凹葉景天總黃酮止血和耐缺氧作用研究

常 征，王 蓉，李洪潮，劉 偉，張 鐵，沈清清，李付惠

（1. 文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2. 云南省高校特色植物開發(fā)利用工程研究中心，云南 文山 663099）

凹葉景天總黃酮止血和耐缺氧作用研究

常 征1,2，王 蓉1,2，李洪潮1,2，劉 偉1,2，張 鐵1,2，沈清清1,2，李付惠1,2

（1. 文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099；2. 云南省高校特色植物開發(fā)利用工程研究中心，云南 文山 663099）

用乙醇提取方法獲取凹葉景天總黃酮。采用灌胃給藥的方法，給予不同劑量凹葉景天總黃酮，連續(xù)觀察 14 d，檢測藥物對小鼠的急性毒性作用。檢測不同劑量凹葉景天總黃酮對小鼠出血凝血時間及對常溫常壓缺氧、亞硝酸鈉中毒缺氧和急性腦缺血小鼠存活時間的影響。研究表明，凹葉景天總黃酮明顯縮短小鼠出血和凝血時間，延長缺氧小鼠的存活時間，凹葉景天總黃酮具有止血和耐缺氧作用。

凹葉景天；止血；耐缺氧；急性毒性；最大耐受量

凹葉景天為景天科景天屬植物凹葉景天Sedum emarginatum Migo 的全草，性涼、味苦酸，歸心、肝、大腸經(jīng)，具有消臃腫，利濕熱，利水和血，痔漏作用，可用于治蛇咬傷，疔疽，便毒，風(fēng)痹，黃疸，汗斑[1]。民間常以本品鮮品搗爛以菜油浸泡外擦，治瘡癤、無名腫痛，內(nèi)服用于吐血、便血、月經(jīng)過多等，為土家族常用植物藥[2-3]。黃酮具有多種生物活性，是許多藥用植物的有效成分，藥理作用主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎、鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)免疫等作用[4]。目前未見凹葉景天中黃酮的鎮(zhèn)靜催眠、止血和耐缺氧作用相關(guān)報道。本文初步探索凹葉景天總黃酮的鎮(zhèn)靜催眠、止血和耐缺氧作用，為進(jìn)一步開發(fā)利用凹葉景天提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗儀器和試劑

101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、HH.B11.420型恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一場）、JA2003電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、HZ—D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（河南省豫華儀器有限公司）、W201D恒溫水浴鍋（上海申順生物科技有限公司）、R—201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）、單相電容運(yùn)轉(zhuǎn)電動機(jī)（上海申順生物科技有限公司）。

凹葉景天購于文山市小西門中藥街，經(jīng)文山學(xué)院沐建華高級實驗師鑒定為景天科景天屬植物凹葉景天。亞硝酸鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）、鈉石灰（A型，上海五四化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2 g，購于昆明醫(yī)學(xué)院動物試驗中心，合格證號：滇實動證第2014017號。動物按性別分籠飼養(yǎng)。實驗期間，室溫控制在22±2 ℃，濕度控制在55±5%，12 h/12 h光暗交替照明，自由進(jìn)食飲水。本實驗所有研究均遵循國家實驗動物委員會相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 供試樣品的制備

取凹葉景天全草干燥切斷、粉碎，用70%乙醇在90 ℃條件下浸提2次，每次1 h，合并濾液，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，將所得浸膏用蒸餾水配制成濃度（以生藥量計）為3000 mg/mL的溶液，即為凹葉景天總黃酮，置于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆肹5]。

2.2 急性毒性試驗研究

參照經(jīng)典的急性毒性試驗方法，進(jìn)行凹葉景天醇提物的急性毒性試驗[6]。

2.2.1 半數(shù)致死量試驗

昆明種小鼠在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成4組：空白對照組、凹葉景天醇提物組（600、6000、60000 mg/kg），每組4只，雌雄各半。給藥前禁食12 h，不禁水。凹葉景天醇提物組按20 mL/kg體重灌胃給藥1次，空白對照組灌胃等體積的蒸餾水，進(jìn)行半數(shù)致死量（LD50）值的測定。14 d內(nèi)無小鼠死亡，無法計算LD50，故進(jìn)行最大耐受量（MTD）實驗。

2.2.2 最大耐受量實驗

昆明種小鼠在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分成2組，分別為空白對照組和凹葉景天醇提物組，每組10只，雌雄各半。凹葉景天醇提物組小鼠以生藥量3000 mg/mL（最高濃度），20 mL/kg灌胃凹葉景天醇提物，24 h內(nèi)給藥1次；空白對照組給以等體積蒸餾水。給藥后觀察小鼠的行為活動，如精神狀態(tài)、被毛的變化、攝食飲水是否正常、呼吸、糞便是否有異樣、眼、鼻、口腔有無異常分泌物及死亡等情況，連續(xù)觀察14 d，每天早晚各1次，記錄累積死亡數(shù)及小鼠體重變化。死亡動物即刻進(jìn)行尸檢，肉眼觀察其主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）的變化。

2.3 對小鼠止血凝血時間的影響

2.3.1 出血時間測定

昆明種小鼠在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為5組：空白對照組（生理鹽水）、云南白藥組（65 mg/kg，陽性對照）、凹葉景天總黃酮343.68、171.84和85.92 mg/kg三個劑量組，每組10只，雌雄各半?？瞻讓φ战M灌胃給予生理鹽水；云南白藥組灌胃給予云南白藥溶液；凹葉景天高、中、低劑量組分別灌胃給予凹葉景天乙醇提取液，給藥量為20 mL/kg，連續(xù)6 d。第6天給藥1 h后，用利剪于小鼠尾尖1～3 cm處橫斷，待血液自然流出后計時， 每隔15 s 用濾紙吸去血滴1次， 直至血液自然停止， 記錄并計算出血時間[7-8]。

2.3.2 凝血時間測定

小鼠分組及給藥同2.3.1。于第6天給藥1 h后，用內(nèi)徑為1 mm的玻璃毛細(xì)管插入小鼠內(nèi)眥后靜脈叢取血，血液至毛細(xì)管4～5 cm為止。每隔30 s折斷毛細(xì)玻管的一小段，檢查有無出現(xiàn)血凝絲。從毛細(xì)玻管內(nèi)眥采血到血液到出現(xiàn)血凝絲的時間，即為凝血時間。

2.4 耐缺氧試驗

2.4.1 常溫常壓耐缺氧實驗

昆明種小鼠在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為4組：模型組、凹葉景天提取物343.68、171.84和85.92 mg/kg 3個劑量組，每組10只。模型組給予蒸餾水，凹葉景天高、中、低劑量組分別灌胃給予凹葉景天總黃酮，每天1次，連續(xù)灌胃14 d，灌胃量20 mL/kg。

于末次給藥1 h后，將各組小鼠分別放入的250 mL磨口瓶內(nèi)(每瓶1只)， 瓶內(nèi)盛有10 g鈉石灰以吸收二氧化碳和水，在瓶口處均勻涂上凡士林密封。觀察并記錄小鼠存活時間。

2.4.2 亞硝酸鈉中毒耐缺氧存活實驗

小鼠分組及給藥同2.4.1，于末次給藥1 h后，各組動物按2.5 mg/kg體重劑量腹腔逐只注射亞硝酸鈉，腹腔注射體積為10 mL/kg，注射后立即用秒表記錄觀察動物存活時間。

2.4.3 急性腦缺血性耐缺氧實驗

小鼠分組及給藥同2.4.1，于末次給藥1 h后，各組動物自頸部逐只用頸椎脫臼法斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止的時間[9]。

2.5 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析， 結(jié)果用Mean ± SD表示。選用One-way ANOVA結(jié)合Post-Hoc（LSD法）方法進(jìn)行組間差異分析。以P值小于0.05表示統(tǒng)計學(xué)差異顯著性。

3 試驗結(jié)果

3.1 最大耐受量試驗

以凹葉景天總黃酮的最高混懸濃度（以生藥量計）3000 mg/mL和給藥量20 mL/kg進(jìn)行灌胃給藥1次后連續(xù)觀察14 d。給藥當(dāng)天大部分小鼠出現(xiàn)自主活動減少、懶動、不活躍、有的甚至出現(xiàn)閉目、反應(yīng)有些遲鈍等現(xiàn)象，但無豎毛、抽搐、翻倒等異常情況，給藥第2天上述癥狀消失恢復(fù)正常。各組小鼠體重、進(jìn)食量與正常組相比，無明顯差異，排便正常。試驗期間無小鼠死亡。觀察14 d后，小鼠脫頸椎處死，取各臟器肉眼觀察，實質(zhì)器官大致正常，無心肺淤血，無肝脾腫大。該試驗中，最高濃度凹葉景天總黃酮無法引起小鼠死亡，因此按凹葉景天總黃酮最高濃度為昆明種小鼠的最大耐受量（MTD）(以生藥量計)，即60 g/kg。

3.2 凹葉景天總黃酮對小鼠出血和凝血時間的影響

與模型組相比，中劑量和高劑量凹葉景天總黃酮及云南白藥顯著縮短斷尾小鼠出血時間及凝血時間（P ＜ 0.05，P ＜ 0.05；P ＜ 0.01，P ＜ 0.01；P＜0.01，P ＜0.01），表明凹葉景天總黃酮具有止血作用，見表1。

表1 凹葉景天總黃酮對小鼠出血和凝血時間的影響（n=10，x±sd）

3.3 凹葉景天總黃酮對缺氧小鼠存活時間的影響

與模型組相比，中劑量和高劑量凹葉景天總黃酮均可顯著延長常溫常壓缺氧和急性腦缺血小鼠的存活時間（P ＜ 0.01，P ＜ 0.01；P ＜ 0.01，P ＜ 0.01），各劑量凹葉景天總黃酮顯著延長亞硝酸鈉中毒小鼠的存活時間（P ＜ 0.05，P ＜ 0.05，P ＜ 0.05）。表明凹葉景天總黃酮具有耐缺氧作用，見表2。

表2 凹葉景天總黃酮對缺氧小鼠存活時間的影響（n=10，x±sd）

4 討論

凹葉景天為景天科多年生草本植物，廣泛分布于陜西、甘肅、河南、江蘇、四川、安徽及長江以南各地區(qū)，是土家族常用植物藥，稱為“巖板還陽”“馬牙半枝蓮”[10-12]。除景天科凹葉景天有藥用價值外，同科植物佛甲草也是一種藥用植物，具有明顯減慢或阻斷心腦缺氧、缺血的病理過程，對腦缺氧和心肌缺血有改善作用[13]。

凹葉景天含有槲皮素、異鼠李素和甘草苷等黃酮類化合物，其全草各部位總黃酮含量最低的為根，最高的是花[14-16]。 黃酮類化合物是多酚大家族的成員之一，是一類植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于人們的日常飲食中，具有抗氧化、清除自由基、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、護(hù)肝和防治心血管疾病等作用[4,17-21]。陳皮黃酮類物質(zhì)川陳皮素、裸花紫珠總黃酮和柿子黃酮類化合物均可顯著縮短昆明種小鼠斷尾出血時間，裸花紫珠總黃酮和柿子黃酮類化合物有效減短凝血試驗中小鼠的凝血時間[22-24]。馬齒莧乙醇提取物主要成分為黃酮類化合物和單寧，可提高缺氧小鼠體內(nèi)糖酵解過程中關(guān)鍵酶的活性和ATP的水平，具有顯著的耐缺氧作用[25]。黃酮類化合物柚皮素和槲皮素可顯著下調(diào)缺氧小鼠大腦中低氧誘導(dǎo)因子、血管內(nèi)皮生長因子、活性半胱天冬酶3和泛素的表達(dá)水平，有效緩解缺氧小鼠的腦功能損害[26]。凹葉景天總黃酮明顯縮短小鼠出血和凝血時間，延長缺氧小鼠的存活時間，提示凹葉景天總黃酮具有止血和耐缺氧作用。

[1] （清）趙學(xué)敏.本草綱目拾遺[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，1989: 151.

[2] 徐玲，萬定榮. 湖北省土家族常用植物藥（景天科）[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2002（55）：101.

[3] 謝宗萬.全國中草藥匯編（上冊）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：877-882.

[4] 曹緯國，劉志勤，邵云，等.黃酮類化合物藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報，2003（12）：2241-2247.

[5] 馬若寒，陳京.正交試驗優(yōu)選凹葉景天中黃酮的提取工藝[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012（17）：2656-2657.

[6] 徐叔云.藥理試驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1992：201-206.

[7] Furie B.，F(xiàn)urie B.C..Mechanisms of thrombus formation[J]. New England Journal of Medicine，2008，359：938-949.

[8] Stoll G.，Klein schnitz，C.，Nieswandt，B. Molecular mechanisms of thrombus formation in ischemic stroke: novel insights and targets for treatment[J]. Blood，2008，112，3555-3562.

[9] 孫敬方.動物實驗方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：271-273.

[10]南京中醫(yī)藥大學(xué). 中藥大辭典（上冊）[M]. 第二版. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：418-419.

[11]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編（上冊）[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：71.

[12]中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京：科學(xué)出版社，1996：575.

[13]周青，劉建新，周俐，等.佛甲草對小鼠心、腦缺氧的保護(hù)作用[J].中國臨床康復(fù)，2005（31）：129-131.

[14]呂飛，翁德會，吳士筠，等. HPLC 法測定凹葉景天中槲皮素和異鼠李素含量[J]. 化學(xué)與生物工程，2009（8）：91-94.

[15]魏艷芬，吳士筠，殷明，等. 凹葉景天中甘草苷含量的測定[J]. 科教導(dǎo)刊，2010（34）： 261-262.

[16]程琳茗，李炳倫，嚴(yán)愛娟，等.凹葉景天不同部位醇提物總黃酮含量測定及其體外抗氧化活性比較[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013（14）：2096-2097.

[17]Elena A, Alicia Z, Marta I, et al. Flavonoids inhibit hypoxiainduced vascular endothelial growth factor expression by a HIF-1 independent mechanism[J]. Biochemical Pharmacology, 2010（79）：1600-1609.

[18]白鳳梅，蔡同一.類黃酮生物活性及其機(jī)理的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，1998（8）：11-13.

[19] Xiao JB, Ni XL, Kai GY，et al. A review on structure-activity relationship of dietary polyphenols inhibiting-amylase[J]. Crit.Rev.Food Sci.Nutr.，2013（5）: 497-506.

[20]Xiao JB，Kai GY，Yamamoto K，et al.Advance in dietary polyphenols as α-glucosidases inhibitors: a review on structure-activity relationship aspect[J]. Crit.Rev.Food Sci. Nutr. ，2013（8）：818-836.

[21]Liu Y，Kakani R，Nair MG.Compounds in functional food fenugreek spice exhibit anti-inflammatory and antioxidant activities[J]. Food Chem，2012（4）：1187-1192.

[22]張艷艷，盧艷花.陳皮黃酮川陳皮素的分離純化及抗炎止血作用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014（6）：1238-1239.

[23]梁紀(jì)軍，徐凱，李留法，等.裸花紫珠總黃酮的抗炎、止血作用研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，26：3161-3162.

[24]謝玲，鐘曉紅，常嵩華，等.柿子黃酮類化合物的雙水相系統(tǒng)純化及止血凝血抗炎作用[J].研究中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014（9）：1052-1058.

[25]Chen J, Wang WY, Wang XL, et al. Anti-hypoxic activity of the ethanol extract from Portulaca oleracea in mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2009（2）：246-250.

[26]Sarkar A, Angeline MS, Anand K, et al.Naringenin and quercetin reverse the effect of hypobaric hypoxia and elicit neuroprotective response in the murine model[J]. Brain research, 2012（1481）：59-70.

Hemostasis and Anti-Hyproxic Effects of Sedum Emarginatum Migo

CHANG Zheng1,2, WANG Rong1,2, LI Hongchao1,2, LIU Wei1,2, ZHANG Tie1,2, SHENG Qianqian1,2, LI Fuhui1,2
(1. School of Environment and Resources, Wenshan University, Wenshan Yunnan 663099, China; 2. Engineering Research Center of Development and Utilization of Characteristic Plant Resources of Yunnan Universities, Wenshan Yunnan, 663099, China)

Sedum emarginatum Migo fl avonoids (SMF) are obtained with ethanol extraction method. The acute toxicity of ethanol extract from SMF on mice is explored in accordance with classical acute toxicity test methods with the continuous administration and observation for 14 days. SMF is evaluated on anti-hypoxic activity in several hypoxia mice models, including closed normobaric hypoxia, sodium nitrite toxicities and acute cerebral ischemia. The maximally tolerated dose (MTD) of SMF is 60g/kg. Given orally, the SMF could enhance the survival time of mice in both of the normobaric, chemical hypoxia and acute cerebral ischemia models. These results demonstrate that SMF possesses notable hemostasis and anti-hyproxic ability.

Sedum Emarginatum Migo; hemostasis; anti-hyproxic; the acute toxicity; the maximally tolerated dose

R284.2

A

1674-9200（2016）06-0004-04

（責(zé)任編輯 張 鐵）

2016-09-20

文山學(xué)院科研基金項目“生物科學(xué)專業(yè)提升專業(yè)服務(wù)產(chǎn)業(yè)能力建設(shè)項目”（ZX20150102）。

常征，男，云南馬關(guān)人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院副教授，碩士，主要從事生化與分子和藥理學(xué)研究；王蓉，女，安徽蕪湖人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院教師，碩士，主要從事中藥藥理研究；李洪潮，男，云南馬關(guān)人，文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院副教授，主要從事微生物學(xué)研究。