健脾益氣方含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721增殖與侵襲能力的影響

謝金玲　卓少元　廣西中醫(yī)藥大學(xué)　530001　南寧市明秀東路179號

?

健脾益氣方含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721增殖與侵襲能力的影響

謝金玲卓少元*廣西中醫(yī)藥大學(xué)530001南寧市明秀東路179號

摘要目的：觀察健脾益氣方含藥血清對人肝癌細胞SMMC-7721增殖與侵襲能力的影響。方法：以TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌細胞SMMC-7721上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）模型，制備健脾益氣方大鼠含藥血清，分別以0%、5%、10%、15%、20%、30%含藥血清濃度干預(yù)人肝癌細胞SMMC-7721 12 h、24 h、48 h、72 h后，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測細胞的增殖能力，采用Transwell細胞體外侵襲實驗觀察細胞的侵襲能力。結(jié)果：健脾益氣方對SMMC-7721 EMT細胞的增殖有抑制作用，且隨含藥血清濃度增高而遞增，呈時間依賴性；12 h 10%含藥血清，24 h 15%、20%、30%含藥血清，48 h 15%含藥血清與相對應(yīng)濃度空白血清比較，均具有顯著性差異（P< 0.01），其中以48 h 15%含藥血清濃度對細胞增殖的抑制效果最明顯。健脾益氣方含藥血清各個濃度組與對照組相比，細胞侵襲能力均有不同程度的下降，其中10%、15%、20%、30%濃度的含藥血清都具有顯著性差異（P< 0.01）；而與空白血清組相比，15%、20%、30%濃度的含藥血清均具有顯著性差異（P<0.01），其中以15%濃度的含藥血清對細胞侵襲的抑制作用最明顯。結(jié)論：15%健脾益氣方含藥血清作用48 h，對人肝癌細胞SMMC-7721 EMT模型增殖與侵襲的抑制效果最好。

關(guān)鍵詞健脾益氣方；SMMC-7721；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；MTT；Transwell

Effects of medicated serum containing Jianpi Yiqi decoction on proliferation and invasion of hepatic carcinoma cells SMMC-7721

Xie Jin ling Zhuo Shao yuan*
Guangxi University of Chinese Medicine，NO.179，Mingxiu Dong Rd，Nanning，530001

Abstract Objective:To observe effects of medicated serum containing Jianpi Yiqi decoction on proliferation and invasion of hepatic carcinoma cells SMMC-7721.Methods:The epithelial-mesenchymal transition（EMT）model of hepatic carcinoma cells was induced by TGF-β1to make medicated serum containing Jianpi Yiqi decoction.After 12 h,24 h,48 h,72 h,TGF-β1-induced SMMC-7721 cells were interfered with medicated serum with the concentration of 0%，5%，10%，15%，20%，30%，respectively.The proliferation effect on SMMC-7721 was measured by MTT colorimetric assay and the invasion ability was observed by Transwell invasion assay in vitro.Results:Jianpi Yiqi decoction had inhibitory effect on proliferation for SMMC-7721 EMT cell,which strengthened with the increase of concentration of medicated serum and exhibited time-dependence.Compared with the corresponding blank serum,the inhibition effect of medicated serum with the concentration of 10%on cell proliferation had significant difference at 12 hours（P<0.01）,as well as the medicated serum with the concentration of 15%，20%，30%at 24 hours,and 15%at 48 hours.The medicated serum with the concentration of 15%had the most obvious inhibition effect on cell proliferation at 48 hours.The invasive ability of SMMC-7721 cells was significantly decreased to varying degree after treatment with different concentrations of medicated serum compared with that of control group.The medicated serum with the concentration of 10%，15%，20%，and 30%had significant difference（P<0.01）.Compared with the corresponding blank serum,medicated serum with the concentration of 15%,20%,30%had statistic significance（P<0.01）.The medicated serum with the concentration of 15%had the most obvious inhibition effect on cell invasion.Conclusion:The medicated serum with the concentration of 15%at 48 hours has the best inhibition effect on proliferation and invasion of SMMC-7721 EMT model of hepatic carcinoma cells.

Keywords Jianpi Yiqi decoction；SMMC-7721；EMT；MTT；Transwell

健脾益氣是中醫(yī)臨床防治肝癌的重要治法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)健脾益氣方治療的二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)肝癌大鼠，在提高肝癌大鼠生存率的同時，其肝（含肝癌）組織基因組轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性改變［1］。為進一步闡明健脾益氣方治療肝癌的作用機理，本實驗采用TGF-β1誘導(dǎo)的人肝癌細胞SMMC-7721上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）模型，結(jié)合血清藥理學(xué)方法，通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法和Transwell細胞體外侵襲實驗觀察健脾益氣方不同濃度含藥血清對人肝癌細胞增殖與侵襲能力的影響，以篩選出合適的含藥血清濃度及最佳的作用時間，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　實驗材料

1.1動物健康雄性SD大鼠30只，體重200±20 g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK2009-0002。

1.2人肝癌細胞株人肝癌細胞SMMC-7721，購自中南大學(xué)高等研究中心細胞室。

1.3藥物與試劑健脾益氣方采用免煎中藥配方，藥用：白術(shù)10 g，薏苡仁15 g，黃芪30 g，白芍15 g，神曲10 g，云茯苓15 g，法半夏10 g。免煎中藥為江陰天江藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院。高糖DMEM、胰蛋白酶（Tryprin）、胎牛血清（FBS），均為美國Wisent公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒為Vazyme公司產(chǎn)品；TGF-β1為美國Peprotech公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.4主要儀器細胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；高速離心機（Thermo Fisher Sorvall ST 16R，美國）；熒光顯微鏡（Olympus BX53，日本）；酶標儀（Epoch Biotek，美國）。

2　實驗方法

2.1含藥血清的制備將SD大鼠隨機分為含藥血清組和空白血清組，每組各15只。其中含藥血清組給予健脾益氣方灌胃，給藥劑量=臨床常用量×動物等劑量系數(shù)×培養(yǎng)液內(nèi)稀釋度，即動物等效劑量×培養(yǎng)液內(nèi)稀釋濃度。每日8∶00 和16∶00分別給藥1次，連續(xù)3天，于末次給藥后1 h采血，嚴格無菌操作，腹主動脈采血，血樣置于5 ml采血管，靜置2 h以上，待血塊收縮良好后，3 000 r/min，15 min無菌分離血清，血清以55℃處理30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后置-80℃保存?zhèn)溆??？瞻籽褰M大鼠給予生理鹽水灌胃，其空白血清制備方法同含藥血清組。

2.2人肝癌細胞SMMC-7721 EMT模型制備參照文獻［2-3］，取常規(guī)培養(yǎng)的人肝癌細胞株SMMC-7721于對數(shù)生長期接種在96孔板中，待貼壁后，吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，分別用0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml濃度的TGF-β1處理SMMC-7721細胞12 h、24 h、48 h，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法和Transwell細胞體外侵襲實驗觀察細胞的增殖侵襲能力，選擇最佳誘導(dǎo)濃度和最佳作用時間（后續(xù)實驗以此作為誘導(dǎo)EMT模型的條件），同時采用HE（蘇木精-伊紅）染色法觀察SMMC-7721 EMT模型細胞形態(tài)。

2.3MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期的人肝癌細胞SMMC-7721（已誘導(dǎo)為EMT模型，下同）進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為4×104/ml，以每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)置對照組（培養(yǎng)基不加藥，有細胞）、不同濃度的健脾益氣方含藥血清組及相對應(yīng)的空白血清組，每組設(shè)定5個復(fù)孔。細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后對實驗孔細胞進行相應(yīng)血清干預(yù)。經(jīng)12 h、24 h、48 h后，每孔分別加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），孵育4 h，小心吸棄上清，每孔再加入100 μl DMSO。酶標儀測定各孔細胞OD值（λ＝570 nm），取偏差較小的3個數(shù)值，按下列公式計算不同濃度含藥血清對細胞的增殖抑制率（IR）：抑制率（%）=［1-（實驗組OD值/對照組OD值）］×100%。

2.4Transwell侵襲實驗取無血清培養(yǎng)基按照基質(zhì)膠∶培養(yǎng)基體積比1∶4稀釋，并混勻，往Transwell上室加入稀釋后的基質(zhì)膠，每孔加入50 μl，均勻鋪平，置于培養(yǎng)箱孵育3～4 h。每個上室加入100 μl的細胞懸液（濃度2×104個/100 μl），下室加入600 μl 10%FBS培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中孵育24 h；用4%多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min；于高倍顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過小室的細胞數(shù)，取其平均值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，各均數(shù)兩兩比較采用q檢驗，以α=0.05作為檢驗水準。

3　結(jié)　果

3.1TGF-β1誘導(dǎo)SMMC-7721 EMT模型的最佳濃度和作用時間見表1、表2。

表1　TGF-β1對SMMC-7721細胞增殖能力的影響（±s，n=5）

表1　TGF-β1對SMMC-7721細胞增殖能力的影響（±s，n=5）

注：與同時間段的對照組（0 ng/ml）比較，①P<0.01，②P<0.05；與同濃度TGF-β1干預(yù)12 h比較，③P<0.01

濃度梯度（ng/ml）0 OD值12 h　24 h　48 h 0.741±0.025②　1.290±0.092③　1.617±0.122①③10　0.754±0.029②　1.171±0.096③　1.427±0.169②③20　0.606±0.049①　0.877±0.048①③　1.184±0.052③0.819±0.019　1.181±0.077　1.121±0.189 5

表2　TGF-β1對SMMC-7721細胞侵襲能力的影響（±s，n=5）

表2　TGF-β1對SMMC-7721細胞侵襲能力的影響（±s，n=5）

注：與同時間段的對照組（0 ng/ml）比較，①P<0.01；與同濃度TGF-β1干預(yù)12 h比較，②P<0.01

濃度梯度（ng/ml）0侵襲細胞數(shù)（個）12 h　24 h　48 h 95.3±3.5　113.7±3.5①②　125.3±6.8①②10　105.7±3.8　182.3±5.9①②　208.0±7.6①②20　104.0±5.6　111.0±7.9　136.3±5.5①②92.3±6.8　97.3±4.5　107.3±3.1 5

實驗結(jié)果顯示：采用不同濃度（0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml）的TGF-β1干預(yù)不同時間（12 h、24 h、48 h）后，MTT分析（表1）發(fā)現(xiàn)除0 ng/ml外，5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml的TGF-β1均有促進細胞增殖的作用，且呈時間依賴性，但增殖能力20 ng/ml<10 ng/ml<5 ng/ml，20 ng/ml的TGF-β1干預(yù)24 h與干預(yù)12 h比較有明顯的抑制作用（P<0.01）；增殖效果最明顯的為5ng/mlTGF-β1干預(yù)48h和10ng/ml TGF-β1干預(yù)48 h，此兩種濃度TGF-β1干預(yù)48 h的作用與同時間段的對照組比較有顯著性差異（P<0.05）；與同濃度TGF-β1干預(yù)12 h比較有顯著性差異（P<0.01）。Transwell分析（表2）發(fā)現(xiàn)不同濃度的TGF-β1干預(yù)SMMC-7721細胞，細胞的侵襲均呈時間依賴性；侵襲能力最明顯為10 ng/ml TGF-β1干預(yù)24 h和48 h，其細胞侵襲數(shù)目遠高于其它組別（P<0.01）。因此，TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌細胞SMMC-7721發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的最佳濃度為10 ng/ml，最佳干預(yù)時間為48 h。

圖1　對照組SMMC-7721（×400）

圖2　模型組SMMC-7721（×400）

3.2HE染色法觀察SMMC-7721 EMT模型細胞形態(tài)10 ng/ml TGF-β1干預(yù)SMMC-7721 48 h后制得EMT模型。HE染色結(jié)果顯示，對照組細胞貼壁生長良好，熒光顯微鏡下可見上皮樣形態(tài)，卵圓形、多角形或星形等不規(guī)則形態(tài)；模型組細胞數(shù)目明顯增多，細胞多呈長梭形，細胞核增大。見圖1、圖2。

3.3健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型細胞增殖的抑制效果見表3。

表3結(jié)果顯示，健脾益氣方含藥血清各濃度組OD值基本都低于同一時段同一濃度的空白血清組。健脾益氣藥對SMMC-7721 EMT細胞增殖的抑制作用隨含藥血清濃度增加而遞增，且呈時間依賴性；12 h 10%含藥血清，24 h 15%、20%、30%含藥血清，48 h 15%含藥血清濃度與相對應(yīng)濃度空白血清比較，均具有顯著性差異（P<0.01），但這些組別中以48 h 15%含藥血清濃度對細胞增殖的抑制效果最明顯。

3.4健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型細胞侵襲的抑制效果見表4。

表4結(jié)果顯示，健脾益氣方含藥血清各濃度組與對照組相比較，細胞侵襲能力均有不同程度的下降，其中10%、15%、20%、30%濃度的含藥血清均具有顯著的抑制細胞侵襲的作用（P<0.01）；而與空白血清組相比，15%、20%、30%濃度的含藥血清均具有顯著的抑制細胞侵襲的作用（P<0.01），但其中以15%濃度的含藥血清對細胞侵襲的抑制作用最明顯，它與其它含藥血清濃度組相比也具有顯著性差異（P<0.01）。

4　討　論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4-5］。SMMC-7721是一種基本無轉(zhuǎn)移、典型的上皮型人肝癌細胞株。因此我們在實驗中首先采用TGF-β1誘導(dǎo)SMMC-7721發(fā)生EMT。10 ng/ml的TGF-β1干預(yù)48 h，可使SMMC-7721發(fā)生明顯的EMT，這與文獻報道是一致的［2］。

健脾益氣方是本課題組對臨床中醫(yī)藥防治肝癌文獻分析［6］后歸納總結(jié)出來的抑癌扶正行氣活血法的亞治法拆方，對應(yīng)臨床肝癌脾氣虛弱的基本證型。方中以黃芪為君，白術(shù)、云茯苓為臣，白芍、半夏、薏苡仁、神曲為佐，意在補益正氣、健脾祛濕、散結(jié)消痞。不同濃度的健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型的增殖和侵襲均有不同程度的抑制作用，其中以15%含藥血清濃度作用48 h對細胞的抑制效果最明顯，在后續(xù)實驗中，可以此作為合適的含藥血清濃度及最佳的作用時間開展進一步的研究。

表3　健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型細胞增殖的抑制效果　?。ā纒，n=5）

表3　健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型細胞增殖的抑制效果　?。ā纒，n=5）

注：與同時間段相對應(yīng)濃度的空白血清組比較，①P<0.01

組別　　濃度抑制率（%）12 h　24 h　48 h　12 h　24 h　48 h　72 h OD值72 h對照組　　—　0.570±0.003　0.681±0.013　0.826±0.048　-　-　-　-1.172±0.300空白血清組5%　0.498±0.043　0.611±0.028　0.676±0.027　12.52　10.28　18.19　54.91 10%　0.564±0.023　0.623±0.014　0.621±0.005　0.94　8.42　24.89　51.89 15%　0.497±0.052　0.647±0.020　0.561±0.008　12.76　5.00　32.15　48.51 20%　0.458±0.045　0.587±0.009　0.504±0.046　19.54　13.76　39.01　46.54 0.528±0.012 0.564±0.004 0.603±0.017 0.626±0.043 30%　0.283±0.024　0.594±0.002　0.429±0.025　50.26　12.78　48.12　46.32 0.629±0.017含藥血清組5%　0.517±0.031　0.578±0.017　0.654±0.012　9.25　15.08　20.90　54.88 10%　0.473±0.004①　0.606±0.030　0.609±0.019　16.91　10.97　26.26　52.66 15%　0.482±0.013　0.539±0.028①　0.428±0.008①　15.33　20.86　48.20　52.12 20%　0.348±0.011　0.497±0.009①　0.368±0.033　38.91　27.03　55.47　50.90 30%　0.264±0.005　0.504±0.016①　0.300±0.041　53.66　26.00　63.70　52.29 0.529±0.013 0.555±0.019 0.561±0.039 0.575±0.019 0.559±0.002

表4　健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型細胞侵襲的抑制效果　（±s，n=5）

表4　健脾益氣方含藥血清對SMMC-7721 EMT模型細胞侵襲的抑制效果?。ā纒，n=5）

注：與對照組比較，①P<0.01；與空白血清組比較，②P<0.01；與15%含藥血清組比較，③P<0.01

細胞侵襲數(shù)390.8±6.0 385.0±4.5 384.8±4.0③377.8±7.4①③356.8±4.4①②373.0±4.0①②③366.8±5.2①②③組別　　濃度對照組　　—空白血清組　　—5% 10%含藥血清組　15% 20% 30%

參考文獻

［1］卓少元，方肇勤，管冬元，等.健脾益氣法對DEN大鼠肝癌后基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控的生物信息學(xué)分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2014，25（7）：1765-1768.

［2］Xu Z，Shen M X，Ma D Z，et al.TGF-beta1-promoted epithelial-to-mesenchymal transformation and cell adhesion contribute to TGF-beta1-enhanced cell migration in SMMC-7721 cells［J］.Cell Res，2003，13（5）：343-350.

［3］張子涵，曹波，張鈺琴，等.10種壯藥含藥血清抗人肝癌細胞的實驗研究［J］.廣西中醫(yī)藥，2015，38（2）：41-44.

［4］Arzumanyan A，Reis H M，F(xiàn)eitelson M A.Pathogenic mechanisms in HBV-and HCV-associated hepatocellular carcinoma［J］.Nat Rev Cancer，2013，13（2）：123-135.

［5］Mikulits W.Epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma［J］.Future Oncol，2009，5（8）：1169-1179.

［6］陳德溯，方肇勤.中藥治療原發(fā)性肝癌中晚期的藥味頻率分析［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2002，29（4）：187-189.

（2015－12－18收稿/編輯陳明偉）

*通信作者，E-mail：sherwin_zhuo@126.com

基金項目：廣西自然科學(xué)基金項目（編號：2014GXNSFBA118145）

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1003-0719（2016）01-0062-04