硫化氫通過(guò)抑制壞死性凋亡對(duì)抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷*

梁偉杰，　何潔儀，　張穩(wěn)柱，　余盛龍，　陳　君，　宋明才，　陳景福，　鄭東誕，　廖新學(xué)

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科， 2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400； 3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州 510700； 4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

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硫化氫通過(guò)抑制壞死性凋亡對(duì)抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷*

梁偉杰1,2，何潔儀1,2，張穩(wěn)柱1,2，余盛龍1,2，陳君1, 2，宋明才1,2，陳景福3，鄭東誕3，廖新學(xué)4△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)心血管內(nèi)科CCU，廣東 廣州 510700；4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

[摘要]目的： 探討硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)能否通過(guò)調(diào)控壞死性凋亡(necroptosis)對(duì)抗高糖(HG)引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷。方法：應(yīng)用Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)能反映壞死性凋亡的RIP3蛋白和cleaved caspase-3蛋白的水平；細(xì)胞計(jì)數(shù)盒測(cè)定心肌細(xì)胞存活率；雙氯熒光素染色熒光顯微鏡照相法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平；羅丹明 123染色熒光顯微鏡照相法測(cè)定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)；Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法測(cè)定凋亡細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果：應(yīng)用HG (35 mmol/L葡萄糖)處理H9c2 心肌細(xì)胞3 h、6 h、9 h、12 h和24 h均能明顯地上調(diào)RIP3蛋白的表達(dá)水平，其中24 h時(shí)RIP3蛋白水平增加最明顯。400 μmol/L硫氫化鈉(NaHS;為H2S的供體)預(yù)處理或壞死性凋亡的特異性阻斷劑necrostatin-1(Nec-1;100 μmol/L)共處理心肌細(xì)胞均能明顯地抑制HG對(duì)RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。此外，NaHS預(yù)處理或Nec-1共處理心肌細(xì)胞均顯著地抑制HG引起的心肌細(xì)胞損傷，使細(xì)胞存活率升高，ROS生成及MMP丟失減少。另一方面，400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞能使凋亡細(xì)胞數(shù)量及cleaved caspase-3表達(dá)明顯減少。結(jié)論：H2S可通過(guò)抑制壞死性凋亡保護(hù)心肌細(xì)胞,對(duì)抗高糖引起的損傷。

[關(guān)鍵詞]壞死性凋亡； 硫化氫； 高糖； 心肌細(xì)胞

細(xì)胞是機(jī)體基本結(jié)構(gòu)和功能單位。細(xì)胞死亡是生命的基本過(guò)程，對(duì)多細(xì)胞生物的發(fā)育和自穩(wěn)平衡極其重要。細(xì)胞死亡可分為凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)、自噬(autophagy)和壞死性凋亡(necroptosis)[1-2]。細(xì)胞凋亡是主動(dòng)的程序性死亡方式，細(xì)胞壞死一直被認(rèn)為是一種隨機(jī)且不受基因調(diào)控的細(xì)胞死亡方式。而壞死性凋亡是一種非凋亡性的程序性死亡方式，即細(xì)胞既具有壞死的形態(tài)學(xué)改變，又具有凋亡所具備的規(guī)律性調(diào)控機(jī)制[3]。壞死性凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，參與缺血性心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和肝、腎臟器損害等多種疾病的發(fā)生[3-6]，深入研究壞死性凋亡的發(fā)生機(jī)制有助于更好地理解體內(nèi)許多病理生理過(guò)程并尋找疾病治療的新靶點(diǎn)。在壞死性凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用，是反映壞死性凋亡的重要指標(biāo)。目前，RIP蛋白家族由RIP1～RIP7共7個(gè)成員組成，其中RIP1和RIP3是參與壞死性凋亡的關(guān)鍵分子蛋白，其相互作用是啟動(dòng)壞死性凋亡的關(guān)鍵。RIP3的表達(dá)與壞死性凋亡呈正相關(guān)，下調(diào)RIP3后可以阻止細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡[3-4,6]。有研究指出，在鏈脲霉素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，心肌炎癥、纖維化及肥厚的發(fā)生伴隨著RIP3的大量表達(dá)[7]，提示壞死性凋亡可能參與高血糖引起的心肌損傷，但該研究小組沒(méi)有觀察抑制壞死性凋亡活動(dòng)后能否對(duì)抗高血糖引起的心肌損傷作用。因此，進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)問(wèn)題，對(duì)防治糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生有重要的意義。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼NO和CO之后第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子[8]。近年來(lái)，H2S在心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用備受關(guān)注。我們已證實(shí)外源性H2S能保護(hù)H9c2 心肌細(xì)胞對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、炎癥及致凋亡作用等一系列的損傷[9-12]。根據(jù)既往的研究[7]，我們推測(cè)壞死性凋亡可能參與高血糖引起的心肌細(xì)胞損傷，但是，H2S能否通過(guò)對(duì)抗高糖引起的壞死性凋亡從而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

為此，本研究建立高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞模型[9]，旨在探討壞死性凋亡在高糖引起心肌細(xì)胞損傷中的作用及外源性H2S能否通過(guò)抑制壞死性凋亡對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷。

材料和方法

1材料

抗RIP3抗體購(gòu)自CST；necrostatin-1(Nec-1)、抗cleaved caspase-3抗體、硫氫化鈉(NaHS)、雙氯熒光素(2’， 7’-dichlorfluorescein diacetate，DCFH-DA)、Hoechst 33258和羅丹明123(rhodamine 123，Rh 123)購(gòu)自Sigma；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8, CCK-8)由Dojindo供應(yīng)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；特級(jí)胎牛血清購(gòu)自Gibco。H9c2 心肌細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)H9c2 心肌細(xì)胞來(lái)源于大鼠胚胎期的心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為6組：(1)正常對(duì)照(control)組：DMEM培養(yǎng)基(5.5 mmol/L 葡萄糖)處理心肌細(xì)胞24 h；(2)高糖(high glucose，HG)損傷組：35 mmol/L 葡萄糖處理心肌細(xì)胞24 h；(3)NaHS+HG組：400 μmol/L NaHS作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖處理24 h；(4)Nec-1+HG組：100 μmol/L Nec-1與35 mmol/L葡萄糖共處理心肌細(xì)胞24 h；(5)NaHS組：400 μmol/L NaHS作用心肌細(xì)胞30 min，撤去，PBS洗2次，接著DMEM培養(yǎng)基處理24 h；(6)Nec-1組：100 μmol/L Nec-1 與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h。

2.3Western blot法檢測(cè)RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平將H9c2 心肌細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS沖洗3次，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后加入抗RIP3抗體或抗cleaved caspase-3抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，然后用TBST洗3次，每次5 min，與相應(yīng)的 II 抗(1∶2 500)在室溫孵育1.5 h，用TBST洗3次，5 min/次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.4CCK-8測(cè)定細(xì)胞存活率將H9c2 心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)到占培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，按各分組處理后，于每孔中加入10 μL CCK-8和90 μL DMEM，輕搖，37 ℃孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)記錄各孔吸光度(A)。取5孔A值的平均數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=處理組A值/對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.5DCFH-DA染色測(cè)定胞內(nèi)ROS水平將H9c2 心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，經(jīng)上述各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素作用后，PBS沖洗3次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37 ℃溫箱中孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon)下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，用ImageJ 1.47i軟件分析5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值[平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity，MFI)，間接反映ROS水平的指標(biāo)]，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.6Rh 123染色測(cè)定線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)將H9c2 心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，上述各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同的處理因素作用后，用PBS沖洗3次，用10 μg/L Rh 123的無(wú)血清培養(yǎng)基于37 ℃溫箱中孵育45 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，細(xì)胞核周?chē)G色的亮點(diǎn)即為攝取了Rh 123的線粒體。用ImageJ 1.47i軟件分析5個(gè)視野綠色熒光的MFI(數(shù)值大小可間接反映MMP水平)，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.7Hoechst 33258核染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡將H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長(zhǎng)到占培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，按各分組處理后，用PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛于4 ℃環(huán)境中固定10 min，加入含5 mg/L Hoechst 33258試劑，于37 ℃溫箱孵育30 min，在熒光顯微鏡(TE-2000 Nikon)下攝片，鑒別正常的心肌細(xì)胞和凋亡的心肌細(xì)胞，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1Nec-1抑制HG對(duì)心肌細(xì)胞RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)作用

高糖分別處理H9c2 心肌細(xì)胞0～24 h，其中，3 h時(shí)RIP3蛋白的表達(dá)水平開(kāi)始明顯升高(P<0.01)，6 h、9 h、12 h時(shí)進(jìn)一步升高(P<0.01)，HG作用24 h時(shí)，RIP3蛋白表達(dá)水平最高(P<0.01)。應(yīng)用100 μmol/L壞死性凋亡的特異性阻斷劑Nec-1與HG共處理心肌細(xì)胞24 h，能明顯抑制HG對(duì)RIP3的上調(diào)作用，與HG損傷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。100 μmol/L Nec-1本身對(duì)心肌細(xì)胞RIP3蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平無(wú)明顯影響，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Necrostatin-1 (Nec-1; an inhibitor of necroptosis) attenuated high glucose (HG; 35 mmol/L glucose)-induced up-regulation of RIP3 expression in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖1Nec-1抑制高糖對(duì)H9c2 心肌細(xì)胞RIP3表達(dá)的上調(diào)作用

2H2S減弱高糖對(duì)心肌細(xì)胞RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)作用

HG處理心肌細(xì)胞24 h可使RIP3蛋白的表達(dá)明顯增多，但是，在HG處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理30 min可使HG對(duì)RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)作用顯著減弱，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS本身對(duì)心肌細(xì)胞RIP3蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平無(wú)明顯的影響,見(jiàn)圖2。

Figure 2.Hydrogen sulfide (H2S) attenuated HG-induced up-regulation of RIP3 expression in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖2H2S減弱高糖對(duì)心肌細(xì)胞RIP3表達(dá)的上調(diào)作用

3H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細(xì)胞毒性

高糖處理H9c2 心肌細(xì)胞24 h，可誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率明顯降低，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。但是，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能明顯地抑制HG引起的心肌毒性，使細(xì)胞存活率升高，與HG組處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS本身不影響心肌細(xì)胞的存活率。

與NaHS的作用相類(lèi)似，應(yīng)用100 μmol/L Nec-1共處理心肌細(xì)胞24 h也能對(duì)抗HG對(duì)細(xì)胞存活率的抑制作用(P<0.01)。單純予100 μmol/L Nec-1共處理心肌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯的影響,見(jiàn)圖3。

4H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

高糖作用心肌細(xì)胞可引起明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為MFI明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照(control)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。但是，HG+NaHS組顯示400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能使胞內(nèi)ROS生成明顯地減少，MFI從(30.60±1.25)%減少至(14.00±1.06)%，與HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。與NaHS的作用相類(lèi)似，應(yīng)用100 μmol/L Nec-1共處理心肌細(xì)胞24 h也能使細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，MFI減少至(13.60±1.38)%。分別應(yīng)用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L Nec-1處理心肌細(xì)胞對(duì)ROS的基礎(chǔ)生成無(wú)明顯的影響，見(jiàn)圖4。

Figure 3.Hydrogen sulfide (H2S) and necrostatin-1 (Nec-1) inhibited HG-induced cytotoxicity in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖3H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細(xì)胞毒性

5H2S和Nec-1減少高糖引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位丟失

如圖5所示，采用HG作用H9c2心肌細(xì)胞24 h可使胞內(nèi)Rh 123的MFI從(30.50±1.27)%降低至(9.57±0.90)%，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。然而，400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能顯著地減少M(fèi)MP的丟失，使MFI升高至(20.40±1.38)%，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。與NaHS的作用相類(lèi)似，應(yīng)用100 μmol/L Nec-1共處理心肌細(xì)胞24 h也能對(duì)抗HG對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損傷，使MFI增加至(20.50±1.20)%。分別應(yīng)用400 μmol/L NaHS或100 μmol/L Nec-1處理心肌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞MMP的大小無(wú)顯著影響。

6H2S抑制高糖的致心肌細(xì)胞凋亡作用

Hoechst核染色的檢測(cè)結(jié)果顯示，正常H9c2心肌細(xì)胞的染色質(zhì)分布均勻，呈現(xiàn)出彌散均勻的低密度熒光。應(yīng)用HG處理心肌細(xì)胞24 h后，呈現(xiàn)典型的凋亡特征(即細(xì)胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光)的細(xì)胞數(shù)量增多，與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能明顯地減少凋亡細(xì)胞數(shù)量，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。

Figure 4.Hydrogen sulfide (H2S) and necrostatin-1 (Nec-1) inhibited HG-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖4H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

Figure 5.Hydrogen sulfide (H2S) and necrostatin-1 (Nec-1) inhibited HG-induced loss of mitochondrial membrane potential (MMP) in the H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖5H2S和Nec-1抑制高糖引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位丟失

同樣地，HG處理心肌細(xì)胞24 h能明顯增加cleaved caspase-3(為凋亡的終末效應(yīng)器)的水平，應(yīng)用400 μmol/L NaHS預(yù)處理心肌細(xì)胞30 min能使cleaved caspase-3的蛋白水平明顯減少，與HG損傷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01),見(jiàn)圖6。

Figure 6.Hydrogen sulfide (H2S) reduced HG-induced apoptosis of H9c2 cells. A: Hoechst 33258 staining; B: cleaved caspase-3 protein expression detected by Western blot. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖6H2S抑制高糖的致心肌細(xì)胞凋亡作用

討論

壞死性凋亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，既具有壞死的形態(tài)學(xué)特征，又具有凋亡所具備的程序性調(diào)控機(jī)制，其英文命名“necroptosis”就是由凋亡(aptoptosis)和壞死(necrosis)2個(gè)單詞組合而成。研究證實(shí)：壞死性凋亡參與缺血性心臟血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生[3-7]，是目前國(guó)際上極其活躍的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，RIP1和RIP3是啟動(dòng)壞死性凋亡的關(guān)鍵蛋白分子[3-4,6,13]。Luedde等[13]證實(shí)：心肌梗死的大鼠，其心肌細(xì)胞的RIP3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而過(guò)量表達(dá)的RIR3可導(dǎo)致壞死性凋亡的發(fā)生。Liu等[7]報(bào)道：在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，心肌炎癥、纖維化、肥厚的發(fā)生伴隨著RIP3的大量表達(dá)，提示糖尿病大鼠的心肌存在壞死性凋亡。與他們的研究結(jié)果相類(lèi)似，本研究觀察到HG在引起心肌細(xì)胞損傷的同時(shí)，可呈時(shí)間依賴性地上調(diào)心肌細(xì)胞RIP3蛋白的表達(dá)水平，并從細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)一步證實(shí)，HG可引起心肌細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生。為了進(jìn)一步證實(shí)壞死性凋亡在HG損傷心肌細(xì)胞中的作用，本研究觀察了壞死性凋亡的特異性抑制劑Nec-1對(duì)HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果表明，Nec-1在抑制RIP3蛋白表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，還能減輕HG引起的心肌細(xì)胞多種損傷，使細(xì)胞存活率升高、ROS生成及MMP丟失減少。上述結(jié)果清晰地提示：壞死性凋亡介導(dǎo)HG導(dǎo)致的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激和線粒體損傷等心肌損傷，這進(jìn)一步擴(kuò)展了Liu等[7]的研究結(jié)果，為闡明壞死性凋亡在糖尿病心肌損傷中的作用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

H2S是繼NO和CO之后的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，具有多種生理和病理生理功能。最近，H2S在糖尿病相關(guān)的心血管系統(tǒng)并發(fā)癥中的防治作用得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。我們已證實(shí)H2S通過(guò)調(diào)控p38 絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、瘦素(leptin)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路和ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive K+channel, KATP通道)[9-12]，保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗高糖引起的一系列損傷，包括抗細(xì)胞毒性、抗氧化、減輕線粒體損傷、抗炎癥和抗凋亡等。但H2S的心肌細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制是十分復(fù)雜的，可能涉及其它未知的作用和信號(hào)通路，因此，進(jìn)一步深入探討H2S的心肌保護(hù)作用及機(jī)制非常有意義。本研究重點(diǎn)探討了H2S能否通過(guò)抑制壞死性凋亡對(duì)抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷。我們首先觀察了H2S對(duì)HG促進(jìn)RIP3表達(dá)作用的影響。結(jié)果表明，H2S能抑制HG對(duì)心肌細(xì)胞RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。此外，應(yīng)用H2S預(yù)處理心肌細(xì)胞和應(yīng)用Nec-1共處理心肌細(xì)胞均產(chǎn)生類(lèi)似的心肌保護(hù)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率升高、ROS 生成及MMP丟失減少。這些結(jié)果充分地證明：H2S是壞死性凋亡的抑制劑之一，抑制壞死性凋亡可能是H2S心肌細(xì)胞保護(hù)作用的另一個(gè)重要機(jī)制。值得注意的是，Han等[14]報(bào)道，應(yīng)用壞死性凋亡的抑制劑Nec-1可使紫草素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞(HL60細(xì)胞)壞死性凋亡轉(zhuǎn)化為凋亡，即加重細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但是，本研究并沒(méi)有觀察到H2S在抑制壞死性凋亡的同時(shí)，增加心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。同時(shí)能抑制壞死性凋亡和細(xì)胞凋亡(表現(xiàn)為凋亡細(xì)胞數(shù)量及cleaved caspase-3表達(dá)減少)，表明H2S是理想的心肌細(xì)胞保護(hù)劑。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Hydrogen sulfide protects H9c2 cardiomyocytes against high glucose-induced injury by inhibiting necroptosis

LIANG Wei-jie1,2, HE Jie-yi1,2, ZHANG Wen-zhu1,2, YU Sheng-long1,2, CHEN Jun1,2, SONG Ming-cai1,2, CHEN Jing-fu3, ZHENG Dong-dan3, LIAO Xin-xue4

(1DepartmentofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict,2CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;3CardiacCareUnit,DepartmentofCardiology,HuangpuDivisionofTheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;4DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To study whether hydrogen sulfide (H2S) protects H9c2 cardiomyocytes against high glucose (HG)-induced injury by inhibiting necroptosis. METHODS: The protein levels of RIP3 (an indicator of necroptosis) and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The intracellular le-vels of reactive oxygen species (ROS) were detected by 2’, 7’-dichlorfluorescein diacetate staining followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was examined by rhodamine 123 staining followed by photofluorography. The number of apoptotic cells was observed by Hoechst 33258 nuclear staining followed by photofluorography. RESULTS: After the H9c2 cells were treated with HG (35 mmol/L glucose) for 0～24 h, the protein expression of RIP3 in the H9c2 cells was significantly increased at 3 h, 6 h, 9 h, 12 h and 24 h, reaching the maximum level at 24 h. Pretreatment of the cells with 400 μmol/L NaHS (a donor of H2S) or co-treatment of the cells with necrostatin-1 (Nec-1; a speci-fic inhibitor of necroptosis) considerably blocked the up-regulation of RIP3 protein induced by HG. Moreover, pretreatment with NaHS or co-treatment with Nec-1 obviously inhibited HG-induced injuries, leading to an increase in the cell viability, and decreases in the generation of ROS and MMP loss. On the other hand, pretreatment with NaHS also reduced the number of apoptotic cells and the protein level of cleaved caspase-3 in the HG-treated H9c2 cardiomyocytes. CONCLUSION: H2S protects H9c2 cardiomyocytes against HG-induced injury by inhibiting necroptosis.

[KEY WORDS]Necroptosis; Hydrogen sulfide; High glucose; Cardiomyocytes

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.001

[中圖分類(lèi)號(hào)]R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-87332628; E-mail： liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270296)；廣東省財(cái)政科技項(xiàng)目(No. 2014SC107)

[收稿日期]2015- 12- 24[修回日期] 2016- 01- 04

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0385- 07

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