核苷功能菌的生物學(xué)特性研究

周新虎，陳　翔，楊　勇，李　喆，嚴(yán)啟梅，甘廣東，宋　寶，譚洪弟（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

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核苷功能菌的生物學(xué)特性研究

周新虎，陳翔，楊勇，李喆，嚴(yán)啟梅，甘廣東，宋寶，譚洪弟
（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

摘要：為了深入研究微分子酒中核苷類(lèi)似物的形成機(jī)理，對(duì)洋河釀造環(huán)境中篩選的核苷功能菌的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)核苷功能菌的形態(tài)、代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)條件進(jìn)行分析和研究。結(jié)果表明，核苷功能菌屬于麥角菌科真菌，能夠代謝生成多糖、腺苷和D-甘露醇等；適宜的生長(zhǎng)溫度范圍為18～25℃，其中22℃最佳；適宜的pH值范圍為5～7，最適pH值為5；能利用多種碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽；碳源中，二糖的利用效果更好，其中蔗糖最佳；氮源中，有機(jī)氮源能更好地被利用，其中酵母膏最佳；無(wú)機(jī)鹽中Na2HPO4最佳。

關(guān)鍵詞：核苷；生物學(xué)特性；代謝；培養(yǎng)條件

隨著生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)健康的訴求已成為中國(guó)白酒未來(lái)的發(fā)展方向和路徑之一。當(dāng)前一些傳統(tǒng)老品牌白酒度數(shù)高，酒量較小者喝了之后容易上頭，導(dǎo)致一些愛(ài)酒人士只能望酒興嘆。正是在這種情況下，洋河酒廠根據(jù)白酒市場(chǎng)不斷發(fā)展變化的需求，在充分掌握綿柔機(jī)理的基礎(chǔ)上，結(jié)合最新研究的微分子技術(shù)，研制成功一款健康白酒——微分子酒。

微分子酒是由微量小分子風(fēng)味組分，以及富含核苷類(lèi)似物為主的生物活性健康物質(zhì)構(gòu)成的綿柔型白酒，具有微量成分多、飲后醒酒快、健康功效好、盡興更省心的特點(diǎn)。自上市以來(lái)，已逐漸受到市場(chǎng)認(rèn)可和消費(fèi)者青睞，并引發(fā)行業(yè)更多關(guān)于“健康生態(tài)”的思考和效仿。據(jù)相關(guān)研究，微分子酒中的核苷類(lèi)物質(zhì)有助于保肝護(hù)肝、提高機(jī)體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等功效，具有良好的保健功能，有極高的開(kāi)發(fā)前景[1-2]。本研究以釀造環(huán)境中篩選的能夠產(chǎn)核苷類(lèi)似物的1株功能菌為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，為其深度應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)菌株：洋河酒廠自主篩選的1株核苷功能菌。葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、飴糖、乳糖、NH4NO3、（NH4）2SO4、NaCl、MgSO4、MnSO4、FeSO4、KH2PO4、KCl、Na2HPO4、CaCl2為分析純；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂為生化試劑；馬鈴薯為食品級(jí)。

儀器設(shè)備：BILON恒溫培養(yǎng)箱，生物潔凈工作臺(tái)，真空冷凍干燥器，離心機(jī)，高壓蒸汽滅菌鍋，多功能環(huán)境模擬箱，可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基[3]

馬鈴薯（PDA）液體培養(yǎng)基：土豆汁1 L、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、pH值自然。

馬鈴薯瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：土豆汁1 L、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g、pH值自然。

液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖4％，蛋白胨1％，KH2PO40.01％，MgSO40.05％。

1.2.2培養(yǎng)基成分篩選[4-5]

在液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別以其他碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行替代，研究其他成分對(duì)核苷功能菌的影響。其中其他碳源為單糖（葡萄糖）、二糖（麥芽糖、乳糖）、土豆汁、飴糖；其他氮源為無(wú)機(jī)氮源（NH4NO3、（NH4）2SO4）、有機(jī)氮源（酵母膏、牛肉膏）；其他無(wú)機(jī)鹽為NaCl、MnSO4、FeSO4、KCl、Na2HPO4、CaCl2。

分別取供試培養(yǎng)基200 mL，裝入500 mL的三角瓶中，滅菌后在無(wú)菌條件下，以10％的接種量接入液體菌種，置于振蕩培養(yǎng)箱中，在25℃、120 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d后終止培養(yǎng)，每組設(shè)2個(gè)重復(fù)。

1.2.3生物量測(cè)定方法

取200 mL發(fā)酵液，經(jīng)4000 r/min離心10 min，收集菌絲體，再置于真空冷凍干燥箱-50℃冷凍干燥直至恒重，稱(chēng)重。按下列公式計(jì)算菌絲體生物量：

菌絲體生物量(g/L)=菌絲體干重(g) /發(fā)酵液體積(L)。

1.2.4溫度對(duì)核苷功能菌的影響[6]

采用不同溫度（10℃、15℃、18℃、22℃、25℃、28℃）進(jìn)行核苷功能菌的培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集菌絲體，測(cè)其生物量。

1.2.5初始pH值對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)速度的影響

采用不同初始pH值（3、4、5、6、7、8）進(jìn)行核苷功能菌的培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集菌絲體，測(cè)其生物量。

1.2.6代謝產(chǎn)物分析

多糖，苯酚硫酸法[7-9]；D-甘露醇，比色法[10]；腺苷，液相色譜法[11]。

2　結(jié)果與分析

2.1核苷功能菌形態(tài)特征及代謝產(chǎn)物

2.1.1核苷功能菌菌落和菌絲的形態(tài)特征

采用PDA固體培養(yǎng)基，于25℃下對(duì)核苷功能菌進(jìn)行暗室培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行顯微鏡觀察。核苷功能菌菌落形態(tài)及鏡檢情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，核苷功能菌在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落呈近似圓形，表面蓬松，凸起呈棉絮狀的半球形，菌絲為白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣整齊，較易挑取。對(duì)核苷功能菌進(jìn)行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)分生孢子為圓形或圓柱形，其外形大小為2.5～3.2 μm× 4.0～6.8 μm；分生孢子著生在孢子梗的頂端，或成單，或成對(duì)，或成簇排列；分生抱子梗單生或有分枝。菌絲有隔膜，粗細(xì)均勻，但老齡菌絲內(nèi)會(huì)形成空泡。

圖1　核苷功能菌菌落形態(tài)和菌絲鏡檢情況

2.1.2核苷功能菌生長(zhǎng)條件

采用PDA固體培養(yǎng)基，在智能人工氣候培養(yǎng)箱中調(diào)控不同培養(yǎng)溫度、濕度條件對(duì)核苷功能菌進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)情況得出最適生長(zhǎng)范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　核苷功能菌培養(yǎng)條件

如表1所示，核苷功能菌在6～30℃范圍內(nèi)都能夠生長(zhǎng)，否則停止生長(zhǎng)甚至死亡，適宜溫度為18～25℃；在相對(duì)濕度處于65％～70％時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)狀況最好，過(guò)小會(huì)造成培養(yǎng)基內(nèi)部失水干枯，過(guò)大則影響菌絲體的生長(zhǎng)，也易引起雜菌滋生。

2.1.3核苷功能菌代謝產(chǎn)物分析

采用PDA液體培養(yǎng)基，以120 r/min、25℃恒溫培養(yǎng)核苷功能菌，5 d后收集菌絲體，并分析其代謝產(chǎn)物及其含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　核苷功能菌代謝產(chǎn)物分析

如表2所示，核苷功能菌在PDA液體培養(yǎng)基中能夠代謝生成多糖、腺苷和D-甘露醇等，通過(guò)對(duì)菌絲體進(jìn)行檢測(cè)與分析，生物量達(dá)到7.58 g/L，多糖為1.64％，腺苷為188.5mg/100 g，D-甘露醇為5.52％。

依據(jù)核苷功能菌的菌落和菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)特性，結(jié)合代謝產(chǎn)物分析，初步認(rèn)為該核苷功能菌屬于麥角菌科真菌，有較高的利用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。

2.2不同培養(yǎng)條件對(duì)核苷功能菌的影響

2.2.1碳源對(duì)核苷功能菌生長(zhǎng)的影響

碳源是微生物合成碳水化合物及氨基酸的基礎(chǔ)，核苷功能菌對(duì)不同碳源的利用及代謝情況不同。分別以葡萄糖、飴糖、麥芽糖、乳糖、土豆汁代替液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)其生物量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　碳源對(duì)核苷功能菌生物量的影響

由圖2可知，核苷功能菌在添加6種碳源的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，說(shuō)明其可以利用多種碳源，但不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不同。從生物量上看，以蔗糖為碳源最有利于菌絲體生長(zhǎng)，其次是飴糖、麥芽糖和乳糖，再次是葡萄糖，而土豆汁最低。由此可知，核苷功能菌能更好的利用二糖，因此，蔗糖是核苷功能菌生長(zhǎng)的最佳碳源。

2.2.2氮源對(duì)核苷功能菌生長(zhǎng)的影響

氮源對(duì)于微生物生長(zhǎng)與代謝影響很大，分別以無(wú)機(jī)氮源（硝酸銨、硫酸銨）和有機(jī)氮源（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨）代替液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)其生物量，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　氮源對(duì)核苷功能菌生物量的影響

由圖3可知，核苷功能菌在添加5種氮源的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，說(shuō)明其可以利用多種氮源。就生物量而言，除蛋白胨外，添加有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中得到的生物量明顯高于采用無(wú)機(jī)氮源，甚至是無(wú)機(jī)氮源的2倍。說(shuō)明無(wú)機(jī)氮源雖然能夠更快的被微生物利用，但核苷功能菌生長(zhǎng)速度慢，而且有機(jī)氮源中有著豐富的蛋白質(zhì)，更適合核苷功能菌菌絲體的生長(zhǎng)需求。在有機(jī)氮源中，牛肉膏和酵母膏都能較好地滿(mǎn)足核苷功能菌的生長(zhǎng)所需，因此，牛肉膏或酵母膏均是核苷功能菌生長(zhǎng)的最佳氮源。

2.2.3無(wú)機(jī)鹽對(duì)核苷功能菌生長(zhǎng)的影響

無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)微生物代謝以及信息傳導(dǎo)具有重要作用。分別以不同無(wú)機(jī)鹽代替液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的KH2PO4、MgSO4，培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)其生物量，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，核苷功能菌在各種無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)。MgSO4和KH2PO4單獨(dú)作為無(wú)機(jī)鹽加入培養(yǎng)基中時(shí)，生物量較基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基低；但核苷功能菌在添加Na2HPO4的培養(yǎng)基中生物量最高，達(dá)10.84 g/L，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生物量高2 g/L左右；添加其余各種無(wú)機(jī)鹽的生物量都較基礎(chǔ)培養(yǎng)基低。因此，Na2HPO4為核苷功能菌菌絲體生長(zhǎng)的最佳無(wú)機(jī)鹽。

圖4　無(wú)機(jī)鹽對(duì)核苷功能菌生物量的影響

2.2.4溫度對(duì)核苷功能菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

以蔗糖為碳源、酵母膏為氮源，Na2HPO4為無(wú)機(jī)鹽配制培養(yǎng)基，接種核苷功能菌于不同溫度（10℃、15℃、18℃、22℃、25℃、28℃）下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)其生物量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　溫度對(duì)核苷功能菌生物量的影響

由圖5可知，核苷功能菌在10～28℃下均能生長(zhǎng)，但不同溫度下核苷功能菌菌絲體生長(zhǎng)情況存在差異。低于18℃，核苷功能菌生長(zhǎng)速率慢，生物量低；在18～25℃時(shí)，核苷功能菌生長(zhǎng)良好，其中生物量在22℃時(shí)達(dá)到最大，為19.57 g/L；高于25℃時(shí)，生物量快速下降。由此可知，核苷功能菌不耐高溫，在低溫下也能生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)適宜溫度為18～25℃，最適溫度為22℃，低于18℃或高于25℃都不利于核苷功能菌生長(zhǎng)，其中高于25℃對(duì)其生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

2.2.5不同初始pH值對(duì)核苷功能菌生長(zhǎng)的影響

以蔗糖為碳源、酵母膏為氮源，Na2HPO4為無(wú)機(jī)鹽配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)不同初始pH值，接種核苷功能菌進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集菌絲體，測(cè)生物量。所得結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　不同初始pH值對(duì)核苷功能菌菌絲體生長(zhǎng)影響

由圖6可知，核苷功能菌在pH 3～8范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)情況有明顯差異。在pH 5～7范圍內(nèi)，生物量較高且較穩(wěn)定；pH值低于5時(shí)，生物量隨pH值升高而緩慢增加；pH值高于7時(shí)，生物量隨pH值的升高而緩慢減少；生物量在pH 5時(shí)達(dá)最大值。由此可知，核苷功能菌生長(zhǎng)適宜pH值范圍為5～7，最適pH值為5，初始pH值低于5或高于7都不利于核苷功能菌的生長(zhǎng)。

3　小結(jié)與展望

3.1對(duì)核苷功能菌菌株形態(tài)及生長(zhǎng)特性分析，并結(jié)合代謝產(chǎn)物，初步認(rèn)為核苷功能菌屬于麥角菌科真菌，有很高的利用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。

3.2由核苷功能菌培養(yǎng)特性研究可知，核苷功能菌能利用多種碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。碳源中，二糖的利用效果較好，其中以蔗糖為最佳；氮源中，有機(jī)氮源的利用效果較好，如牛肉膏或酵母膏；無(wú)機(jī)鹽中以Na2HPO4為最佳。

3.3核苷功能菌適宜的生長(zhǎng)溫度范圍為18～25℃，最適溫度為22℃；適宜的pH值范圍為5～7，最適pH值為5。

3.4通過(guò)對(duì)核苷功能菌生物學(xué)特性的研究，明確了核苷功能菌的生長(zhǎng)與代謝特性，下一步將針對(duì)代謝產(chǎn)物中的多糖和核苷類(lèi)似物進(jìn)行深度開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

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The Biological Properties of Nucleoside Functional Bacteria

ZHOU Xinhu,CHEN Xiang，YANG Yong，LI Zhe，YAN Qimei，GAN Guangdong，SONG Bao and TAN Hongdi
（Jiangsu Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

Abstract:In order to acquire a clear understanding of the formation mechanism of nucleoside analogs in liquor,the biological properties of nucleoside functional bacteria screened from the brewing environment in Yanghe Distillery were studied.Through the analysis of the morphology,metabolites and culture conditions of nucleoside functional bacteria,the results showed that,the nucleoside functional bacteria belong to Clavicipitaceae family,and it could produce polysaccharides,adenosine and D-mannitol etc.;its optimum growth temperature ranges from 18 to 25℃and the best is at 22℃;its optimum pH range is 5 to 7 and the best is 5;it could take advantage of varieties of carbon source,nitrogen source and inorganic salts,and sucrose is the best among all the carbon source,organic nitrogen source (yeast extract ) is the best among all the nitrogen source,and Na2HPO4is the best among all inorganic salts.

Key words:nucleoside;biological properties;metabolism;culture conditions

作者簡(jiǎn)介：周新虎（1962-），男，江蘇宿遷人，碩士，高級(jí)工程師，江蘇洋河酒廠股份有限公司副總裁、總工程師，白酒國(guó)家評(píng)委，中國(guó)首席品酒師、中國(guó)評(píng)酒大師，曾獲全國(guó)五一勞動(dòng)獎(jiǎng)?wù)?，江蘇省突出貢獻(xiàn)專(zhuān)家等榮譽(yù)稱(chēng)號(hào)。

收稿日期：2015-11-13

中圖分類(lèi)號(hào)：TS262.3；Q93-3；TS261.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）02-0051-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015430

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2015-12-01；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151201.1301.001.html。