品中出現(xiàn)的次數(shù)，由此確定優(yōu)勢菌。并從平板中挑取各典型生長的菌落進行純培養(yǎng)。

2）細菌染色鑒定。對分離的細菌純培養(yǎng)物首先進行革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌的形狀、大小等革蘭氏染色特征，再用芽胞染色法，鞭毛染色法觀察細菌的芽胞、鞭毛，對分離細菌作出初步鑒定和分類。

3）細菌生化鑒定。根據(jù)上述初步鑒定結(jié)果，針對不同的菌株選擇相應的生化試驗項目進行生化反應試驗，最后查閱《伯杰氏細菌鑒定手冊》將細菌鑒定到屬、種［5］。

1.3.5 16S rDNA序列分析 對生理生化鑒定的可疑菌株進行16S rDNA序列分析［6］，即進行PCR擴增目的片段，產(chǎn)物送上海杰李生物技術有限公司測序，然后在EzBioCloud中的微生物核酸基因庫中進行比對，確定細菌菌株種屬關系。細菌16S rDNA通用引物為：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（引物送上海生工合成）。

1）細菌16S rDNA提取。取0.5～2.0 m L培養(yǎng)菌液，按北京百泰克公司的基因組DNA快速提取試劑盒操作說明書提取細菌基因DNA.

2）PCR擴增。在超微量核酸蛋白測定儀（Namedrop ND-2000）測定DNA濃度后，選取適合的樣品作為模板，用細菌16S rDNA通用引物，進行PCR擴增。PCR反應體系為50μL，其中2×Master Mix 25μL，上下游引物各1.5μL，模板3μL，加水補足至50μL。PCR反應條件為：94℃預變性2 min；94℃45 s，57℃45 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，30 min后于凝膠成像系統(tǒng)觀測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

從長臂猿糞便中分離出的細菌在不同培養(yǎng)基中形成的菌落外觀形態(tài)差異不大，均是菌落邊緣整齊，濕潤光滑，僅顏色有細微差別。如在NA培養(yǎng)基中形成的菌落顏色呈白色，在LB培養(yǎng)基上形成的菌落透明稍帶些許黃色，而在EC培養(yǎng)基中形成的菌落顏色則呈乳白色。

各培養(yǎng)基對照組上均無菌落生長，從而排除了在試驗操作和培養(yǎng)過程中被污染的可能性。從以上不同培養(yǎng)基上挑取各典型生長的菌落，在相應的培養(yǎng)基上進行反復劃線分離，直到獲得純菌株，最終得到15株。

2.2 顯微鑒定

對15株分離細菌的純培養(yǎng)物進行顯微鑒定，包括革蘭氏染色、芽孢染色及莢膜染色，染色結(jié)果見表2。

從表2可以看出，長臂猿糞便中分離得到的細菌以桿菌為主，排列形式有單個排列，成對排列，還有成對排列呈弧狀的菌株，分離得到的菌株僅有CBY-2為球菌，分離菌株的顯微結(jié)構(gòu)見圖1。

另外，得到的15株細菌中，除CBY-1及CBY-5有芽孢，其余菌株的染色結(jié)果均沒有發(fā)現(xiàn)芽孢。所有菌株均沒有發(fā)現(xiàn)存在莢膜。

表2 分離菌株染色鑒定Tab.2 Identification of isolated strain

2.3 生化鑒定

選取有代表性的15株分離菌的純培養(yǎng)物進行各項生化試驗，鑒定結(jié)果見表3。

表3 各分離菌株生化鑒定結(jié)果Tab.3 Biochemical identification results of different isolates

由表3可知：菌株CBY-4，CBY-5利用糖的特性以及甲基紅試驗，吲哚試驗結(jié)果等特征相似，可初步確認為屬同一菌屬。另外CBY-6、CBY-7、CBY-8、CBY-9及CBY-10利用糖的特性和各生化特征也基本一致，也可將其初步歸為同一類菌。其他8株菌株的生化特征存在差異，可能分屬為不同的菌種。

2.4 分子鑒定與分析

2.4.1 細菌16S rDNA的PCR擴增 利用細菌通用引物27（F）和1492（R）進行糞便細菌16S rDNA PCR擴增，CBY1～CBY13結(jié)果均得到預期的1 500 bp單一擴增條帶，結(jié)果見圖2。

2.4.2 細菌16S rDNA序列分析 擴增產(chǎn)物測序后，通過DNAMAN拼接，然后提交到EzTaxon（http：//www.ezbiocloud.net/）進行16S rDNA在線比對，結(jié)果見表4。

一般認為，相似度大于99%的細菌判定為同種細菌，相似度為95%～99%則判定為同屬，相似度在91%～95%判定為同科［7］。

表4 細菌16S rDNA比對結(jié)果Tab.4 Results of rDNA 16S

從表4可以看出，15株細菌，有9株細菌可鑒定到種，分別屬于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）、耐鹽短桿菌（Brevibacterium halotolerans）和弗氏志賀菌（Shigella flexneri）4個種；另外6株細菌則可分別屬于奈瑟菌屬（Neisseria）和埃希氏菌屬（Escherichia）2個屬。

2.5 優(yōu)勢菌分析

通過菌落計數(shù)，確定優(yōu)勢菌群，結(jié)果見表5。

從表5可以看出：長臂猿糞便分離出的菌株數(shù)量由高到低依次為耐鹽短桿菌、埃希氏菌屬菌、奈瑟菌屬菌、弗氏志賀菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，最后為海氏腸球菌，其中優(yōu)勢菌群為耐鹽短桿菌和大腸桿菌，分別占可培養(yǎng)細菌的50.52%和40.07%。

表5 長臂猿糞便可培養(yǎng)細菌分離比例Tab.5 The segregation ratio of gibbons fecal bacteria

3 結(jié)論與討論

關于長臂猿腸道細菌的研究前人工作較少，國外只有少數(shù)幾篇相關報道，如L.D.Banish等對靈長類動物腸道病原體中的痢疾菌-志賀氏菌進行了報道研究，發(fā)現(xiàn)試驗中的長臂猿均有所感染［8］；Depaliand等對長臂猿死因研究中發(fā)現(xiàn)類圓線蟲病能引起其腹瀉［9］。國內(nèi)李婉平等對廣州動物園一例水樣瀉致死的白眉長臂猿進行剖檢發(fā)現(xiàn)其存在溶組織阿米巴感染［10］。施新泉等發(fā)現(xiàn)有長臂猿感染司氏伯特絳蟲?。?1］。劉燕等從一白頰長臂猿體內(nèi)分離得到1株肺炎克雷伯氏菌［12-13］。李達等研究發(fā)現(xiàn)貴州一野生動物園長臂猿存在有流感病毒，支原體及巴氏桿菌的混合感染［14］。楊云飛等從一慢性腹瀉的白眉長臂猿糞便中分離得到1株肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種和1株致病性大腸桿菌［15］，且證實了長臂猿腹瀉正是由于這2種菌混合感染引起的。

本試驗依據(jù)可培養(yǎng)細菌菌落特征、染色特性和顯微形態(tài)觀察，以及結(jié)合16S rDNA序列分析等方法［16］，從核酸的角度揭示了長臂猿腸道細菌的多樣性。對昆明動物園7只健康長臂猿糞便可培養(yǎng)細菌的研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌數(shù)量多于革蘭氏陰性菌，共計分離出耐鹽短桿菌、大腸桿菌、奈瑟菌、弗氏志賀菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、海氏腸球菌共6種。與楊云飛等分離得到肺炎克雷伯氏菌和致病性大腸桿菌有一定差異。也許是因為楊云飛等是從正在腹瀉的長臂猿糞便中分離得到的，與本試驗采集的沒有病癥的長臂猿糞便有一定差異。從本試驗結(jié)果來看，一些腸道菌群常見菌未能檢出，可能與該試驗所選用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法有關，但在一定程度上，該結(jié)果仍可作為長臂猿腸道菌群數(shù)值的參考。

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（責任編輯 張 坤）

Research and Analysis of Cultivate Bacteria in Captive Gibbons Faeces in the Kunming Zoo

Li Lian1，Ma Guoqiang2，Liu Li3，Liu Anrong4，Shi Jin4，Zhou Jielong1，Wang Xiuyan1
（1.College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.Chian Forest Exploration&Design Institute on Kunming，Kunming Yunnan 650216，China；3.College of Forestry，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；4.Kunming Zoo，Kunming Yunnan 650224，China）

It took seven captive Gibbons of Kuming Zoo as the research object，adopted a combination of traditionalmicrobiological and molecular biologicalmethods，isolated，identified and analyzed the cultivate bacteria of fresh feces.The results showed that nine strains could identify to spicies among the 15 isolated strains of bacteria，which were belonged to Bacillusmethylotrophicus，Enterococcushirae，Brevibacterium halotolerans and Shigella flexneri 4 species，respectively.The other six strains could identify to genus，which were belonged to the genus Neisseria and Escherichia coli2 genus，respectively.Which the brevibacterium halotolerans and Escherichia coli were the dominantbacteria.

gibbons；faeces；bacteria；dominant bacteria；zoo

S718.6

A

2095-1914（2016）02-0121-06

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.02.020

2015-10-12

云南省生物學優(yōu)勢特色重點學科建設項目（50097505）資助；林下生物資源保護與利用科技創(chuàng)新團隊建設項目（51400605）資助。

第1作者：李蓮（1990—），女，碩士生。研究方向：動物疫原疫病。Email：15008189120@163.com。

周杰瓏（1976—），男，副教授，碩士生導師。研究方向：動物繁殖與疾病研究。Email：zhjiel@163.com。