枸杞子中4種類(lèi)胡蘿卜素成分含量測(cè)定一測(cè)多評(píng)法的建立

陳歡 馬玲 蘇曉娟 李艷婷 馬霞 馬學(xué)琴

中圖分類(lèi)號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）08-0957-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.08.09

摘 要 目的 建立同時(shí)測(cè)定枸杞子中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的方法。方法 枸杞子藥材經(jīng)正己烷-無(wú)水乙醇-丙酮-甲苯（10 ∶ 6 ∶ 7 ∶ 7，V/V/V/V）超聲提取后，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。以YMC C30為色譜柱，以甲醇-乙腈-水（81 ∶ 14 ∶ 5，V/V/V）為流動(dòng)相A、二氯甲烷為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為20 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，進(jìn)樣量為20 μL。以玉米黃質(zhì)為參照物，計(jì)算β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的相對(duì)校正因子，再以此計(jì)算上述成分的含量，并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.119 4～2.983 8、0.121 7～1.521 6、0.285 9～5.718 8、8.460 5～211.513 3 μg/mL（R2均大于0.999）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（16 h）試驗(yàn)的RSD均小于4%;平均加樣回收率分別為103.34%、107.37%、105.64%、96.16%（RSD<5%，n=9）。β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的平均相對(duì)校正因子分別為1.109、1.390、1.158;一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法所測(cè)上述成分含量的相對(duì)誤差均在±1%之內(nèi)。結(jié)論 本研究所建立的高效液相色譜法聯(lián)合一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于枸杞子中4種類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 枸杞子;高效液相色譜法;一測(cè)多評(píng)法;玉米黃質(zhì);β-胡蘿卜素;β-隱黃素棕櫚酸酯;玉米黃素雙棕櫚酸酯

Establishment of quantitative analysis of multi-components by singer marker for content determination of 4 carotenoids in Lycium barbarum

CHEN Huan1，2，MA Ling1，SU Xiaojuan3，LI Yanting3，MA Xia1，MA Xueqin3（1. Ningxia Hui Autonomous Region Institute of Drug Control，Yinchuan 750002，China;2. Ningxia Key Laboratory of Drug Creation and Generic Drug Research， Yinchuan 750004，China;3. College of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To establish a method for simultaneous determination of zeaxanthin， β-carotene， β-cryptoxanthin palmitate and zeaxanthin dipalmitate in Lycium barbarum. METHODS L. barbarum was extracted with n-hexane-anhydrous ethanol-acetone-toluene （10 ∶ 6 ∶ 7 ∶ 7， V/V/V/V） by ultrasonic method. High performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted. The determination was performed on YMC C30 column with mobile phase A consisted of methanol-acetonitrile-water （81 ∶ 14 ∶ 5， V/V/V） and mobile phase B consisted of dichloromethane （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 20 ℃. The detection wavelength was set at 450 nm， and sample size was 20 μL. Using zeaxanthin as control， the relative correction factors （RCFs） of β-carotene， β-cryptoxanthin palmitate and zeaxanthin dipalmitate were calculated， and then the content of each component was calculated according to RCFs and compared with the results of external standard method（ESM）. RESULTS The linear range of zeaxanthin， β-carotene， β-cryptoxanthin palmitate and zeaxanthin dipalmitate were 0.119 4-2.983 8， 0.121 7-1.521 6， 0.285 9-5.718 8， 8.460 5-211.513 3 μg/mL（all R2>0.999）. RSDs of precision， repeatability and stability（16 h） tests were all less than 4%. The average recoveries were 103.34%， 107.37%， 105.64%， 96.16%（RSD<5%， n=9）. The average RCFs of β-carotene， β-cryptoxanthin palmitate and zeaxanthin dipalmitate were 1.109， 1.390， 1.158. The relative errors of the content determination results by quantitative analysis of multi-components by singer marker （QAMS） and ESM were within ±1%. CONCLUSIONS The established HPLC-QAMS method is accurate and stable， which can be used for the content determination and quality control of 4 carotenoids in L. barbarum.

KEYWORDS ? Lycium barbarum; HPLC; QAMS; zeaxanthin; β-carotene; β-cryptoxanthin palmitate; zeaxanthin dipalmitate

類(lèi)胡蘿卜素是中藥枸杞子所含的主要色素，也是其重要的活性成分之一，具有提高人體免疫功能、抗腫瘤、抗氧化、護(hù)肝、保護(hù)視力等作用[1-5]。枸杞子中含有β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)等游離類(lèi)胡蘿卜素和玉米黃素雙棕櫚酸酯、β-隱黃素棕櫚酸酯等類(lèi)胡蘿卜素酯成分，其中玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量最高[6-8]。枸杞子中類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量控制以多指標(biāo)含量測(cè)定為主，采用外標(biāo)法需要多個(gè)對(duì)照品，而該類(lèi)對(duì)照品價(jià)格昂貴且其溶液穩(wěn)定性不佳，使得實(shí)驗(yàn)成本較高。一測(cè)多評(píng)法是借助單一對(duì)照品（參照物）測(cè)定樣品中多個(gè)成分（待測(cè)成分）含量的分析方法，能夠較好地解決中藥質(zhì)量控制中對(duì)照品缺乏這一問(wèn)題[9-10]?；诖耍狙芯坎捎酶咝б合嗌V法聯(lián)合一測(cè)多評(píng)法，建立同時(shí)測(cè)定枸杞子中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯含量的方法，并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，旨在為枸杞子中類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），XPE26型百萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），CQ-200B-DST型超聲波清洗儀（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）等。

1.2 主要藥品與試劑

β-胡蘿卜素對(duì)照品[批號(hào)100445-201802，純度29.8%（以C40H56計(jì)，供高效液相色譜法測(cè)定）]購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;玉米黃質(zhì)對(duì)照品（批號(hào)AF8062716，純度98.80%）購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司;玉米黃素雙棕櫚酸酯對(duì)照品（批號(hào)0309S，純度72.76%）購(gòu)自法國(guó)Extrasynthese公司;β-隱黃素棕櫚酸酯對(duì)照品（批號(hào)2017.06.12，純度98.6%）購(gòu)自瑞士Carote Nature公司;正己烷、甲醇、乙腈、二氯甲烷均為色譜純，無(wú)水乙醇、丙酮、甲苯、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxy toluene，BHT）均為分析純，水為超純水。

20批次枸杞子藥材樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。各樣品經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)馬學(xué)琴教授鑒定，均為茄科植物枸杞Lycium barbarum L.的干燥果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 于避光條件下，精密稱(chēng)取玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯對(duì)照品各適量，加二氯甲烷溶解，制成上述4種成分質(zhì)量濃度分別為5.967 5、3.043 2、28.594 0、846.053 3 μg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液 于避光條件下，精密量取“2.1.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于同一10 mL量瓶中，用含0.1%BHT的無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯質(zhì)量濃度分別為0.596 8、0.304 3、2.859 4、84.605 3 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 于避光條件下，取枸杞子藥材，粉碎，取粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合溶劑[正己烷-無(wú)水乙醇-丙酮-甲苯（10 ∶ 6 ∶ 7 ∶ 7， ?V/V/V/V），下同]20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（頻率28 kHz，功率200 W）處理30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用混合溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL，置于5 mL量瓶中，用含0.1%BHT的無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

以YMC C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-乙腈-水（81 ∶ 14 ∶ 5，V/V/V）為流動(dòng)相A、二氯甲烷為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～20 min，70%A→50%A;20～48 min，50%A;48～50 min，50%A→70%A;50～55 min，70%A）;柱溫為20 ℃;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm;進(jìn)樣量為20 μL。在該色譜條件下，混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)S20）和空白溶液（混合溶劑）的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、0.5、0.5 mL，各4份，置于同一50、25、10、5 mL量瓶中，用含0.1%BHT的無(wú)水乙醇稀釋至刻度，作為線性1、2、3、4溶液;精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液5、5、2、2.5 mL，置于10 mL量瓶中，用含0.1%BHT的無(wú)水乙醇稀釋至刻度，作為線性5溶液。取各線性溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（A）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（c）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用含0.1%BHT的無(wú)水乙醇定量稀釋成適宜濃度的溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比3 ∶ 1和10 ∶ 1計(jì)算檢測(cè)限和定量限。結(jié)果顯示，玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的檢測(cè)限分別為0.017 9、0.036 5、0.085 8、0.112 8 μg/mL，定量限分別為0.059 7、0.121 7、0.285 9、0.282 0 μg/mL。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯峰面積的RSD分別為1.57%、1.41%、0.82%、0.94%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次枸杞子樣品（編號(hào)S20）6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量分別為28.834、10.944、85.390、4 046.932 μg/g，RSD分別為1.35%、3.84%、3.81%、1.17%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（編號(hào)S20），分別在室溫下放置0、2、4、8、12、16 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯峰面積的RSD分別為2.43%、0.72%、1.68%、0.45%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的枸杞子樣品（編號(hào)S20）9份，精密稱(chēng)定，分別按低、中、高質(zhì)量濃度加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 相對(duì)校正因子的確定

2.4.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，以玉米黃質(zhì)（對(duì)照品易獲得且價(jià)格相對(duì)便宜）為參照物，計(jì)算β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的相對(duì)校正因子（fsi）：fsi=fs/fi=（As/cs）/（Ai/ci）（式中，As為參照物的峰面積，cs為參照物的質(zhì)量濃度，Ai為待測(cè)成分的峰面積，ci為待測(cè)成分的質(zhì)量濃度）[11]。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.2 色譜峰的定位 采用相對(duì)保留時(shí)間法對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行色譜峰定位。取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，以玉米黃質(zhì)為參照物，計(jì)算β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的相對(duì)保留時(shí)間（ris）：ris=tRi/tRs（式中，tRs為參照物的保留時(shí)間，tRi為待測(cè)成分的保留時(shí)間）。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.3 耐用性考察 分別對(duì)柱溫（18、20、22 ℃）、流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、YMC C30色譜柱（序列號(hào)102ZA90175、128IA80057、114EA80152）、色譜儀（Agilent 1260、Waters e2695、Thermo UltiMate 3000）進(jìn)行耐用性考察，取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3次，計(jì)算β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

2.5 樣品測(cè)定

取20批枸杞子樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備3份，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以玉米黃質(zhì)為參照物，按一測(cè)多評(píng)法計(jì)算β-胡蘿卜素、β-隱黃素棕櫚酸酯、玉米黃素雙棕櫚酸酯的含量，并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果（玉米黃質(zhì)除外）進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)誤差（relative error， RE）：RE=（WQAMS-WESM）/WESM×100%（式中，WESM為外標(biāo)法測(cè)得的成分含量，WQAMS為一測(cè)多評(píng)法測(cè)得的成分含量）[12]。結(jié)果顯示，20批樣品兩種方法測(cè)定結(jié)果的RE均在±1%范圍內(nèi)，表明兩者無(wú)明顯差異，結(jié)果見(jiàn)表7。

3 討論

3.1 參照物的選擇

類(lèi)胡蘿卜素酯成分的對(duì)照品不易獲得且價(jià)格昂貴，故未選擇;玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素的對(duì)照品較易獲得，但β-胡蘿卜素的峰面積較小，且在部分樣品中未被檢出，而玉米黃質(zhì)在所有樣品中均被檢出且峰面積適中，故選擇玉米黃質(zhì)作為參照物。

3.2 流動(dòng)相的考察

枸杞子中類(lèi)胡蘿卜素成分較多，等度洗脫無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，故考慮采用梯度洗脫。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組以甲醇、乙腈、水為流動(dòng)相，對(duì)其分離效果進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述流動(dòng)相無(wú)法洗脫出類(lèi)胡蘿卜素酯等成分，因類(lèi)胡蘿卜素酯極性較小，故考慮在流動(dòng)相中加入弱極性溶劑，遂進(jìn)一步對(duì)甲基叔丁基醚、四氫呋喃、異丙醇、乙酸乙酯及二氯甲烷的分離效果進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相中加入二氯甲烷時(shí)，各待測(cè)成分色譜峰的峰形及分離度均較好。

3.3 提取方法的考察

本課題組借助單因素實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了提取溶劑、提取方法及時(shí)間、料液比對(duì)提取效率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)溶劑為正己烷-無(wú)水乙醇-丙酮-甲苯（10 ∶ 6 ∶ 7 ∶ 7，V/V/V/V）、料液比為1 ∶ 20（g/mL）、超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取效率最高，故以上述方法作為供試品溶液的提取方法。

3.4 樣品二步稀釋溶劑的考察

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，樣品提取后直接進(jìn)樣，玉米黃質(zhì)的色譜峰峰形較差，且樣品提取溶劑與對(duì)照品提取溶劑不一致，使得玉米黃質(zhì)回收率較低，故考慮對(duì)樣品進(jìn)行二步稀釋。本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)中考察了含0.1%BHT的無(wú)水乙醇、正己烷、丙酮、甲苯、甲醇、乙腈等稀釋溶劑對(duì)待測(cè)成分色譜峰的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)使用不同的稀釋溶劑時(shí)，所得色譜圖中各色譜峰的響應(yīng)值不同;當(dāng)以含0.1%BHT的無(wú)水乙醇和丙酮為二步稀釋溶劑時(shí)，所得色譜圖中各色譜峰的響應(yīng)值均較高且峰形良好，考慮到前者的毒性較小，因此選擇含0.1%BHT的無(wú)水乙醇作為稀釋溶劑。

綜上所述，本研究建立了同時(shí)測(cè)定枸杞子中4種類(lèi)胡蘿卜素成分含量的高效液相色譜法聯(lián)合一測(cè)多評(píng)法，該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可用于枸杞子中4種類(lèi)胡蘿卜素成分的含量測(cè)定及質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2021-12-22 修回日期：2022-04-02）

（編輯：鄒麗娟）