瘢痕疙瘩中成纖維細胞耐藥基因mdr1的研究

陳亞紅　曲淼　王文波　劉偉　武曉莉

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瘢痕疙瘩中成纖維細胞耐藥基因mdr1的研究

陳亞紅曲淼王文波劉偉武曉莉

【摘要】目的研究瘢痕疙瘩成纖維細胞（KF）與正常皮膚組織成纖維細胞（NF）耐藥基因mdr1的表達差異。方法利用RT-PCR、免疫組化及流式細胞分析等方法，檢測瘢痕疙瘩與正常皮膚組織中成纖維細胞耐藥基因mdr1及其蛋白ABCB1的表達；并對30例不同部位瘢痕疙瘩的ABCB1蛋白表達量進行流式細胞分析。結果瘢痕疙瘩成纖維細胞中耐藥基因mdr1及其蛋白ABCB1的表達明顯高于正常皮膚；流式細胞分析顯示，瘢痕疙瘩原代成纖維細胞中ABCB1表達率：胸部＞背部、腹部，差異有統(tǒng)計學意義。結論瘢痕疙瘩成纖維細胞表達耐藥基因mdr1及其蛋白ABCB1，且較正常皮膚中的表達量增高。

【關鍵詞】瘢痕疙瘩成纖維細胞多藥耐藥基因

瘢痕疙瘩（Keloid）具有超過原始損傷邊界，向周圍正常組織浸潤[1]，呈“蟹足”樣生長的特性，一般無自愈傾向，且極少自發(fā)消退。單純的藥物注射、手術切除、激光或放療等治療后均易復發(fā)，生長超過原瘢痕范圍[2]，具有類似腫瘤生長的特點，因此存在瘢痕疙瘩腫瘤源性學說[3-5]；然而，經抗腫瘤藥物治療后瘢痕疙瘩仍具有一定的復發(fā)率[6]，并呈現出瘢痕疙瘩局部組織對治療藥物不敏感的現象，表明瘢痕疙瘩和腫瘤的生長具有某些相似性，提示了瘢痕疙瘩可能有著與腫瘤類似的“細胞耐藥”機制存在。

關于腫瘤細胞的耐藥機制，最新的學說認為是由于腫瘤干細胞（Tumor stem cell，TSC）表達耐藥基因所致[7-8]。TSC指腫瘤中存在的少量具有自我更新能力、分化潛能，并能產生異質性腫瘤細胞的細胞。TSC理論認為，腫瘤可能是由TSC產生，而TSC則可能由正常組織干細胞突變形成[9]。更重要的是TSC還表現出對多種抗腫瘤藥物的耐藥性（表達耐藥基因），被認為是導致腫瘤化療失敗的重要原因。

耐藥基因是一種在細胞膜表面表達的ATP-binding cassette（ABC）家族膜轉運蛋白[10]，這類蛋白通過ATP水解供能，逆濃度梯度將代謝產物、藥物、毒性物質、染料等多種物質泵出細胞外，導致細胞內藥物或染料濃度降低，而產生多藥耐藥及外排染料等表型[10]。ABC轉運蛋白家族參與腫瘤多藥耐藥的成員中，研究最深入是ABCB1。ABCB1由多藥耐藥基因mdr1（multidrug resistance 1）所編碼，通過其疏水位點與疏水性抗腫瘤藥物，如長春新堿或鹽酸米托蒽醌結合，經ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細胞外，導致細胞內藥物濃度降低而產生耐藥，這種泵出作用能夠通過ABCB1抑制劑維拉帕米（Verapamil）的作用而逆轉[11-12]。ABCB1在多種癌細胞中過表達，是細胞內聚集足量藥物的主要障礙之一，超過90%的轉移癌患者臨床治療失敗與mdr1基因過表達有關[13-14]。

鑒于瘢痕疙瘩浸潤性的生長方式及治療后易于產生藥物耐藥性等特性，我們認為瘢痕疙瘩中可能也存在著表達耐藥基因的細胞。本研究以正常皮膚為對照，檢測瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞耐藥基因mdr1的表達狀況，探索瘢痕疙瘩對于藥物治療產生耐藥性的機理。

1　材料和方法

1.1試驗試劑

0.2%Ⅰ型膠原酶（Worthington，USA）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco，USA）；磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶（上海思吉生物制品有限公司）；胎牛血清（上海華美生物工程公司）；mdr1引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）；ABCB1鼠抗人抗體（Chemicon，USA）；ABCB1流式檢測抗體（Ebioscience，USA）。

1.2方法

瘢痕疙瘩及正常皮膚標本均來源于手術切除的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織，獲患者及家屬知情同意（表1）。

表1　瘢痕疙瘩與正常皮膚標本Table 1The data of keloid and normal dermal specimens

1.2.1獲取KF和NF組織中成纖維細胞

將獲得的KF和NF組織用氯霉素、PBS各振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌條件下去除表皮和皮下脂肪組織，將KF和NF真皮部分剪至1 mm×1 mm×1 mm大小，PBS振蕩洗滌1遍后加入0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化，6～8 h（正常皮膚4～6 h）后收獲真皮層細胞。取少量細胞，加入臺盼藍溶液進行拒染試驗，血球記數板活細胞計數。用低糖DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，以1×106個/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2RT-PCR檢測mdr1基因在KF及NF成纖維細胞中的表達

預冷的PBS沖洗KF及NF成纖維細胞2遍，各加入1 ml Trizol和4℃氯仿400 μL，劇烈振蕩10 sec，室溫下靜置15 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取0.5 mL上清于另一EP管內，加入4℃異丙醇500 μL，混勻，靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清后加入75%乙醇1 mL，振蕩；4℃、7 500 r/min離心10 min；棄上清；50 μL 0.01%DEPC水溶解混勻，測OD值，瞬時離心。按說明書進行逆轉錄和real time-PCR檢測（表2）。

表2　mdr1和β-actin的基因引物序列Table 2Gene primer sequences of mdr1 and β-actin

1.2.3免疫組織化學法檢測ABCB1蛋白在KF及NF組織中的表達

常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，60℃烤片1 h后脫蠟，PBS沖洗3 min×3次；體積分數3%的H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫下放置15 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加山羊血清30 μL阻斷非特異性抗原，室溫下15 min，傾去勿洗，滴加30 μL一抗（鼠抗人ABCB1），抗體1∶100稀釋，4℃濕盒過夜；PBS沖洗3 min×3次，滴加30 μL生物素化二抗，37℃孵育30 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB室溫下避光顯色；自來水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。以PBS代替一抗作為空白對照，鏡下觀察并拍照。

1.2.4流式細胞分析KF及NF組織成纖維細胞中ABCB1蛋白的表達

將KF和NF原代細胞消化后，4%FBS-PBS緩沖液重懸，濾網過濾為單細胞懸液，進行記數；離心1 500 r/min，5 min；棄廢液，加入4%FBS-PBS緩沖液中稀釋，平均分裝入EP管中，每管細胞數約為0.5×106個；加入抗體，抗體1∶20稀釋，充分震蕩混勻；置于冰盒內30 min，每隔10 min將細胞懸液震蕩混勻；30 min后，以4%FBS-PBS（500 μL/EP管）洗滌離心2次，充分洗凈殘余抗體；上流式細胞儀進行流式檢測。

1.2.5統(tǒng)計分析

2　結果

2.1RT-PCR檢測mdr1基因在KF和NF成纖維細胞中的表達

我們對6例KF和6例NF真皮成纖維細胞進行了RT-PCR檢測，在基因水平上檢測兩者成纖維細胞中mdr1的表達差異。結果顯示，KF成纖維細胞中mdr1基因表達量較高，明顯高于NF，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1　瘢痕疙瘩和正常真皮組織中mdr1的基因表達情況分析（*：P＜0.05）Fig.1The expression of mdr1 gene in keloid and normal dermis(*：P<0.05)

2.2免疫組織化學染色檢測ABCB1蛋白在KF和NF中的表達

我們對5例KF和3例NF進行了免疫組織化學染色。KF中ABCB1陽性細胞散在分布于真皮層，同一標本不同區(qū)域的陽性細胞密度有一定差異，不同標本間陽性細胞的比例亦有所不同，反映出KF標本個體間差異較大；而在NF真皮層中亦存在ABCB1陽性細胞，但較稀少。對每個視野（400×）中ABCB1陽性細胞數進行定量分析，KF和NF中ABCB1陽性細胞數分別為（9.08±2.65）和（0.60±0.16），占比分別為（8.53±3.28）%和（1.15±0.41）%，KF中ABCB1陽性細胞數明顯高于NF組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2　瘢痕疙瘩和正常真皮組織中ABCB1蛋白表達情況分析Fig.2ABCB1 protein expression in keloids and normal dermis

2.3流式細胞分析ABCB1蛋白在KF及NF成纖維細胞中的表達

我們對3例KF和3例NF的原代細胞進行了ABCB1流式分析。ABCB1在原代KF中有表達，在KF原代細胞中ABCB1的表達率較高，為（3.71± 0.71）%，而NF原代細胞中ABCB1表達率比較低，約為0.13%?？傮w上兩種標本來源的原代細胞中都可以檢測到ABCB1的表達，KF組表達水平要明顯高于NF組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4不同部位KF成纖維細胞中ABCB1的表達結果分析

30例KF流式細胞分析ABCB1蛋白表達量結果顯示，KF原代成纖維細胞中ABCB1表達為胸部明顯高于背部和腹部，差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖3　KF、NF原代細胞中ABCB1表達水平的流式細胞檢測及分析結果（*：P<0.05）Fig.3ABCB1 expression in keloid fibroblasts and normal dermal fibroblasts by flow cytometry(*:P<0.05)

圖4　不同部位瘢痕疙瘩成纖維細胞中ABCB1的蛋白表達（*：P＜0.05；**：P＜0.01）Fig.4The expression of ABCB1 protein in fibroblasts of different body parts of keloid(*:P<0.05;**:P<0.01)

3　討論

瘢痕疙瘩是自發(fā)或繼發(fā)于皮膚損傷，以膠原過度沉積于真皮和皮下組織為特征的過度纖維化疾病，是人類特有的病理現象，好發(fā)于胸骨區(qū)、肩背部、下頜部及耳部等，且具有一定的遺傳傾向及家族聚集性[15-17]，多見于有色人種。瘢痕疙瘩的發(fā)病機理尚未明確，治療后極易復發(fā)，導致臨床缺乏切實有效的治療手段[18-19]，嚴重者伴有長期感染，甚至惡化，造成患者極大的身心痛苦和經濟負擔。

目前雖有多種治療手段，但瘢痕疙瘩經過各種單一治療后都易復發(fā)，復發(fā)范圍可超過原瘢痕范圍[2]。糖皮質激素或抗腫瘤藥物瘢痕內注射是最為有效的治療手段，但治療一段時間后機體可能對該藥物產生耐藥性，導致治療效果減弱。此外，瘢痕疙瘩可以采用抗腫瘤藥物，如5-氟尿嘧啶（5-FU）、平陽霉素、秋水仙堿、絲裂霉素等進行治療[6，22]，治療后大部分瘢痕疙瘩會出現萎縮，但仍存在一定的復發(fā)率，并出現瘢痕疙瘩局部組織對治療藥物不敏感的現象，提示瘢痕疙瘩可能存在與腫瘤類似的“細胞耐藥”機制[23]。

關于腫瘤細胞的耐藥機制，最新的學說認為是由于腫瘤干細胞（Tumor stem cell，TSC）表達耐藥基因所致[7-8]，即TSC表現出對多種抗腫瘤藥物的耐藥性（表達耐藥基因）。腫瘤對化療藥物固有或獲得性耐受，是阻礙化療成功的巨大障礙。在腫瘤耐藥基因的研究中，以對ABC蛋白家族的研究較為深入。ABC蛋白家族為細胞膜上的藥物流出泵，在細胞耐藥機制中起重要作用[24]。例如，急性白血病的化療失敗與癌細胞ABCB1，ABCB2及米托蒽醌耐藥蛋白（Mitoxantrone resistance protein，MXR）的過表達密切相關[25-26]。近年來，隨著對ABCB1研究的深入，ABCB1被公認為導致多種細胞耐藥的蛋白，運用藥物SCI-1776阻斷ABCB1的表達，可以提高癌癥化療成功率[27]。而Song等[23]發(fā)現，瘢痕疙瘩成纖維細胞對長春新堿和米多蒽醌存在耐藥性，提示瘢痕疙瘩成纖維細胞可能也存在耐藥基因的過表達。

本研究結果顯示，mdr1基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中表達明顯上調，提示瘢痕疙瘩的發(fā)病和復發(fā)可能與耐藥基因mdr1的過表達有關；此外，免疫組化及流式細胞分析結果顯示，瘢痕疙瘩比正常皮膚組織含有更多ABCB1陽性細胞，說明KF對抗腫瘤藥物的耐受很可能與ABCB1的表達有關。ABCB1陽性細胞亞群在瘢痕疙瘩的發(fā)病中可能具有重要的意義，該亞群可能是瘢痕疙瘩組織中的瘢痕疙瘩干細胞，正是由于該群細胞的存在，造成瘢痕疙瘩出現耐藥性和高復發(fā)、浸潤性生長等特點。

對發(fā)生在機體不同部位的瘢痕疙瘩，流式分析發(fā)現，胸部的瘢痕疙瘩成纖維細胞ABCB1表達陽性率最高，人體胸部張力相對較高[28]，是瘢痕疙瘩最易發(fā)生的部位，說明瘢痕疙瘩成纖維細胞中ABCB1的表達可能與瘢痕疙瘩的生長環(huán)境有一定的聯系，張力較大的環(huán)境利于瘢痕疙瘩干細胞的生長。后續(xù)實驗中，我們選取患者胸部的瘢痕疙瘩成纖維原代細胞進行流式細胞分選，篩選出ABCB1陽性和陰性細胞進行培養(yǎng)，但細胞活力差，懸浮在培養(yǎng)皿中，未能繼續(xù)進一步驗證ABCB1陽性細胞是否就是瘢痕疙瘩干細胞。

結合本研究，我們認為瘢痕疙瘩成纖維細胞中膜轉運蛋白表達的增強可能與瘢痕疙瘩的耐藥性相關。膜轉運蛋白與瘢痕疙瘩干細胞之間的關系及其在瘢痕疙瘩發(fā)病中的作用，需要深入研究，以揭示瘢痕疙瘩耐藥及易復發(fā)的機制，為瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

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Research of Drug Resistance Gene MDR1 in Keloid Fibroblasts

CHEN Yahong,QU Miao,WANG Wenbo,LIU Wei,WU Xiaoli.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 20001l,China.Corresponding author:WU Xiaoli(E-mail:wuxiaoli528@126.com).

【Abstract】ObjectiveTo compare the expression of drug resistance gene mdr1 between keloid fibroblast(KF)and normal dermal fibroblast(NF).MethodsThe expression of drug resistance gene mdr1 and its corresponding protein ABCB1 in KF and NF were assessed with real-time PCR,immunohistochemical and flow cytometry.The expression of ABCB1 protein in 30 cases of keloid was analyzed by flow cytometry.ResultsThe expression of mdr1 and ABCB1 in keloid was significantly higher than in normal skin;The expression rate of ABCB1 of the primary fibroblasts in pectoral keloid was higher than in abdominal and dorsal keloid.ConclusionDrug resistance gene mdr1and its corresponding protein ABCB1are all expressed in KF,and the expression amount is much higher than in NF.

【Key words】Keloid;Fibroblast;Multi-drug resistance gene

收稿日期：（2015年12月4日；修回日期：2015年12月23日） （2015年11月15日；修回日期：2015年12月28日）

通信作者：武曉莉（E-mail：wuxiaoli528@126.com）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.003

【中圖分類號】R619+.6

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）01－0011－05

作者單位：200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。