隴東地區(qū)膜莢黃芪自毒作用研究*

張　博,石國(guó)璽,馬世榮,劉瑞瑞,郭小強(qiáng),杜曉剛(.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,甘肅慶陽(yáng)745000；.華池縣林業(yè)總場(chǎng)城壕林場(chǎng)，甘肅華池74563)

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隴東地區(qū)膜莢黃芪自毒作用研究*

張博1,石國(guó)璽1,馬世榮1,劉瑞瑞1,郭小強(qiáng)1,杜曉剛2
(1.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,甘肅慶陽(yáng)745000；2.華池縣林業(yè)總場(chǎng)城壕林場(chǎng)，甘肅華池745613)

摘要：模擬自然條件，以水做溶劑，采用超聲波提取技術(shù)對(duì)膜莢黃芪根中的自毒物質(zhì)進(jìn)行提取，選擇不同極性的溶劑進(jìn)行萃取分離并進(jìn)行生物檢測(cè)。結(jié)果顯示，膜莢黃芪根系水提物中有自毒物質(zhì)；乙酸乙酯萃取組分的作用最強(qiáng)；經(jīng)酸堿萃取分離的酸性組分和中性組分1對(duì)膜莢黃芪根的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，0.0040和0.0020g DW(干重)· mL-1的酸性組分的抑制作用達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；濃度為0.0040gDW·mL-1中性組分1，其抑制作用達(dá)到了顯著性差異(P<0.05)；經(jīng)0.0020g·mL-1的酸性組分水溶液處理膜莢黃芪幼苗，其受體細(xì)胞中可溶性糖和MDA的含量顯著升高。該結(jié)果表明膜莢黃芪的自毒作用是造成黃芪連作障礙的原因之一。

關(guān)鍵詞：膜莢黃芪;自毒作用;自毒物質(zhì);酸堿萃取分離

膜莢黃芪(Astragalus membranaceus)為蝶形花科植物，其干燥根為著名的滋補(bǔ)中藥材[1]，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保肝、托毒生肌、抗衰老、降壓等作用，主治氣虛衰弱、久潰不斂、高血壓、糖尿病、水腫等癥，被稱為“補(bǔ)氣固表之良藥”[2]，是我國(guó)出口的大宗商品藥材之一。隨著市場(chǎng)需求量持續(xù)增加，對(duì)野生黃芪的過度采挖，導(dǎo)致其野生資源瀕臨滅絕。因此，自上世紀(jì)70年代后期，商品黃芪主要來源于人工栽培[2]。但連作障礙已成為制約黃芪生產(chǎn)的瓶頸因素之一。連作障礙的發(fā)生不僅與土壤微生物種類與數(shù)量、理化性質(zhì)劣變有關(guān)，還與藥用植物根系分泌物和殘株腐解物等引起的自毒作用有關(guān)[3]。

自毒作用是植物化感作用的一種特殊作用形式，是引起作物或中草藥連作障礙的主要原因之一[4]。當(dāng)前，對(duì)植物自毒作用的檢測(cè)和自毒效應(yīng)程度的量化，是研究自毒作用的基礎(chǔ)[3,4]，而選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛∨c分離自毒物質(zhì)，并對(duì)其活性進(jìn)行測(cè)定，是研究化感作用的難點(diǎn)與重點(diǎn)。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，連作小麥(T.aestivum)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)[5]、黃瓜(C.sativus)[5,6]、番茄(L.nesculentum)、西瓜(C.lanatus）等作物和黃連(C.chinensis Franch.)[7]、地黃(R. glutinosa)[8]、人參(P.ginseng)[9]、三七(R.notoginseng)[10]、丹參(S.miltiorrhiza)[11]、貝母(C.corymbosa)[12]、桔梗(P. grandiflorus)、蒙古黃芪(A.membranaceusvar. mongholicus)[13]等藥用植物都存在嚴(yán)重的自毒作用，抑制其生長(zhǎng)，影響產(chǎn)質(zhì)量。鑒于此，本研究以隴東地區(qū)種植的膜莢黃芪為研究對(duì)象，模擬自然條件下化感物質(zhì)進(jìn)入土壤和環(huán)境的主要途徑，對(duì)其根中的自毒物質(zhì)進(jìn)行提取和初步分離，并對(duì)其生物活性進(jìn)行了檢測(cè)，測(cè)定自毒條件下黃芪幼苗的部分生理生化指標(biāo)，旨在研究膜莢黃芪自毒物質(zhì)的特性和作用機(jī)理，為解決隴東干旱地區(qū)膜莢黃芪生產(chǎn)實(shí)踐問題提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

膜莢黃芪于2013年10月中旬采自甘肅省寧縣早勝鎮(zhèn)，其種子購(gòu)買于甘肅省農(nóng)科所。

1.2主要試劑和儀器

試驗(yàn)所用的有機(jī)溶劑n-BuOH(正丁醇)、EtOAc(乙酸乙酯)、EtOH(乙醇)、MeOH(甲醇)、Pet.ether(石油醚)和CHCL3(氯仿)等均為AR級(jí)；S-120學(xué)生實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī)(江蘇)，SPX-250B微電腦光照培養(yǎng)箱，SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵(日本)，1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州)，恒溫加熱板，HF-2.0超聲循環(huán)提取儀(上海)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1自毒物質(zhì)的提取與分離

將剛采收新鮮膜莢黃芪的根除雜、洗凈、晾干，用粉碎機(jī)粉碎(Φ=1mm)。稱取粉末1000g，加入蒸餾水(粉末：蒸餾水=1:10)，超聲循環(huán)提取儀提取2次，提取條件：20Hz、5～10W/cm2、保護(hù)T=35℃、間歇時(shí)間：2s、攪拌：920～950轉(zhuǎn)/分，提取時(shí)間：30min。合并提取液，用多層紗布過濾，抽濾2次，減壓濃縮，用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚萃取三次，分別得到石油醚萃取組分、氯仿萃取組分、乙酸乙酯萃取組分和正丁醇萃取組分。將每個(gè)萃取組分，置于50℃的恒溫干燥板上蒸干水分，制成浸膏并稱重。分別精確稱取少量萃取物浸膏蒸餾水溶解，微膜(= 20μm)過濾，配置成0.20、0.10和0.05gDW·mL-1濃度的處理液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2不同萃取組分對(duì)膜莢黃芪幼苗生長(zhǎng)的影響

將經(jīng)過消毒、預(yù)萌發(fā)處理的膜莢黃芪種子(大小、生物量一致）移入高溫滅菌的紙床培養(yǎng)皿中，20 粒/皿，分別加入處理液5mL，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，以蒸餾水作對(duì)照，置于白天25℃、晚上20℃，光照2000lux、10h·d-1的微電腦光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天補(bǔ)充適量的蒸餾水，以保持濕潤(rùn)，并記錄萌發(fā)率，第7～10d，隨機(jī)選10株，測(cè)量幼苗的根長(zhǎng)和苗高。

1.3.3對(duì)自毒作用最強(qiáng)組分中自毒物質(zhì)的進(jìn)一步分離

經(jīng)生物監(jiān)測(cè)，自毒作用最強(qiáng)的組分為乙酸乙酯萃取組分。參考譚仁祥[14]的酸堿萃取分離法對(duì)乙酸乙酯組分進(jìn)一步分離：精確稱取一定量的乙酸乙酯萃取物浸膏，蒸餾水溶解，用10%Na2CO3調(diào)節(jié)至pH=8-9，用EtOAc萃取合并、蒸餾，將溶液分成E-tOAc相和水相兩部分；再將EtOAc萃取物用蒸餾水溶解，用10%HCL調(diào)節(jié)至pH=1-2，然后用EtOAc萃取，將萃取后的溶液再用10%HCL調(diào)節(jié)至pH= 7.0，并用EtOAc萃取得到中性組分1；水相用10% Na2CO3調(diào)節(jié)pH=11-13并用EtOAc萃取得到堿性組分。將首次萃取得到的水相先用10%HCL調(diào)節(jié)pH=1-2，EtOAc萃取得到酸性組分，將本次萃取后剩余水相再用10%HCL調(diào)節(jié)pH=7.0，并用EtOAc萃取得到中性組分2。具體操作流程如圖1所示。1.3.4酸堿萃取分離的四個(gè)組分對(duì)自身幼苗生長(zhǎng)的比較

酸堿萃取分離得到的酸性組分、中性組分1、中性組分2和堿性組分，分別配置成濃度為4.0和2.0mg·mL-1(相當(dāng)于蒸餾水超聲提取濃度)的處理液，進(jìn)行幼苗生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，方法同1.3.2。

圖1　酸堿萃取分離與生物檢測(cè)的試驗(yàn)流程

1.3.5酸性組分處理后膜莢黃芪幼苗生理指標(biāo)測(cè)定

膜莢黃芪幼苗的生理指標(biāo)測(cè)定方法[15]：葉綠素含量采用分光光度法；丙二醛(MDA)含量采用TBA比色法；根系活力采用TTC法；過氧化物酶(POD)含量采用愈創(chuàng)木酚法；質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)儀法。

1.4數(shù)據(jù)處理方法

參照Williamson等[16]的方法，采用化感作用效應(yīng)指數(shù)(RI)度量化感作用的強(qiáng)度，處理組和對(duì)照組間的差異顯著性采用SPSS11.5軟件對(duì)其在95%的置性水平進(jìn)行LSD法檢驗(yàn)。

式中：C為對(duì)照值；T為處理值；RI＞0為促進(jìn)；RI＜0為抑制，絕對(duì)值的大小與作用強(qiáng)度一致。

2　結(jié)果與分析

2.1不同萃取組分對(duì)膜莢黃芪根長(zhǎng)的影響

膜莢黃芪根粉末超聲波提取物經(jīng)過不同極性的有機(jī)溶劑分別萃取之后得到5個(gè)組分，將其分別制成干膏，并配置濃度分別為0.05、0.10和0.20gDW·mL-1的處理液進(jìn)行生物活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同萃取組分的不同濃度處理液對(duì)幼苗根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用：其中剩余水組分、氯仿組分和石油醚組分中的自毒作用效應(yīng)最弱；乙酸乙酯組分的自毒效應(yīng)最強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.10 和0.20gDW·mL-1時(shí)，其自毒效應(yīng)顯著高于對(duì)照，濃度為0.05gDW·mL-1時(shí)無顯著自毒作用；正丁醇餾分濃度為0.05gDW·mL-1的處理液對(duì)黃芪苗高的生長(zhǎng)成不顯著的促進(jìn)作用(如圖2所示）。

2.2不同萃取組分對(duì)膜莢黃芪苗高的影響

從圖3可以看出，以上5個(gè)萃取組分的不同濃度處理液對(duì)膜莢黃芪幼苗的苗高生長(zhǎng)沒有抑制作用，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，但其作用效果均未達(dá)到顯著性差異。

圖2　不同的萃取組分對(duì)膜莢黃芪根長(zhǎng)的影響（LSD檢驗(yàn)）

圖3　不同萃取餾分對(duì)膜莢黃芪苗高的影響

2.3酸堿萃取分離得到的四種組分的生物活性檢測(cè)

從表1可以看出，酸性組分中自毒物質(zhì)對(duì)膜莢黃芪幼苗根的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，濃度為4.0和2.0mg·mL-1的處理液的作用都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)；中性組分1中的自毒物質(zhì)當(dāng)濃度為4.0 mg·mL-1時(shí)，其抑制作用達(dá)到了顯著性差異(P< 0.05)，低濃度雖然有一定的抑制作用，但沒有達(dá)到顯著性差異；堿性組分對(duì)幼苗根長(zhǎng)生長(zhǎng)有抑制作用，而對(duì)苗高的生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用；酸性組分2都對(duì)膜莢黃芪根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)無抑制作用。

表1　酸堿萃取得到的四種組分1的生物活性檢測(cè)（LSD檢驗(yàn)）

2.4乙酸乙酯組分中的酸性組分1對(duì)黃芪生理指標(biāo)的影響（見表2）

表2　乙酸乙酯組分中的酸性組分對(duì)黃芪生理指標(biāo)的影響

濃度為4.0mg·mL-1的酸性組分水溶液處理膜莢黃芪的幼苗，培養(yǎng)7-10d后，分別對(duì)其根系活力、MDA、TTC、POD、可溶性糖和相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，在測(cè)試的6項(xiàng)生理指標(biāo)中，可溶性糖和MDA的含量都有明顯的升高，其作用效果使可溶性糖和MDA的含量分別增加了38.18%和14.31%，且都已經(jīng)達(dá)到顯著性差異(P<0.05)；葉綠素含量和相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照相比有所升高，而TTC和POD含量相對(duì)降低了，但是其變化程度都沒有達(dá)到顯著性差異。

3　討論

本文模擬自然環(huán)境，用超聲波提取法對(duì)膜莢黃芪根中的自毒物質(zhì)進(jìn)行了提取，并濃縮、萃取、生測(cè)，得出的結(jié)論，趙楊景等[17]研究西洋參(Panax quinquefoliumL.)、紫蘇(Perilla frutescens(L.)Britton.)籽和薏苡(Coix Lacrymajobi L.)根水提物的化感作用的結(jié)論是一致的，與王明道等[8]通過分離研究地黃中的化感物質(zhì)，得出的乙酸乙酯組分中化感活性最強(qiáng)的結(jié)論也是一致的。表明膜莢黃芪根中的自毒物質(zhì)易溶于乙酸乙酯中；其自毒效應(yīng)主要表現(xiàn)為抑制自身根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，也是造成膜莢黃芪連作障礙的原因之一。

酸堿萃取法是物質(zhì)分離的常用方法之一[14]。膜莢黃芪根中的自毒物質(zhì)經(jīng)過酸堿萃取分離得的酸性組分的自毒效應(yīng)最強(qiáng)，濃度為4.0和2.0mg·mL-1都達(dá)到了極顯著水平(p<0.01)，且作用程度與濃度呈正相關(guān)，這進(jìn)一步說明了其自毒物質(zhì)主要是堿性物質(zhì)和中性物質(zhì)。植物長(zhǎng)期生活在逆境脅迫中，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和MDA含量的顯著升高，根系活力和POD含量都有不同程度的降低，這是由于逆境下植物能夠感應(yīng)外界脅迫，并通過自身調(diào)節(jié)系統(tǒng)，使之在生理和形態(tài)上發(fā)生的適應(yīng)性反應(yīng)，增強(qiáng)生存機(jī)會(huì)的原因。當(dāng)膜莢黃芪的自毒物質(zhì)濃度達(dá)到一定程度時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和MDA含量的顯著升高，根系活力和POD含量都有不同程度的降低，影響了新陳代謝，降低產(chǎn)量和抗病性。在試驗(yàn)過程中觀察到了自毒條件下的黃芪幼苗的根起初開始褐化，最后部分根開始腐爛。

本研究表明，膜莢黃芪根中的自毒物質(zhì)種類較多，含量不同，自毒作用主要表現(xiàn)在能引起細(xì)胞內(nèi)多種酶的含量變化，進(jìn)而影響根的生長(zhǎng)。至于引起膜莢黃芪自毒作用的是哪類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和作用特點(diǎn)還有待于進(jìn)一步研究。

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*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)青年基金(31500427)；國(guó)家自然科學(xué)青年基金(31560139)。

中圖分類號(hào)：Q-948