合成角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性短肽促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

宗憲磊　陸海濱　祁佐良　李國(guó)菊　宋國(guó)棟　都樂　靳小雷　姜篤銀

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合成角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性短肽促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

宗憲磊陸海濱祁佐良李國(guó)菊宋國(guó)棟都樂靳小雷姜篤銀

【摘要】目的應(yīng)用噬菌體隨機(jī)7肽庫篩選角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factor，KGF）的關(guān)鍵序列，進(jìn)行KGF活性短肽的調(diào)整和合成，并研究其對(duì)表皮細(xì)胞增殖的作用。方法以KGF單克隆抗體為靶，篩選噬菌體隨機(jī)7肽庫，獲得KGF的特異性序列，并進(jìn)行序列調(diào)整。用免疫熒光法檢測(cè)KGF活性短肽的表皮細(xì)胞親和力。用CCK-8法檢測(cè)KGF活性短肽對(duì)表皮細(xì)胞增殖的影響。用RT-PCR法和Western-blot法檢測(cè)表皮細(xì)胞上特異性受體KGFR的表達(dá)水平。結(jié)果篩選噬菌體隨機(jī)7肽庫，獲得2個(gè)與KGF相似的特異性序列，合成獲得2個(gè)KGF活性短肽，并純化至98%純度，短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉，N端進(jìn)行羅丹明激光染料標(biāo)記。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，2個(gè)KGF活性短肽均能夠與表皮細(xì)胞相結(jié)合。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，2個(gè)KGF活性短肽能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，并呈濃度依賴性。RT-PCR和Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，2個(gè)KGF活性短肽組中表皮細(xì)胞表達(dá)KGFR增強(qiáng)。結(jié)論從噬菌體隨機(jī)7肽庫中篩選到2個(gè)KGF的關(guān)鍵序列，合成的2個(gè)KGF活性短肽能夠與KGFR相結(jié)合，并增強(qiáng)KGFR的表達(dá)，從而促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，有望應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

【關(guān)鍵詞】噬菌體隨機(jī)7肽庫角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性短肽表皮細(xì)胞創(chuàng)面愈合

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factor，KGF）是一種上皮細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子，由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，通過旁分泌機(jī)制分泌，與上皮細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合，與上皮創(chuàng)面愈合關(guān)系密切[1-2]。局部應(yīng)用生長(zhǎng)因子有助于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是目前應(yīng)用的生長(zhǎng)因子產(chǎn)品存在很多缺點(diǎn)。近年來，寡肽和多肽的研究及應(yīng)用空前繁榮，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[3]。噬菌體隨機(jī)肽庫是呈現(xiàn)特定長(zhǎng)度的各種不同外源性多肽的噬菌體集合物。在M13噬菌體PⅢ基因的一側(cè)隨機(jī)插入特定長(zhǎng)度的外源性隨機(jī)寡核苷酸，可在噬菌體表面呈現(xiàn)出與PⅢ蛋白融合的隨機(jī)多肽，構(gòu)成完整的肽庫[4]。噬菌體隨機(jī)肽庫涵蓋性好，已廣泛應(yīng)用于抗原表位的模擬和蛋白質(zhì)工程的改造等的研究，特別是小分子活性肽的展示，可用于研制新型創(chuàng)面藥物和受體激動(dòng)劑。我們前期工作中已從噬菌體隨機(jī)7肽庫中篩選獲得KGF的關(guān)鍵序列[5-7]。本研究擬進(jìn)行KGF活性短肽的合成，探討其對(duì)表皮細(xì)胞的作用，為生長(zhǎng)因子的結(jié)構(gòu)調(diào)整和生產(chǎn)方法開拓新的思路。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

噬菌體隨機(jī)7肽庫試劑盒（NEB公司，美國(guó)），KGF（Peprotech公司，美國(guó)），KGF單克隆抗體、KGFR單克隆抗體（R&D公司，美國(guó)），KGF ELISA試劑盒（Sunbio公司，上海），DispaseⅡ（Roche公司，USA），D-PBS、PBS、FBS、胰蛋白酶（Hycolone公司，美國(guó)），KM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），CCK-8試劑盒（同仁公司，日本），免疫熒光檢測(cè)試劑盒（博士德公司，武漢），RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（Takara公司，日本）。

酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），熒光定量PCR儀為Applied Biosystems 7000 Real Time PCR System，電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD公司），凝膠成像儀為TANON GIS-2008，超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，蘇州），細(xì)胞培養(yǎng)箱（HERAEUS公司，德國(guó)）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1KGF關(guān)鍵片段篩選

以人KGF單克隆抗體包被96孔板，添加噬菌體隨機(jī)7肽庫孵育，TBST洗板10次，洗脫緩沖液（0.2 mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，0.1%BSA）洗脫結(jié)合的噬菌體，中和緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，pH 9.1）快速中和洗脫物。應(yīng)用E.coli ER2738宿主菌對(duì)洗脫物進(jìn)行擴(kuò)增用于下一輪篩選。同樣方法對(duì)每輪的洗脫物再行三輪篩選。對(duì)第四輪的洗脫物進(jìn)行滴度測(cè)定，隨機(jī)挑選噬菌體藍(lán)斑，擴(kuò)增，調(diào)整至2.0×1013pfu/mL。應(yīng)用ELISA方法和人KGF免疫測(cè)定試劑盒檢測(cè)單克隆噬菌體的結(jié)合力。挑選結(jié)合力好的噬菌體，應(yīng)用碘化物緩沖液法提取噬菌體DNA，送北京華大基因有限公司，進(jìn)行染料示蹤的雙脫氧法自動(dòng)測(cè)序。應(yīng)用核酸Blast系統(tǒng)檢測(cè)模擬肽DNA的相似性[5-7]。

1.2.2KGF活性短肽合成

因?yàn)楹Y選獲得的短肽序列只有部分堿基和KGF的序列相同。因此，參考KGF的相對(duì)應(yīng)序列調(diào)整短肽的堿基序列和氨基酸序列。送武漢明皓生物科技有限公司進(jìn)行KGF活性短肽的合成，純化為98%純度，然后對(duì)短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉，對(duì)短肽的N端進(jìn)行羅丹明激光染料標(biāo)記。制備成凍干粉，-20℃保存。

1.2.3細(xì)胞系和培養(yǎng)方法

取新鮮正常人皮膚，修剪為厚中厚皮片，應(yīng)用DispaseⅡ4℃消化12 h，分離獲得表皮層，剪碎表皮層，應(yīng)用0.25%的胰蛋白酶37℃消化10 min，以胎牛血清中和胰蛋白酶，獲得單個(gè)表皮細(xì)胞，以KM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，取3～6代的表皮細(xì)胞用于離體試驗(yàn)。所有培養(yǎng)基添加100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。

1.2.4細(xì)胞結(jié)合性檢測(cè)

共設(shè)2組：KGF活性短肽1組，KGF活性短肽2組。將表皮細(xì)胞種植于24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用KM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，換液，于兩組中分別添加KGF活性短肽1（濃度為0.5 ng/mL）和KGF活性短肽2（濃度為0.5 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，應(yīng)用D-PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定0.5 h。嚴(yán)格按照免疫熒光檢測(cè)試劑盒的操作說明進(jìn)行操作。

1.2.5細(xì)胞增殖檢測(cè)

共設(shè)4組：陰性對(duì)照組，KGF陽性對(duì)照組，KGF活性短肽1實(shí)驗(yàn)組和KGF活性短肽2實(shí)驗(yàn)組。應(yīng)用CCK-8法定量檢測(cè)表皮細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量。將第3～6代表皮細(xì)胞消化，制成細(xì)胞懸液后，接種于96孔板，每孔10 000個(gè)細(xì)胞。應(yīng)用KM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，換液，于4組中分別添加PBS、KGF（濃度為5 ng/mL、0.5 ng/mL和0.05 ng/mL），KGF活性短肽1（濃度為5 ng/mL、0.5 ng/mL和0.05 ng/mL）和KGF活性短肽2（濃度為5 ng/mL、0.5 ng/mL和0.05 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔添加20 μL無菌CCK-8液，繼續(xù)避光培養(yǎng)2 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm及630 nm的吸光度值。

1.2.6定量PCR檢測(cè)

共設(shè)4組：陰性對(duì)照組，KGF陽性對(duì)照組，KGF活性短肽1實(shí)驗(yàn)組和KGF活性短肽2實(shí)驗(yàn)組，藥物濃度參照細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果。制備表皮細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用KM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，換液，于4組中分別添加PBS、KGF（濃度0.5 ng/mL）以及KGF活性短肽1（濃度0.5 ng/mL）和KGF活性短肽2（濃度0.5 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，以0.25%胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液，對(duì)KGFR進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。β-actin引物：上游序列5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游序列5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′（204 bp）。KGFR引物：上游序列5′-CGTTTCATCTGCCTGGTCGT-3′，下游序列5′-GCATCTTTCAACAGGCAGCG-3′（186 bp）。

首先抽提總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA總量為2 μg，反應(yīng)總體積為20 μL體系。在65℃水浴處理5 min，室溫放置10 min，高速離心5 sec。隨后按下列順序在1.5 mL離心管中加入下列反應(yīng)物（總體積為20 μL）：RNA酶抑制劑（50 U/μL）0.5 μL，5× buffer（Promega）4 μL，dNTP MIX（10 mM/each）2 μL，DTT 2 μL，M-MLV（200 U/μL）1 U/μL。水浴37℃下反應(yīng)1 h，90℃處理5～10 min，冰浴5 min，高速離心5 sec。隨后進(jìn)行熒光定量PCR，為20 μL體系，置入定量PCR儀反應(yīng)。

1.2.7Western-blot檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分組和處理方法同RT-PCR。每孔添加PBS溶液200 μL，同時(shí)加入適當(dāng)濃度的蛋白抑制劑PMSF，冰上超聲波處理至組織完全分散，離心，然后測(cè)定蛋白含量。將樣品稀釋至相同總蛋含量，取150 μL樣品加入5×SDS上樣buffer 20 μL，95℃處理10 min。每上樣孔加樣30 μL。

進(jìn)行SDS-PAGE電泳，等待跑出分離膠，將膠放入100 mL陰極buffer，平衡15 min，測(cè)量膠的大小，剪同樣大小的一片PVDF膜，用甲醛（100%）浸泡15 sec，再用雙蒸水浸泡2 min，取出，用陽極bufferⅡ平衡10 min。以半干法轉(zhuǎn)膜：按照順序放置膠、膜和濾紙，插上電源，1.2 mA/cm2轉(zhuǎn)膜1 h，將膜、膠及濾紙小心剝離，將膜放入甲醛中浸泡10 sec，取出置于濾紙上，蒸干濾紙。用麗春紅溶液檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率，用去離子水洗去麗春紅，將膜置于KGFR單克隆抗體（1∶200，用封閉液稀釋）中4℃過夜；用TTBS洗滌3次，每次輕搖10 min；在二抗（1∶2 000，用封閉液稀釋）中孵育1 h；用TTBS洗滌3次，每次輕搖10 min；用DBA溶液顯色；水洗膜終止反應(yīng)；膜用TANON GIS-2008凝膠成像儀拍照并用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用平均密度×凈面積進(jìn)行比較（即各組蛋白電泳條帶平均密度×凈面積/各自對(duì)應(yīng)β-actin蛋白電泳條帶平均密度×凈面積所得比值）。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果以（x±s）表示。應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析法（one-way analysis of variance，ANOVA）和Dunnet's檢測(cè)，分析各組間的差異顯著性。P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1KGF關(guān)鍵片段篩選

通過對(duì)噬菌體隨機(jī)7肽庫篩選，獲得KGF特異性的噬菌體模擬肽，對(duì)80個(gè)噬菌體DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，獲得26個(gè)特異性的堿基序列，其中有2個(gè)序列與人KGF的基因序列相似，并可從人KGF基因序列中尋找到這2個(gè)特異片段的位置[5-7]（表1）。

表1　KGF活性短肽的序列篩選和設(shè)計(jì)Table 1The selection and design of KGF bioactive peptides

2.2KGF活性短肽合成及序列調(diào)整

通過與KGF相對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行比較分析，將21個(gè)堿基修改成和KGF的相對(duì)應(yīng)序列完全一致，完成KGF活性短肽的合成，并純化為98%純度，對(duì)KGF活性短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉，增強(qiáng)短肽的穩(wěn)定性，對(duì)短肽的N端進(jìn)行羅丹明激光染料標(biāo)記，用于鑒定活性短肽能否與表皮細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合。制備成凍干粉，-20℃保存?zhèn)溆茫ū?）。

2.3細(xì)胞結(jié)合性檢測(cè)

應(yīng)用2種KGF活性短肽對(duì)培養(yǎng)的表皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，因?yàn)镵GF活性短肽以羅丹明激光染料進(jìn)行了標(biāo)記，免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果顯示兩組的表皮細(xì)胞均能夠染色，表明2種KGF活性短肽能夠與表皮細(xì)胞上的特異性受體KGFR相結(jié)合（圖1）。

圖1　KGF活性短肽的免疫熒光測(cè)定（200×）Fig.1The immunofluorescence assay of KGF bioactive peptides(200×)

2.4細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果顯示，在陰性對(duì)照組和KGF陽性對(duì)照組、KGF活性短肽1組和KGF活性短肽2組間，均存在顯著差異（P＜0.05），并呈劑量依賴性，KGF和2種KGF活性短肽均能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖（圖2）。

圖2　KGF活性短肽對(duì)表皮細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2KGF bioactive peptides on promoting epidermal cell proliferation

圖3　Real-time PCR檢測(cè)各組KGFR的表達(dá)Fig.3The real-time PCR analysis of the KGFR expression of all groups

2.5定量PCR檢測(cè)

PCR檢測(cè)KGFR表達(dá)的結(jié)果顯示，KGF活性短肽1組最高，陰性對(duì)照組最低，KGF陽性對(duì)照組和KGF活性短肽2組略高于陰性對(duì)照組。陰性對(duì)照組與其他3組間均有顯著差異（P＜0.05）（圖3）。

2.6Western-blot檢測(cè)

Western-blot檢測(cè)顯示，KGF陽性對(duì)照組、KGF活性短肽1組和KGF活性短肽2組的比值均明顯高于陰性對(duì)照組（圖4）。

圖5　Western-blot比值結(jié)果Fig.5The ratio results of Western-blot analysis

3　討論

創(chuàng)面愈合過程包括細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和可溶性分子間復(fù)雜的相互作用，生長(zhǎng)因子是創(chuàng)面愈合必不可少的因素。KGF是目前已知的與皮膚創(chuàng)傷愈合密切相關(guān)的細(xì)胞因子，能夠與表皮細(xì)胞上的KGFR相結(jié)合，在表皮損傷修復(fù)過程中大量表達(dá)，促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)表皮細(xì)胞從傷口邊緣移行到基質(zhì)，加速再上皮化[1-2]。Koria等[8]組裝了一種融合蛋白，包括彈力蛋白類似肽和KGF，保持了KGF和彈力蛋白的特征，能夠增強(qiáng)角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)糖尿病大鼠的全層皮膚缺損創(chuàng)面的再上皮化和肉芽生長(zhǎng)。Peng等[9]應(yīng)用KGF基因敲除小鼠研究KGF對(duì)創(chuàng)面愈合的作用，結(jié)果表明角質(zhì)化細(xì)胞增殖，血管發(fā)生減少，VEGF mRNA水平降低，提示KGF可能通過調(diào)整VEGF的表達(dá)促進(jìn)創(chuàng)面愈合過程中的血管化。KGF應(yīng)用于腐蝕性食管損傷，能夠降低纖維化水平，改善病理組織學(xué)損傷[10]。

局部應(yīng)用生長(zhǎng)因子有助于促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是目前應(yīng)用的生長(zhǎng)因子產(chǎn)品存在很多缺點(diǎn)，包括：①需要應(yīng)用動(dòng)物載體進(jìn)行生產(chǎn)，存在倫理學(xué)和疾病傳播等問題，且產(chǎn)量較低，生產(chǎn)成本較高；②分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用多樣化，難以控制，至今生長(zhǎng)因子的體內(nèi)應(yīng)用未獲國(guó)家批準(zhǔn)通過；③穩(wěn)定性差，易受到創(chuàng)面局部微環(huán)境的影響，易降解失活，生物半衰期短，作用時(shí)間短，需大劑量反復(fù)應(yīng)用才能達(dá)到預(yù)期的治療效果，加重了創(chuàng)面損傷和患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。這些因素限制了生長(zhǎng)因子的廣泛應(yīng)用。目前，寡肽和多肽的研究及應(yīng)用空前繁榮，合成的肽相對(duì)于天然蛋白，具有很多優(yōu)點(diǎn)。包括：①分子量小，作用單一，并可進(jìn)行結(jié)構(gòu)調(diào)整，增強(qiáng)短肽的穩(wěn)定性和性能；②可以直接進(jìn)行大量合成制備，生產(chǎn)成本較低；③不需要借助動(dòng)物載體進(jìn)行生產(chǎn)，避免了倫理學(xué)問題和疾病傳播，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[3]。

我們的前期研究已從噬菌體隨機(jī)7肽庫中篩選獲得KGF的關(guān)鍵序列[5-7]。因?yàn)楂@得的序列結(jié)構(gòu)只有部分堿基和氨基酸與KGF中的相應(yīng)序列相同，所以對(duì)短肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了調(diào)整，將21個(gè)堿基修改成和KGF的相對(duì)應(yīng)序列完全一致。為了增強(qiáng)KGF活性短肽的穩(wěn)定性，對(duì)短肽的C端進(jìn)行氨基化封閉。為了鑒定KGF活性短肽能否與表皮細(xì)胞上的特異性受體KGFR相結(jié)合，對(duì)短肽的N端進(jìn)行了羅丹明激光染料標(biāo)記。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示表皮細(xì)胞能夠染色，表明KGF活性短肽具備了KGF的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，能夠與表皮細(xì)胞上的特異性受體KGFR相結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了表皮細(xì)胞增殖檢測(cè)，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，KGF和2種KGF活性短肽能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性，說明KGF活性短肽能夠形成KGF的關(guān)鍵空間構(gòu)象，與其特異性受體KGFR相結(jié)合，從而起到類似于KGF的作用。在后期的試驗(yàn)中，可能還需要對(duì)短肽序列進(jìn)行延長(zhǎng)或改變個(gè)別氨基酸，需要對(duì)短肽的N端進(jìn)行乙?；忾]，進(jìn)一步增強(qiáng)短肽的穩(wěn)定性。

KGF及其受體KGFR在上皮再生過程中具有關(guān)鍵作用，KGFR特異性表達(dá)于上皮細(xì)胞的表面，KGF與KGFR相結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞的遷移活力[11]。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)KGFR的表達(dá)水平，結(jié)果顯示相對(duì)于陰性對(duì)照組，KGF陽性對(duì)照組、KGF活性短肽1組和KGF活性短肽2組中表皮細(xì)胞表達(dá)KGFR增高，提示KGF通過提高KGFR的表達(dá)水平發(fā)揮促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的正反饋反應(yīng)。

綜上所述，合成的KGF活性短肽能夠與KGFR相結(jié)合，并增強(qiáng)KGFR的表達(dá)，從而促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖，有望應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

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The Experiment of Keratinocyte Growth Factor Bioactive Peptides'Synthesis and Promoting Epidermal Cell Proliferation

ZONG Xianlei1,LU Haibin1,QI Zuoliang1,LI Guoju2,SONG Guodong1,DU Le1,JIN Xiaolei1,JIANG Duyin3.

1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy Medical Sciences,Beijing 100144,China;2 Department of Radiology,School of stomatology,Shandong University,Jinan 250012,China;3 Department of Plastic and Burn Surgery,Department of Emergency,the Second Hospital of Shandong University,Institute of Tissue Engineering of Shandong University,Jinan 250033,China.Corresponding author:JIN Xiaolei(E-mail:jinyuyizxyy@126.com);JIANG Duyin(E-mail:jdybs2@vip.163.com).

【Abstract】ObjectiveTo isolate sequences from a phage display 7-mer peptide library,synthesize keratinocyte growth factor(KGF)bioactive peptide from the isolated sequences and to evaluate the effects of KGF bioactive peptide on epidermal cell proliferation.MethodsUsing monoclonal anti-human KGF antibody as the target,a phage display 7-mer peptide library was screened and target sequences were isolated.The sequences were then modified to generate KGF bioactive peptides.Immunofluorescence assay was performed to evaluate the binding activity of KGF peptides on epidermal cells. CCK-8 was used to detect the effects of KGF bioactive peptide on epidermal cell proliferation.RT-PCT and Western-blot were used to detect the expression of KGF receptor of epithelial cells.ResultsTwo peptides similar to KGF was isolated from a phage display 7-mer peptide library and then modified to generate two KGF bioactive peptides.KGF bioactive peptides were then purified to reach a purity of 98%.The C terminal of KGF bioactive peptides was closed,and the N terminal was labeled with rhodamine dye laser.KGF bioactive peptides were able to combine with the epidermal cells showed by Immunofluorescence assay.CCK-8 test results showed that compared with the control group,the two KGF bioactive peptides promoted epidermal cell proliferation in a dose-dependent manner.RT-PCR and Western-blot test results showedbook=2,ebook=7two KGF bioactive peptidegroup enhanced the expression of KGFR on epidermal cells.ConclusionKGF bioactive peptides can be synthesized based on sequences screened from phage display peptide library.KGF bioactive peptides are capable of combining with KFGR,enhancing the expression KGFR,and thereby promoting the proliferation of epidermal cells.The results are expected to help promoting wound healing.

【Key words】Phage display 7-mer peptide library;Keratinocyte growth factor;Bioactive peptide;Epidermis cell; Wound healing

收稿日期：（2015年12月7日；修回日期：2016年1月14日）

通信作者：靳小雷（E-mail：jinyuyizxyy@126.com）；姜篤銀（E-mail：jdybs2@vip.163.com）。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30670571，81201467）；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2011HM027）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.001

【中圖分類號(hào)】Q813.1+1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1673－0364（2016）01－0001－05

作者單位：100144北京市中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院（宗憲磊，陸海濱，祁佐良，宋國(guó)棟，都樂，靳小雷）；250014山東省濟(jì)南市山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院放射科（李國(guó)菊）；250033山東省濟(jì)南市山東大學(xué)第二醫(yī)院美容整形燒傷外科、急診科，山東大學(xué)組織工程研究所（姜篤銀）。