胱抑素C原核表達載體的構(gòu)建、表達及蛋白純化

唐紅衛(wèi)，劉一凡，孫 禪，端永艷，李 迪，李綿洋，王成彬解放軍總醫(yī)院 臨檢科，北京 0085；中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗系，湖南長沙 400；深圳康美天鴻有限公司，北京 008

血清胱抑素(cystatin C，Cys-C)是一種低分子量蛋白質(zhì)，是由122個氨基酸組成的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，是一種血漿內(nèi)源性成分，它具有穩(wěn)定和不受調(diào)節(jié)的性質(zhì)，可自由通過腎小球。Grubb等[1]于1985年首先報道其血清Cys-C水平與腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)密切相關(guān)，可作為腎小球濾過功能的指標(biāo)，對早期腎病的檢測有重要意義。目前常用的檢測Cys-C的方法有：單向免疫擴散法(radial immmene diffusion，RID)、酶免疫測定法(enzymeimmunoassay，EIA)、放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)、乳膠顆粒增強免疫比濁法(particle enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA)、時間分辨熒光免疫法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)、顆粒增強散射免疫比濁法(particle-enhanced nephelometric immunoassay，PENIA)等。而PENIA法因其自動化程度較高，靈敏度可達150 μg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)底低于健康人的下限，而成為臨床檢測Cys-C的最常用方法[2]。但目前國內(nèi)常用的胱抑素C監(jiān)測試劑盒均為進口試劑盒，價格昂貴，影響其在國內(nèi)的推廣應(yīng)用。本實驗利用pET表達系統(tǒng)，在大腸埃希菌中表達Cys-C，并進行純化，為進一步制備抗體，制備研發(fā)測Cys-C試劑盒奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要材料 大腸埃希菌Rosetta、載體pET-30a(+)購自上海諾力有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Bioflux公司；載體測序和引物合成均由Invitrogen公司完成；HEK293細(xì)胞株購自北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA連接酶、Trizol試劑購自TAKARA公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；蛋白Marker購自Fermentas公司；鎳離子親和層析柱(Ni2+-NTA agarose)購自Qiagen公司；羊抗人Cys-C蛋白抗體購自 Santa Cruz公司；兔抗羊IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素均購自北京鼎國生物公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 寡核苷酸引物設(shè)計與合成 遵循PCR引物設(shè)計的原則，根據(jù)GeneBank(NM-000099.2)報道的Cys-C的cDNA序列，設(shè)計編碼Cys-C基因片段5'和3'端寡核苷酸引物，并在各自5'末端分別引入BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點5'和3'端引物序列：5'端引物，5'-CGGGATCCGGCTCCAGTCCT GGCAAG-3'；3'端引物，5'-CCCAAGCTTTTAGGC GTCCTGACAGGTGGATT-3'，以上引物由Invitrogen公司完成合成。

3 RT-PCR擴增及測序 Trizol法從HEK293細(xì)胞株提取mRNA，1%瓊脂糖凝膠電泳測RNA純度，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，并以此為模板RT-PCR得到Cys-C基因雙鏈DNA。PCR參數(shù)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變形40 s；57 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并最終獲得重組載體pET-30a(+)-CysC體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta，經(jīng)過蛋白篩選，酶切、 PCR鑒定初篩陽性克隆菌株?；驕y序由Invitrogen公司完成。

4 Cys-C陽性克隆菌株的誘導(dǎo)表達 陽性克隆菌接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L卡那霉素)，37 ℃，200 r/min搖蕩過夜。次日取2 ml菌液接種于600 ml液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L卡那霉素)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)4 h左右，至OD值A(chǔ)600為0.6 ~ 0.8。添加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalac-topyranoside，IPTG)(0.1 mm)，16 ℃，100 r/min培養(yǎng)17~18 h。將培養(yǎng)基4 ℃，5 000 r/min離心10 min，收集菌體。取部分菌加入裂解液(pH 8.0 Tris-Hcl 20 mmol/L)，取上清，超生破碎取蛋白，13 000 r/min，10 min。將沉淀物再進行裂解懸浮，超生破碎。分別取上清和沉淀加入5×SDS緩沖液中，SDS-PAGE電泳顯示表達的Cys-C多數(shù)存在于沉淀中。

5 Cys-C的提取及純化 誘導(dǎo)600 ml陽性表達菌液，離心收集菌體沉淀，加入Tris-NaCl緩沖液A(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH=8.0)，超聲裂解菌體(冰水混合物，180 W，30 min)。4 ℃、12 500 r/min，取上清，溶液過濾器抽濾，通過AKTA purifier 10/100系統(tǒng)，運用鎳柱親和層析法純化Cys-C。收集原液、流出液、10%、20%、30%、60%、100%B(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH = 8.0)洗脫液，SDS-PAGE電泳，得到蛋白純化圖。

6 Cys-C的ELISA評價 微孔板每孔包埋純化所得Cys-C蛋白1 μg，陰性對照包被HP天然抗原。將羊抗人Cys-C單抗按1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000、1∶160 000、1∶320 000、1∶640 000、1∶1 280 000、1∶5 120 000、1∶10 240 000、1∶20 480 000、1∶40 960 000、1∶81 920 000稀釋，37 ℃孵育2 h，洗板。加兔抗羊IgG，37 ℃孵育2 h，洗板。加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的親和素，37 ℃2 h，充分洗滌后加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色鑒定表達產(chǎn)物。

7 Cys-C表達量的檢測 純化后洗脫液經(jīng)SDSPAGE電泳圖像分析相對含量。取純化后Cys-C紫外分光光度計測OD值，計算所得Cys-C濃度為40 μg/ml。

結(jié) 果

1 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性 Trizol法提取的RNA，在進行PCR擴增前預(yù)先經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性。結(jié)果顯示RNA有明顯的3條帶即5S、18S和28S，表明RNA提取成功。由圖還可以看出18S和28S條帶較亮、5S條帶亮度較淺，RNA無明顯拖帶，說明RNA沒被降解，完整性較好。見圖1。

2 Cys-C基因表達的測定 PCR擴增結(jié)果由圖2A可知目的條帶＜400 bp，根據(jù)引物預(yù)期條帶的大小為378 bp，擴增與預(yù)期結(jié)果一致，測序結(jié)果顯示與GeneBank(NM-000099.2)100%同源。

3 重組載體的菌株的酶切鑒定 選取兩個克隆菌株進行酶切鑒定，目的條帶及載體條帶均與預(yù)期一致。下面亮度較弱的條帶意味著基因與載體相連接，因較多的Cys-C與載體相結(jié)合，所以目的條帶亮度較弱。見圖2B。

4 Cys-C原核表達SDS-PAGE電泳分析 將含有重組載體pET-30a(+)-CysC的大腸埃希菌Rosetta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，進行裂解，超聲破碎后SDS-PAGE電泳，見圖3。由電泳圖可知，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希菌未能產(chǎn)生Cys-C；IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希菌的上清液和沉淀中均含有較多Cys-C，沉淀中Cys-C較多而純；Cys-C相當(dāng)分子質(zhì)量約為20 000 bp。

5 鎳柱親和層析法純化目的蛋白 鎳柱親和層析法純化Cys-C，原液與流出液相比，胱抑素含量明顯減低；10%B洗脫可洗掉大部分雜質(zhì)，且只有小部分胱抑素被洗掉；20%B可得到較多的胱抑素，但仍含有少量雜質(zhì)；30%B洗脫既可得到較純凈的胱抑素；60%B洗脫所得胱抑素更為純凈，但含量較30%B明顯減少。收集30%B、60%B洗脫液進行下一步處理。見圖4。

6 Cys-C的ELISA評價 為證實所純化的蛋白為Cys-C，用羊抗人Cys-C單克隆抗體進行ELISA分析。所純化蛋白可以與羊抗人Cys-C單克隆抗體特異性結(jié)合，從而證明所純化蛋白為Cys-C。見表1。

表1 ELISA分析結(jié)果Tab. 1 ELISA of Cys-C

討 論

長期以來，血清肌酐、尿素N、尿酸等是反應(yīng)腎小球濾過率的常用指標(biāo)。血清尿素氮首先被作為腎功能的評價指標(biāo)，但其不符合內(nèi)源性濾過功能的標(biāo)記物要求，只有當(dāng)GFR減少到正常值的40%時，尿素氮才開始升高，且易受到內(nèi)源性和外源性蛋白物質(zhì)的影響；血清肌酐作為目前國內(nèi)仍使用的評價腎小球功能的指標(biāo)，其只有當(dāng)腎小球濾過功能減小至正常的1/3以上時才會增加，且易受環(huán)境因素的影響。因此肌酐、尿素氮都不能作為腎小球功能的理想指標(biāo)[3]。胱抑素(cystatin C，Cys-C)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)中的一種，它由管家基因編碼，能在所有的有核細(xì)胞內(nèi)以恒定的速度持續(xù)轉(zhuǎn)錄和表達，無組織特異性，故Cys-C可在體內(nèi)以恒定速度產(chǎn)生，并存在于各種體液之中，尤以腦脊液和精漿中含量為高，尿液中最低[3]，不受年齡、性別、體重、炎癥等因素影響。其分子量小(13 kU)，生理條件下帶正電荷，能自由通過腎小球，并可被腎小管上皮細(xì)胞完全重吸收，不重新回到血液中[4]；同時腎小管上皮細(xì)胞也不分泌Cys-C至管腔內(nèi)，其在評估腎小球功能方面可以取代傳統(tǒng)的GFR檢測[5-6]。因此，Cys-C成為反應(yīng)腎小球濾過率的理想指標(biāo)[7-12]。

目前檢測Cys-C常用的生化檢測方法主要是免疫濁度法，其首要條件是Cys-C蛋白抗原的制備與純化。本實驗采用Trizol法從大腸埃希菌Rosetta gamiB(DE3)(DE3)中通過RT-PCR獲得mRNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析知RNA的完整性較好，且沒有蛋白污染。大腸埃希菌Rosetta gamiB(DE3)菌株含有trxB和gor雙突變基因，能促進二硫鍵的形成。研究表明，含有雙突變基因的菌株比單獨含有trxB的菌株更容易促進二硫鍵的形成，提高重組蛋白的活性[13]。相同的表達水平，gamiB(DE3)菌株所表達的活性蛋白是其他菌株的10倍以上[14]。Rosetta gamiB(DE3)菌株含有T7RNA聚合酶基因，誘導(dǎo)產(chǎn)生的T7RNA聚合酶合成RNA的效率是其他大腸埃希菌聚合酶的許多倍[15]。另外該菌株缺乏外源性蛋白的lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，可減少純化過程中外源蛋白的降解。且該菌株還含有l(wèi)ac透性酶突變基因，可使IPTG均一性進入所有細(xì)菌中，提高IPTG的誘導(dǎo)效率，增加重組的Cys-C的表達。而且我們比較了其他菌株的誘導(dǎo)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Rosetta gamiB(DE3)菌株生成包涵體較少，從而有利于重組的Cys-C的獲取。載體pET-30a(+)含有5'-his標(biāo)簽/凝血酶/S.Tag/ enterokinase，以及3'-his標(biāo)簽。pET-30a(+)在輔助噬菌體的幫助下可以產(chǎn)生包含克隆基因單個DNA鏈的粒子，從而在T7終止引物的作用下實現(xiàn)單鏈轉(zhuǎn)錄。另外pET-30a(+)本身含有his標(biāo)簽，可以與金屬螯合物(如鎳離子等)結(jié)合，從而利于重組蛋白的純化。經(jīng)PCR、酶切且測序準(zhǔn)確獲得重組載體pET-30a(+)-CysC，其與genebank(NM-000099.2)所報道的胱抑素C基因系列達到100%的同源性，基因序列的完全同源確保了誘導(dǎo)蛋白的準(zhǔn)確性。本實驗研究表明，重組的Cys-C主要以可溶性和非可溶性兩種形式存在，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸埃希菌基本不表達Cys-C。重組Cys-C主要以可溶性蛋白形式存在于大腸埃希菌中，菌體經(jīng)超聲破碎后，得到重組的Cys-C，再經(jīng)鎳柱親和層析即可得到純凈的Cys-C，NC膜透析，濃縮純化，制備純的Cys-C蛋白。電泳分析結(jié)果表明，目的蛋白分子質(zhì)量約為20 000，相對含量約為20%；ELISA結(jié)果表明，所得蛋白可與胱抑素單克隆抗體呈特異性反應(yīng)，表面所得蛋白為Cys-C。

以上實驗結(jié)果表明，本次構(gòu)建的胱抑素C表達系統(tǒng)是成功的，從基因的提取、克隆、表達和純化都比較簡單，為今后制備Cys-C抗體，或?qū)嶒炇译滓炙匦?zhǔn)品奠定基礎(chǔ)。

1 Grubb A， Simonsen O， Sturfelt G， et al. Serum concentration of cystatin C， factor D and beta 2-microglobulin as a measure of glomerular filtration rate［J］. Acta Med Scand， 1985，218（5）：499-503.

2 張淑蘭，王銘超，李青果，等．胱抑素C的臨床應(yīng)用及進展［J］.國外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，2002，23（5）：271-272．

3 Tsigou E， Psallida V， Demponeras C， et al. Role of new biomarkers：functional and structural damage［J］. Crit Care Res Pract， 2013：361078.

4 G?kku?u CA， Ozden TA， Gül H， et al. Relationship between plasma Cystatin C and creatinine in chronic renal diseases and Txtransplant patients［J］. Clin Biochem， 2004， 37（2）： 94-97.

5 Dharnidharka VR， Kwon C， Stevens G. Serum cystatin C is superior to serum creatinine as a marker of kidney function： a meta-analysis［J］. Am J Kidney Dis， 2002， 40（2）：221-226.

6 Macisaac RJ， Tsalamandris C， Thomas MC， et al. Estimating glomerular filtration rate in diabetes： a comparison of cystatin-C-and creatinine-based methods［J］. Diabetologia， 2006， 49（7）：1686-1689.

7 李海霞，張春麗，徐國賓，等. 健康人群血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與肌酐分布及其評價慢性腎臟病患者腎小球濾過功能的比較研究［J］. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006， 29（11）：970-974.

8 蔡文慧. 血清胱抑素C濃度在Ⅱ型糖尿病腎病早期診斷中的臨床價值［J］. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（4）：255-256.

9 樓小偉，董芳．血清胱抑素C在2型糖尿病腎病早期診斷中的臨床應(yīng)用評價［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，17（7）：2-3．

10 王惠琴．血清胱抑素C在腎功能評價中的應(yīng)用［J］．臨床合理用藥雜志，2010，3（6）：33-33．

11 徐玲玲，姚剛. 胱抑素C評估慢性腎臟病的應(yīng)用研究［J］. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，31（18）：2912-2912.

12 雷光文，衡愛萍. 血清CysC在早期DN中的診斷價值［J］. 放射免疫學(xué)雜志，2010，23（4）：442-443.

13 Bessette PH， Aslund F， Beckwith J， et al. Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm［J］.Proc Natl Acad Sci U S A， 1999， 96（24）： 13703-13708.

14 Prinz WA， Aslund F， Holmgren A， et al. The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm［J］. J Biol Chem， 1997， 272（25）：15661-15667.

15 梁國棟. 最新分子生物學(xué)實驗技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003．