黃芪多糖對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用

王振富　楊付明

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北　恩施　445000)

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黃芪多糖對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用

王振富楊付明1

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討黃芪多糖對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法SD雄性大鼠50只，隨機分為五組(n=10)：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組(2 mg/kg)和黃芪多糖低、高劑量組(10,30 mg/kg)。采用Pulsinelli四動脈阻斷法造成全腦缺血再灌注損傷模型(CIR)。黃芪多糖組每日腹腔注射黃芪多糖，連續(xù)7 d。測定腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)以及丙二醛(MDA)的變化。結(jié)果黃芪多糖可使大鼠腦缺血再灌注腦組織中NO 含量降低、NOS 活力降低、LDH活性顯著降低以及MDA含量明顯減少(P<0.01)，SOD活性顯著增強(P<0.01)。結(jié)論黃芪多糖對大鼠全腦缺血再灌注損傷有明顯保護作用。

〔關(guān)鍵詞〕黃芪多糖；全腦缺血再灌注；自由基；抗氧化能力

黃芪為常用中藥,臨床常用于防治免疫功能紊亂性疾病、心腦血管疾病、促智、延緩衰老和抗腫瘤等多種疾病,療效確切且副作用較少〔1〕。黃芪提取物(EA)是從黃芪中提取的有效成分,主要包括黃芪總苷(AST)和黃芪多糖(APS)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，APS具有增強免疫功能、促進機體代謝、改善心功能、調(diào)節(jié)血壓、興奮造血機能、抗腫瘤、抗衰老、改善腎功能、調(diào)節(jié)血糖等多種作用〔2〕。本文探討APS對大鼠全腦缺血再灌注損傷(CIR)的保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器尼莫地平片(山東新華制藥股份有限公司)；一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)以及丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。CQ-250超聲波清洗器(北京普析通用公司)，WFZ- UV2000紫外可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)，TJ270-30A 紅外分光光度計(天津光學(xué)儀器廠) ，TGL-16G 高速臺式離心機(上海安亭儀器廠) ，RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海滬西分析儀器廠)。

1.2APS的制備參照田洛等〔3〕采用堿醇提取黃芪多糖。準(zhǔn)確稱取黃芪飲片(亳州市颯楓藥業(yè)銷售有限公司)，用5%乙醇與黃芪藥材按10∶1的量，在pH=12(碳酸鈉調(diào)節(jié))、溫度為90℃的條件下提取2 次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，濃縮沉糖。冷凍干燥保存。實驗前以純水為溶劑配制不同濃度樣品,4℃ 低溫保存,備用。

1.3實驗動物分組及處理SD雄性大鼠50只(體重250~300 g，由湖北民族學(xué)院實驗動物中心提供)，隨機分為5組(n=10)：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和APS低、高劑量組。尼莫地平組、APS低、高劑量組分別腹腔注射尼莫地平(2 mg/kg)、APS(10,30 mg/kg)，假手術(shù)組、模型組同時間給予同體積的生理鹽水注射，連續(xù)7 d，每天一次，最后一次給藥后30 min，建立急性全腦缺血再灌注模型。

1.4大鼠CIR模型〔4〕將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g/kg),頸腹部正中縱行切口，分離雙側(cè)頸總動脈，置線備用。在枕骨后第一、第二頸椎處切口，手術(shù)顯微鏡下分離暴露第一頸椎橫突翼并找到左、右橫突孔，用一直經(jīng)0.5 mm的電凝針插入橫突孔電凝兩側(cè)椎動脈。24 h后，動物清醒，拆除頸部縫合線，用帶硅膠管的動脈夾夾閉兩側(cè)頸動脈，10 min后打開動脈夾形成再灌注。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不做結(jié)扎與電凝。再灌注3 h后，斷頭處死，取腦進行生化指標(biāo)測定。

1.5檢測指標(biāo)與方法取大腦半球，在冰臺上迅速分離前腦皮質(zhì)，以冰生理鹽水沖洗后除去殘血，吸干后立即精確稱重，按質(zhì)量比1∶9加入5%三氯乙酸，高速勻漿機在冰浴下制成10%腦勻漿液，4℃保存待測。測試前保本復(fù)溶，4℃ 1 200 r/min離心10 min，取上清液測NO、NOS、SOD、LDH以及MDA等指標(biāo)，操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0軟件進行配對t檢驗。

2結(jié)果

2.1APS對大鼠NO和NOS的影響與假手術(shù)組比較，模型組NO含量和NOS活性升高(P<0.01)；與模型組比較，APS低、高劑量組NO含量和NOS活性均降低(P<0.01)。見表1。

表1　APS對大鼠NO和NOS的影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2APS對大鼠SOD、LDH以及MDA的影響與假手術(shù)組比較，模型組SOD活力降低，LDH活性升高，MAD含量有顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，APS低、高劑量組MAD含量有顯著降低，LDH活性降低而SOD活力有顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2　APS對大鼠SOD、LDH以及MDA的影響

3討論

CIR引起腦組織損傷及功能障礙，其機制尚未完全明確。目前認(rèn)為，CIR后的損傷，可能與氧自由基、NO、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎細(xì)胞浸潤，興奮性氨基酸的毒性等有關(guān)，氧自由基學(xué)說在其中占有重要地位〔5〕。NO是生物體內(nèi)一種重要活性物質(zhì)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，NO參與調(diào)節(jié)腦血流、突觸生長、遞質(zhì)釋放等生理過程，與神經(jīng)細(xì)胞損傷有密切關(guān)系。NOS可催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸，是NO合成的關(guān)鍵酶。NOS活力測定可反應(yīng)組織中NO含量變化。研究表明：NO在腦缺血再灌注損傷中具有神經(jīng)保護及神經(jīng)毒性雙重作用，在腦缺血早期，NO的產(chǎn)生具有神經(jīng)保護作用，隨著缺血時間的延長，尤其是進入再灌注期，大量產(chǎn)生的NO則具有神經(jīng)毒性作用〔6〕。另有報道：五鶴續(xù)斷醇提液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有明顯保護作用〔7〕。本實驗結(jié)果顯示：APS低、高劑量均能明顯降低大鼠腦缺血再灌注腦組織中NO含量和NOS活性，表明APS可抑制腦缺血誘導(dǎo)的NOS過度表達，從而減少NO生成，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

脂質(zhì)過氧化物是自由基作用于多種不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成呈正相關(guān)，由于機體有抗氧化作用的酶系及非酶系的保護作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除，處于動態(tài)平衡。許多病理狀態(tài)下體內(nèi)抗氧化劑不斷下降，清除自由基能力減弱，組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的堆積，脂質(zhì)過氧化作用增強，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，對細(xì)胞的多種成分有損傷作用，并引起一系列的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能破壞。它的濃度可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。SOD是一類生物體內(nèi)天然存在的氧自由基清除劑。它能催化超氧陰離子發(fā)生氣歧反應(yīng)，是機體清除氧自由基的重要金屬酶。因此，測定組織或紅細(xì)胞中SOD活力可間接反映體內(nèi)清除自由基的能力，常作為機體清除自由基能力的主要指標(biāo)。在腦組織急性缺血狀態(tài)下，腦細(xì)胞生理功能發(fā)生一系列病理改變，受損細(xì)胞釋放出LDH，有研究表明，細(xì)胞破壞越多，LDH活性越強〔8〕。本實驗結(jié)果說明APS對大鼠CIR有保護作用，其機制可能是通過提高機體抗氧化能力，抑制MDA產(chǎn)生有關(guān)。

4參考文獻

1陳聰穎,陸陽，陳澤乃.內(nèi)蒙黃芪的研究概況〔J〕.中草藥,2001；32(6):567-9.

2郭琰，魏玉苗.黃芪在腦血管疾病中的應(yīng)用研究進展〔J〕 .山西中醫(yī)，2007;23(1):72-4.

3田洛，宣依昉，范榮軍，等.醇堿提取法提取黃芪多糖〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(理學(xué)版)，2006;44(4):652-7.

4魏偉，吳希美，李元建．藥理實驗分法學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010:998-1000.

5Traystman RJ,Kirsch JR,Koehler RC.Oxygen radical mechanisms of brain injury following ischemia and reperfusion〔J〕.J Appl Physiol,1991;71(4):1185-95.

6王姿穎,魏欣冰，孫茹，等.羥乙葛根素對大鼠腦缺血再灌注損傷一氧化氮和一氧化氮合酶的影響〔J〕 .中國藥學(xué)雜志,2006;41(2)：112-4.

7譚文波，陳龍菊.五鶴續(xù)斷對局灶性腦缺血再灌注損傷各腦區(qū)一氧化氮及一氧化氮合酶的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(1):142-3.

8肖麗萍，黃益興.急性腦梗塞患者血清乳酸脫氫酶的測定及臨床意義〔J〕.腦與神經(jīng)疾病雜志，2000;8(1)：54.

〔2014-06-27修回〕

(編輯曹夢園)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1059-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.016

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局公共衛(wèi)生專項資金項目(財社〔2010〕91號)

1湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院

第一作者：王振富(1965-)，男，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究。