微重力對成骨細胞的周期及分化過程的影響

李亞龍，李東韜,2 綜述 張 舒 審校

1第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天生物動力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，陜西西安 710032；2海軍總醫(yī)院 心臟中心，北京 100048

隨著我國航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，航天飛行環(huán)境對人體的影響日益受到國人重視。長期航天飛行會導(dǎo)致航天員的多個生理系統(tǒng)發(fā)生改變，其中最顯著的變化之一就是航天微重力環(huán)境所導(dǎo)致的失重性骨質(zhì)丟失，表現(xiàn)為人體承重骨的骨密度降低、骨質(zhì)丟失和生物力學(xué)性能下降[1]。失重性骨質(zhì)丟失的發(fā)生應(yīng)從骨形成和骨吸收這兩方面來考慮，骨組織代謝中成骨細胞促進骨形成，而破骨細胞促進骨吸收。目前的航天飛行及地面實驗研究認為骨形成受到抑制是失重性骨質(zhì)丟失的主要原因，微重力條件下成骨細胞可表現(xiàn)出數(shù)量減少、功能抑制和活性降低等變化[2]。鑒于成骨細胞的周期變化及分化功能在骨形成中具有至關(guān)重要的作用，因此微重力對成骨細胞這兩方面的影響也已成為探討失重性骨質(zhì)丟失細胞學(xué)機制的熱點問題。

1 微重力對細胞周期的影響

1.1 細胞周期的變化 張曉鈾等[3]利用回轉(zhuǎn)器對人成骨樣細胞的細胞周期變化進行研究，證實模擬失重組的細胞增殖始終低于正常對照組。研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重6 h后，G1期細胞較對照組顯著增多，而S期與G2+M期細胞較對照組顯著減少。隨著作用時間的增加，對照組G1期細胞呈持續(xù)下降趨勢，而模擬失重組G1期細胞的變化趨勢不是很明顯，始終顯著高于對照組，而S期與G2+M期細胞一直顯著低于對照組。張曉鈾等提出，微重力條件下，成骨細胞的周期轉(zhuǎn)化受到抑制，部分細胞停滯在G1期，延遲了向S期的轉(zhuǎn)化，使得S期的細胞數(shù)目顯著下降，并進一步導(dǎo)致細胞延遲進入G2+M期，具體表現(xiàn)為細胞的增殖受到了抑制，成骨細胞數(shù)目減少，這可能是造成失重性骨質(zhì)丟失的一個重要原因。張曉鈾等的實驗中還發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象： 數(shù)據(jù)分析表明，在模擬失重作用6 h后，再經(jīng)12 h的正常重力條件恢復(fù)生長，細胞周期中G1與S期仍保持模擬失重效應(yīng)，表現(xiàn)為G1期細胞多于對照組，S期細胞少于對照組，而G2+M期已恢復(fù)至對照水平；在模擬失重作用12 h后，再經(jīng)12 h的正常重力條件恢復(fù)生長，細胞周期各時相基本恢復(fù)至對照水平；但當(dāng)模擬失重作用更長時間后，經(jīng)12 h的正常重力條件恢復(fù)生長，細胞周期仍保持模擬失重效應(yīng)[3]。這說明成骨細胞對微重力的影響可進行有限的代償，且這種代償與微重力的作用時間有關(guān)，但微重力條件下成骨細胞的周期變化機制尚不明確。

1.2 細胞周期變化的機制 Plett等[4]在模擬微重力條件下進行人造血祖細胞培養(yǎng)，用BRDU標記細胞，然后用流式細胞儀全程監(jiān)控細胞周期，得到了與張曉鈾實驗相似的周期變化結(jié)果。對細胞周期變化機制的進一步研究發(fā)現(xiàn)，在細胞分裂的過程中細胞周期蛋白D和E以及細胞周期分裂早期的重要分子在微重力條件下都沒有改變，而只有細胞周期蛋白A和B在S期和G2+M期的細胞中表達顯著降低，從而影響到細胞周期的正常變化，Plett等[4]提出這可能是微重力導(dǎo)致細胞周期變化的的主要機制。研究證實也存在其他機制，Dai等[5]的實驗發(fā)現(xiàn)成骨細胞的周期進程與細胞骨架密切相關(guān)，而細胞骨架對重力環(huán)境變化敏感。在微重力條件下，與肌動蛋白骨架相關(guān)的多種基因表達均下調(diào)，有可能影響細胞周期的變化。胰島素樣生長因子、表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子三種重要的生長因子在微重力條件下的表達也顯著下降，可致使細胞周期的進程阻滯[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細胞代謝和細胞周期密切相關(guān)，代謝障礙或能量不足將會抑制細胞周期的正常進行[7]。在微重力情況下，成骨細胞的代謝受到抑制，這提示成骨細胞的細胞周期變化可能與代謝調(diào)控變化有關(guān)[8]。有學(xué)者認為，周期蛋白依賴性蛋白激酶和有絲分裂調(diào)控子等重要的細胞周期調(diào)控因素在哺乳動物細胞的代謝調(diào)控中具有重要作用，這些因素在重力變化調(diào)控成骨細胞細胞周期中的作用值得進一步探討[9]。

1.3 細胞周期的阻滯點 目前的研究對于細胞在微重力條件下周期的阻滯點尚未得出一致結(jié)論。有研究認為成骨細胞的周期阻滯在G0/G1期，張曉鈾等發(fā)現(xiàn)人成骨樣細胞OS-732在模擬失重環(huán)境下細胞周期阻滯在G0/G1期； 其他類型細胞，如人造血祖細胞和胃癌SGC-7901細胞在模擬失重環(huán)境下也阻滯在G0/G1期[4,10]。但是也有研究認為成骨細胞的周期阻滯在S期，王攀等[11]的研究發(fā)現(xiàn)人成骨樣細胞MG-63的周期阻滯在S期，細胞向G2期轉(zhuǎn)化減少，G1期細胞不斷向S期轉(zhuǎn)化導(dǎo)致S期細胞增多而G1期細胞減少。孟芮等[12]的研究也提出了類似的見解。他們研究了三維隨機回轉(zhuǎn)器模擬失重培養(yǎng)的骨細胞條件培養(yǎng)基對成骨細胞周期的影響，結(jié)果表明，骨細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)MC3T3-E1細胞24 h、48 h和72 h后，均出現(xiàn)了細胞周期阻滯現(xiàn)象，S期細胞比例增多。他們推測骨細胞可能通過某種可溶性因子調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖及周期，而周期的調(diào)控點可能就在S期。

2 微重力對成骨細胞分化的影響

2.1 成骨細胞的分化過程 成骨細胞的分化過程非常復(fù)雜： 骨髓中的間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在核基因的調(diào)控下定向分化成為骨祖細胞，骨祖細胞在向骨面附著的過程中，逐漸演化成為前成骨細胞； 前成骨細胞可以合成和分泌膠原基質(zhì)，并能發(fā)育為成骨細胞。雖然此時的成骨細胞具有較強的增殖和分化能力，但它還需要經(jīng)歷增殖和細胞外基質(zhì)的成熟礦化等幾個階段達到成熟狀態(tài)。研究證實，骨骼構(gòu)建和重塑的最基本調(diào)控因素就是骨骼受到的外界應(yīng)力作用[13]。在航天飛行中重力消失，肢體不需要對抗重力做功，肌肉和骨骼的作用減少，肌肉出現(xiàn)萎縮，肌力也顯著下降。微重力和肌力下降導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)中承重骨的受力顯著減少，進而影響成骨細胞的分化與骨骼的重建[14]。

2.2 微重力下BMSCs向前成骨細胞分化減弱 大量研究已證實，微重力條件下BMSCs的增殖受到了抑制，BMSCs向前成骨細胞分化的能力減弱，而增加了脂向分化的比例[15-16]。Meyers等[15]將BMSCs在模擬失重環(huán)境下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 h后細胞的F-肌動蛋白應(yīng)力纖維出現(xiàn)斷裂，培養(yǎng)7 d后F-肌動蛋白應(yīng)力纖維完全消失，而G-肌動蛋白顯著增加，并且細胞內(nèi)的脂含量增加了310%。此外，模擬失重7 d后，小GTP酶家族Rho中成員RhoA的活性和cofilin的磷酸化顯著降低。將活性RhoA轉(zhuǎn)染入細胞后，模擬失重條件下的應(yīng)力纖維變化被逆轉(zhuǎn)，且Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶和特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2等成骨相關(guān)基因的表達顯著增加，而瘦素和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4等成脂相關(guān)基因的表達受到抑制，該研究認為模擬失重時RhoA活性受到抑制可能是BMSCs向成骨細胞分化下降和脂向分化增加的作用機制。Dai等[5]的研究發(fā)現(xiàn)BMSCs向成骨細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1在模擬失重條件下表達明顯減少，這也可能是BMSCs向成骨細胞分化下降的重要機制。

2.3 前成骨細胞向成骨細胞骨細胞分化減弱 前成骨細胞向成骨細胞分化過程中受到多方面因素的影響，其中較為重要的影響因素就是機械應(yīng)力刺激。因此在微重力條件下，由于應(yīng)力刺激作用的減少，前成骨細胞的分化和增殖能力均顯著下降，進而導(dǎo)致成骨細胞數(shù)量下降，骨形成減少。Collet等[17-18]的研究中測定了航天飛行對Ⅳ型膠原前膠原碳端肽原、堿性磷酸酶和骨鈣素分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)航天飛行20~30 d后這三種骨形成標記物均出現(xiàn)濃度下降，提示微重力下成骨細胞形成減少或者成骨細胞功能下降可能是導(dǎo)致骨形成下降的主要原因。付崇建等[19]研究了尾吊大鼠中骨質(zhì)和骨髓內(nèi)骨形成蛋白-2的變化，發(fā)現(xiàn)尾吊組大鼠骨質(zhì)和骨髓內(nèi)BMP2的表達明顯弱于對照組，尾吊28 d大鼠的BMP2表達顯著低于尾吊14 d大鼠，結(jié)果表明大鼠后肢去負荷可以導(dǎo)致骨和骨髓BMP2含量的降低。航天飛行中的細胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過誘導(dǎo)的MG-63人源成骨樣細胞在微重力的條件下，Ⅰ型膠原α1鏈、堿性磷酸酶及骨鈣素的基因表達水平均受到了不良影響，提示微重力對前成骨細胞的抑制作用[20]。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，微重力的條件下，成骨細胞的細胞周期和細胞分化過程均受到了不良影響，使得具有成骨功能的細胞數(shù)量減少，從而造成了航天飛行時的骨質(zhì)丟失現(xiàn)象。目前，微重力對成骨細胞功能影響的調(diào)控機制尚未得到闡明。研究微重力對成骨細胞功能的調(diào)控機制，將有助于維護航天員在航天飛行中的健康，并有可能提供對抗骨質(zhì)丟失的分子靶點，進而開發(fā)有效藥物和對抗措施，為解決其他骨科疾病如骨質(zhì)疏松癥等提供更多的治療策略和方法。

1 Nagaraja MP， Risin D. The current state of bone loss research： data from spaceflight and microgravity simulators［J］. J Cell Biochem，2013， 114（5）： 1001-1008.

2 Makihira S， Kawahara Y， Yuge L， et al. Impact of the microgravity environment in a 3-dimensional clinostat on osteoblast- and osteoclast-like cells［J］. Cell Biol Int， 2008， 32（9）： 1176-1181.

3 張曉鈾，汪恭質(zhì)，丁柏. 模擬失重對成骨樣細胞細胞周期變化的影響［J］. 中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2000， 11（1）：43-45.

4 Plett PA， Abonour R， Frankovitz SM， et al. Impact of modeled microgravity on migration， differentiation， and cell cycle control of primitive human hematopoietic progenitor cells［J］. Exp Hematol，2004， 32（8）： 773-781.

5 Dai ZQ， Wang R， Ling SK， et al. Simulated microgravity inhibits the proliferation and osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal stem cells［J］. Cell Prolif， 2007， 40（5）： 671-684.

6 Koch H， Jadlowiec JA， Campbell PG. Insulin-like growth factor-I induces early osteoblast gene expression in human mesenchymal stem cells［J］. Stem Cells Dev， 2005， 14（6）： 621-631.

7 Cai L， Tu BP. Driving the cell cycle through metabolism［J］. Annu Rev Cell Dev Biol， 2012， 28：59-87.

8 Nabavi N， Khandani A， Camirand A， et al. Effects of microgravity on osteoclast bone resorption and osteoblast cytoskeletal organization and adhesion［J］. Bone， 2011， 49（5）： 965-974.

9 Malumbres M. Physiological relevance of cell cycle kinases［J］.Physiol Rev， 2011， 91（3）： 973-1007.

10 朱鳴，吳本儼，聶捷琳，等．回轉(zhuǎn)器模擬失重對人胃癌SGC-7901細胞形態(tài)和生物學(xué)特征的影響［J］.中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2005，16（4）：262-266．

11 王攀，張舒，王冰，等．模擬失重對MG-63細胞形態(tài)、增殖及周期的影響［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2007，20（6）：406-409．

12 孟芮，續(xù)惠云，王哲，等．模擬失重骨細胞條件培養(yǎng)基對成骨細胞活性的影響［J］. 航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2009，22（4）：247-251．

13 Huiskes R， Ruimerman R， van Lenthe GH， et al. Effects of mechanical forces on maintenance and adaptation of form in trabecular bone［J］. Nature， 2000， 405（6787）： 704-706.

14 戴鐘銓，李瑩輝，萬玉民，等．微重力對成骨細胞及其分化過程的影響［J］.中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2005，16（2）：148-151．

15 Meyers VE， Zayzafoon M， Douglas JT， et al. RhoA and cytoskeletal disruption mediate reduced osteoblastogenesis and enhanced adipogenesis of human mesenchymal stem cells in modeled microgravity［J］. J Bone Miner Res， 2005， 20（10）： 1858-1866.

16 Zayzafoon M， Gathings WE， McDonald JM. Modeled microgravity inhibits osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells and increases adipogenesis［J］. Endocrinology， 2004， 145（5）：2421-2432.

17 Collet P， Uebelhart D， Vico L， et al. Effects of 1- and 6-month spaceflight on bone mass and biochemistry in two humans［J］.Bone， 1997， 20（6）： 547-551.

18 Caillot-Augusseau A， Vico L， Heer M， et al. Space flight is associated with rapid decreases of undercarboxylated osteocalcin and increases of markers of bone resorption without changes in their circadian variation： observations in two cosmonauts［J］. Clin Chem， 2000， 46（8 Pt 1）： 1136-1143.

19 付崇建，楊連甲，曹新生，等．模擬失重下大鼠骨和骨髓中人重組骨形成蛋白-2的變化［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2001，14（4）：295-297．

20 Carmeliet G， Nys G， Bouillon R. Microgravity reduces the differentiation of human osteoblastic MG-63 cells［J］. J Bone Miner Res， 1997， 12（5）： 786-794.