重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在CHO/dhfr－細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和純化

劉春鳳，張　寧，周　婷，王世媛，陳清西*

( 1．廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361005; 2．廈門特寶生物工程股份有限公司，福建廈門361022)

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重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在CHO/dhfr－細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和純化

劉春鳳1，張寧2，周婷2，王世媛2，陳清西1*

( 1．廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361005; 2．廈門特寶生物工程股份有限公司，福建廈門361022)

摘要:構(gòu)建了含重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1( rhTGF-β1)基因的真核表達(dá)載體，并利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到二氫葉酸還原酶( DHFR)缺陷型哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO/dhfr(－)中，通過氨甲喋呤( MTX)加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的細(xì)胞株．于14 L細(xì)胞發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( ELISA)檢測(cè)得表達(dá)量在3 mg/L左右．采用親和層析、反相層析及分子篩凝膠層析的方法分離純化，獲得的rhTGF－β1試制品的純度大于97%，得率在25%以上．通過基質(zhì)輔助激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜( MALDI－TOF MS)測(cè)定rhTGF－β1的分子量為25．470 ku，與理論分子量一致．N端蛋白序列分析儀分析其N端氨基酸序列，與理論的氨基酸序列一致．rhTGF－β1具有抑制水貂肺上皮細(xì)胞Mv－1－Lu增殖的活性，測(cè)定其比活為3．2×107IU/mg，與商品化的rhTGF－β1標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)．本研究為進(jìn)一步規(guī)模化制備rhTGF-β1奠定了基礎(chǔ)．

關(guān)鍵詞:重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;表達(dá);純化

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β( transforming growth factor－β，TGF－β)是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育和凋亡等多種生命活動(dòng)［1］．TGF－β亞家族目前報(bào)道有6種，分別為TGF－β1、TGF－β2、TGF－β3、TGF－β4、TGF－β5和TGF－β6，它們氨基酸序列之間有70%～80%的同源性［2］．哺乳動(dòng)物僅有3種，分別為TGF－β1、TGF－β2和TGF－β3，其中TGF－β1在體細(xì)胞系中所占比例最高(＞90%)，活性最強(qiáng)．在人體的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，TGF－β1能夠有效抑制多類細(xì)胞的增殖，參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)以及細(xì)胞間質(zhì)的形成等各種生理過程［3］．

在大多數(shù)細(xì)胞中，未成熟的TGF－β1由390個(gè)氨基酸組成，在胞內(nèi)蛋白內(nèi)切酶的作用下，N端278個(gè)氨基酸形成前導(dǎo)肽或潛伏結(jié)合多肽( latency－associated peptide，LAP)，C端112個(gè)氨基酸為成熟肽．前導(dǎo)肽通過2個(gè)半胱氨酸殘基( Cys)鏈間二硫鍵形成二聚體;成熟肽具有9個(gè)高度保守的Cys，其中8個(gè)Cys相互靠近，形成鏈內(nèi)二硫鍵，第9個(gè)Cys形成鏈間二硫鍵，構(gòu)成具有生物學(xué)活性的二聚體;前導(dǎo)肽與成熟肽被切開后仍以非共價(jià)的形式結(jié)合，形成一種與受體不能結(jié)合的潛在復(fù)合物，需通過改變離子強(qiáng)度和pH進(jìn)行分離，分離后的成熟肽才具有活性［4］．

目前已有的TGF－β1表達(dá)系統(tǒng)不夠完善，后續(xù)純化也比較復(fù)雜，故我們?cè)跇?gòu)建TGF－β1表達(dá)載體時(shí)，在目的蛋白N端引入鼠血清白蛋白分泌信號(hào)肽和His6標(biāo)簽，以利于TGF－β1的蛋白分泌及后續(xù)純化．同時(shí)，將TGF－β1前導(dǎo)肽中的Cys33突變?yōu)榻z氨酸殘基( Ser)以避免影響目的蛋白活性亞基解離，終產(chǎn)品序列與天然蛋白完全一致．pOptiVec－Topo載體(購于Invitrogen公司)通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入點(diǎn)( internal ribosome entry site，IRES)序列將目的基因和二氫葉酸還原酶( DHFR)基因連接形成雙順反子表達(dá)載體，IRES能夠不依賴5'帽子結(jié)構(gòu)而獨(dú)立起始翻譯，在轉(zhuǎn)錄時(shí)目的基因和DHFR基因形成同一條mRNA，以共同的效率和比例表達(dá)，排除只整合了DHFR基因的假陽性克隆;應(yīng)用pOptiVec載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有利于陽性克隆篩選，有氨甲喋呤( MTX)抗性的細(xì)胞均為陽性細(xì)胞株［5］．

本研究利用基因工程技術(shù)，將來源Invitrogen公司的pOptiVec－Topo真核表達(dá)載體通過T4連接酶形成閉環(huán)的自連載體，然后將TGF-β1基因插入到改造后的pOptiVec真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染DHFR缺陷型哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO/dhfr－，通過MTX梯度加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)TGF－β1的細(xì)胞株，在TGF－β1表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行工藝研究，并對(duì)終產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行了相關(guān)鑒定，意在為今后規(guī)模化生產(chǎn)TGF－β1奠定基礎(chǔ)．

1材料和方法

1. 1材料

CHO/dhfr－細(xì)胞為ATCC公司產(chǎn)品;大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存; T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ和瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品; KODPlus Neo PCR酶為TOYOBO公司產(chǎn)品; lipofectamineTM2000、Opti－MEMⅠ培養(yǎng)基購于Invitrogen公司;次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷( hypoxanthine、thymidine，HT)和MTX為Sigma公司產(chǎn)品;杜爾伯科改良依格爾培養(yǎng)基( DMEM)、胰酶和磷酸鹽緩沖液( PBS)為Hyclone公司產(chǎn)品;人TGF－β1鉑酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)( ELISA)試劑盒購買于eBioscience公司;丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品;螯合瓊脂糖凝膠FF、SOURCE 15S和葡聚糖凝膠G－25粗填料為General Electric( GE)公司產(chǎn)品;重組人TGF－β1( rhTGF－β1)標(biāo)準(zhǔn)品為R＆D公司產(chǎn)品，其余均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

主要儀器: NBS型14 L細(xì)胞發(fā)酵罐，B．Braun Biotech公司; 311型CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司;全溫振蕩器，型號(hào)HZQ－F，哈爾濱東明醫(yī)療器械廠;離心機(jī)，型號(hào)Avanti J－E，Beckman公司; P2B005A01超濾膜，Millipore公司;蛋白純化儀，型號(hào)Basic 100，GE公司;基質(zhì)輔助激光解析電離化飛行時(shí)間質(zhì)譜( MALDI－TOF MS)，型號(hào)REFLEXTMⅢ，Bruker公司; N端蛋白序列分析儀，島津公司; SpectraMan M2e酶標(biāo)儀，Molecular Devices( MD)公司．

1. 2 rhTGF-β1真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)人TGF－β1的氨基酸序列( NM_000660)，采用真核細(xì)胞喜好密碼子，按照三聯(lián)體密碼原則編排出TGF-β1 cDNA序列．交由捷瑞基因公司合成TGF-β1全基因，插入pGH質(zhì)粒中．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，于37℃分別對(duì)TGF-β1基因擴(kuò)增產(chǎn)物和改造后真核表達(dá)載體pOptiVec進(jìn)行BamHⅠ、NotⅠ雙酶切，純化回收酶切產(chǎn)物，并在T4連接酶作用下4℃過夜使表達(dá)載體與目的片段連接，連接產(chǎn)物取10 μL轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB/Amp抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜．挑取單菌落接種于5 mL LB/Amp抗性液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)過夜．使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，BamHⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)雙酶切初步篩選的陽性克隆進(jìn)行核酸測(cè)序，測(cè)序驗(yàn)證無誤的質(zhì)粒用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染．

1. 3重組質(zhì)粒DNA的大量制備及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO/dhfr－細(xì)胞株

將包含驗(yàn)證無誤的質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1的DH5α菌株接種到一定量的LB/Amp抗性液體培養(yǎng)基中，37℃220 r/min培養(yǎng)過夜．次日，采用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒提取試劑盒制備得到質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1，紫外分光光度儀測(cè)定所得質(zhì)粒的濃度和純度．獲得的重組質(zhì)粒用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO/dhfr－細(xì)胞株．轉(zhuǎn)染前24 h，將CHO/dhfr－細(xì)胞以2×106接種6孔板，轉(zhuǎn)染當(dāng)天確認(rèn)細(xì)胞匯合度介于90%～95%．轉(zhuǎn)染試劑采用陽離子脂質(zhì)體lipofectamineTM2000，按照質(zhì)粒:轉(zhuǎn)染試劑=1∶3的比例取質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑先分別與Opti－MEMⅠ培養(yǎng)基混合，體積各100 μL．然后將兩者混合，室溫放置15 min，添加800 μL Opti－MEMⅠ培養(yǎng)基輕輕混勻，加入到細(xì)胞中，培養(yǎng)4 h后即可更換完全培養(yǎng)基( DMEM+ 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清白蛋白( FBS) +HT+10－6MTX培養(yǎng)基)．

1. 4穩(wěn)定表達(dá)rhTGF-β1細(xì)胞株的篩選

轉(zhuǎn)染24 h后分板，按照每孔100個(gè)細(xì)胞鋪96孔板20塊，MTX初始加壓濃度為100 nmol/L，后每輪濃度提高一定倍數(shù)．每步加壓前均先亞克隆化，ELISA選擇高表達(dá)亞克隆株進(jìn)行下一步加壓．加壓過程中細(xì)胞采用6孔板或T25方瓶培養(yǎng)，加壓時(shí)細(xì)胞按匯合度為20%～30%鋪板，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代2～5次，待細(xì)胞適應(yīng)該篩選壓力、無細(xì)胞凋亡且增殖速度正常視為一輪加壓完成，一般需2周左右．通過計(jì)算pg/cell/day( PCD)評(píng)價(jià)加壓前后rhTGF－β1表達(dá)是否提高．加壓前和加壓后細(xì)胞均按1×105mL－1，2 mL接種于6孔板，培養(yǎng)2 d后取上清，采用ELISA檢測(cè)rhTGF－β1表達(dá)量，計(jì)算rhTGF－β1的PCD值．PCD有提高的細(xì)胞株保種并繼續(xù)下一輪MTX加壓，共進(jìn)行3輪．

1. 5 rhTGF-β1的純化

轉(zhuǎn)染有rhTGF－β1表達(dá)質(zhì)粒的CHO/dhfr－細(xì)胞株使用14 L細(xì)胞固定床發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)rhTGF－β1，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液上清，離心收集發(fā)酵上清．

1. 5. 1膜包超濾

取離心發(fā)酵上清，6 ku膜包超濾濃縮，400 mL超純水置換4次，再用含50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris－HCl( pH 8．0)的緩沖液置換4次，收集超濾樣品．

1. 5. 2 Ni柱捕獲

選擇螯合瓊脂糖凝膠FF填料，將超濾后樣品3∶1加入含100 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris－HCl ( pH 8．0)的洗脫緩沖液混勻上樣，再用300 mmol/L咪唑、50 mmol/L NaCl、50 mmol/L精氨酸、50 mmol/L Tris－HCl( pH 8．0)洗脫，收集目的樣品．

1. 5. 3 G25柱脫鹽

選擇葡聚糖凝膠G－25粗填料，將Ni柱洗脫樣品上樣，用含1 mol/L NaCl，100 mmol/L甘氨酸( pH 4．0)的緩沖液置換，收集目的樣品，以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3．0，4℃保存過夜．

1. 5. 4反向柱純化

選擇SOURCE 15S填料，將G－25柱洗脫樣品上樣，以30%洗脫緩沖液平衡后，50%洗脫緩沖液洗脫，收集目的樣品．上樣緩沖液為100 mmol/L NaCl、2%乙腈，洗脫緩沖液為0．3%乙酸、70%乙腈．

1. 5. 5 G-25柱脫鹽

選擇葡聚糖凝膠G－25粗填料，將反相柱洗脫樣品上樣，用含150 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘氨酸( pH 4．0)的緩沖液置換，收集目的樣品，凍存于－70℃．

1. 6 rhTGF-β1的鑒定

1. 6. 1質(zhì)譜法測(cè)定分子質(zhì)量

采用MALDI－TOF MS測(cè)定rhTGF－β1分子質(zhì)量，基質(zhì)為α－氰基－4－羥基肉桂酸(α－cyano－4－h(huán)ydroxy－cinnamic acid，HCCA，C10H7NO3，相對(duì)分子質(zhì)量為189．17)．

1. 6. 2氨基酸序列分析

采用Edman降解法測(cè)定rhTGF－β1的N端15個(gè)氨基酸序列，N端蛋白序列分析儀自動(dòng)顯示測(cè)序峰．

1. 6. 3生物學(xué)活性檢測(cè)

將收集的培養(yǎng)液上清通過1．5小節(jié)所述的純化手段獲得高純度的rhTGF－β1樣品，水貂肺上皮細(xì)胞以2 ×105/mL鋪板，體積100 μL，細(xì)胞稀釋培養(yǎng)基與樣品稀釋培養(yǎng)基均為DMEM+1%FBS，rhTGF－β1標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均以50 ng/mL上板，2．5倍梯度稀釋，共10個(gè)梯度．樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，加入3－( 4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽( MTT)溶液20 μL，37℃放置4 h，加入150 μL細(xì)胞裂解液吹打混合均勻，于酶標(biāo)儀讀取570 nm和630 nm吸光值．根據(jù)樣品生物學(xué)活性=E×( C1/C)×( D1/D) (其中，E為標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)( IU/ mL)，D1為樣品預(yù)稀釋倍數(shù)，D為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)，C1為樣品半效稀釋度，C為標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋度)，計(jì)算rhTGF－β1的生物學(xué)活性．

2結(jié)果

2. 1重組質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1的構(gòu)建和鑒定

將pGH－TGF－β1質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)和改造型pOptiVec載體分別用BamHⅠ、NotⅠ進(jìn)行雙酶切，回收連接，獲得重組質(zhì)粒pOptiVec/TGF-β1，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取3個(gè)單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后通過BamHⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)鑒定均為陽性克隆(圖2)，證明TGF-β1片段已經(jīng)成功插入到pOptiVec載體中．取2號(hào)質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期相符．

圖2陽性克隆酶切鑒定電泳圖譜Fig．2 Positive colony verification by restriction enzyme digestion

2. 2 rhTGF-β1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得

初期篩選均采用不含HT的DMEM+10%FBS培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2周左右開始，在顯微鏡下觀察可以陸續(xù)看到明顯的細(xì)胞克隆形成;同時(shí)，未轉(zhuǎn)染rhTGF－β1表達(dá)質(zhì)粒的CHO/dhfr－細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤( hypoxanthine)、胸腺嘧啶( thymidine)的外部供給已經(jīng)全部死亡．共進(jìn)行了3次MTX加壓篩選，梯度依次為100，1 000和2 000 nmol/L．最后獲得2株穩(wěn)定表達(dá)TGF－β1的細(xì)胞株．

2. 3 rhTGF-β1的純化及終產(chǎn)品的純度

依據(jù)目的蛋白得率、純度、工藝穩(wěn)健性等指標(biāo)確定rhTGF－β1純化工藝路線．rhTGF－β1發(fā)酵上清經(jīng)各步層析，目的峰均能與雜質(zhì)峰有效分離，通過4步純化，得率＞25%．

經(jīng)多步純化獲得的rhTGF－β1采用SDS－PAGE法測(cè)定樣品電泳純度．由于rhTGF－β1是同源二聚體，純化樣品分別用和不用二硫蘇糖醇( DTT)還原處理，上樣量5 μg( 100%)，控制樣品分別上樣150 ng( 3%)、50 ng( 1%)，電壓100～200 V，銀染，掃描分析電泳結(jié)果(圖3)．電泳分析顯示，純化后樣品經(jīng)DTT還原處理分子質(zhì)量在14 ku左右(理論值為12．7 ku)，應(yīng)為單體的rhTGF－β1;純化后樣品未經(jīng)DTT還原處理分子質(zhì)量在30 ku偏下(理論值為25 ku)，應(yīng)為二聚體的rhTGF－β1．圖中150 ng( 3%)的蛋白條帶亮于目的樣品的雜質(zhì)帶，說明rhTGF－β1的雜質(zhì)含量＜3%，即rhTGF－β1的電泳純度＞97%．

圖3 rhTGF－β1純化樣品SDS－PAGE檢測(cè)Fig．3 SDS－PAGE analysis of rhTGF－β1 purified sample

2. 4 rhTGF-β1的分子質(zhì)量及N端氨基酸序列

采用測(cè)定MALDI－TOF MS測(cè)定rhTGF－β1分子質(zhì)量為25．470 ku，與理論分子量一致，結(jié)果見圖4．

圖4 rhTGF－β1純化樣品質(zhì)譜檢測(cè)Fig．4 Mass spectrum of rhTGF－β1 purified sample by MALDI－TOF MS

經(jīng)N端氨基酸序列測(cè)定，rhTGF－β1樣品N端15個(gè)氨基酸殘基序列為ALDTNYXFSSTEKNX(因Cys不能直接觀察到，用X表示)，測(cè)序結(jié)果與理論的TGF－β1蛋白N端氨基酸序列一致．

2. 5 rhTGF-β1活性的檢測(cè)

以R＆D rhTGF－β1為標(biāo)準(zhǔn)品，采用MV－1－Lu細(xì)胞抑制法測(cè)定純化獲得的rhTGF－β1樣品，四參數(shù)回歸計(jì)算法處理檢測(cè)數(shù)據(jù)，半數(shù)有效劑量( ED50)約為0．5 ng/mL，比活為3．2×107IU/mg，與R＆D標(biāo)準(zhǔn)品活性相當(dāng)(圖5)，說明通過CHO/dhfr－細(xì)胞表達(dá)的rhTGF－β1是有活性的．

圖5 rhTGF－β1活性測(cè)定曲線Fig．5 Curve of rhTGF－β1 activity test

3討論

本研究中我們構(gòu)建了pOptiVec/TGF-β1重組質(zhì)粒．pOptiVec (改造)載體是采用T4連接酶將pOptiVec－Topo載體( Invitrogen公司)自連形成的．與常規(guī)使用的真核載體pSV2－dhfr載體比較，pSV2－dhfr載體目的基因和DHFR基因分別由不同的啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選的克隆有可能只整合了DHFR基因造成假陽性;應(yīng)用pOptiVec載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時(shí)有利于陽性克隆篩選，有MTX抗性的細(xì)胞均為陽性細(xì)胞株．

另外，我們采用CHO/dhfr－細(xì)胞進(jìn)行rhTGF－β1的表達(dá)，CHO/dhfr－細(xì)胞自身缺失DHFR［6］，無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤( hypoxanthine)、胸腺嘧啶( thymidine)和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活．通過目的基因與DHFR基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，更為重要的是由于DHFR可被葉酸類似物MTX所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，DHFR基因必須擴(kuò)增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細(xì)胞系，又由于與DHFR基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細(xì)胞染色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著DHFR基因的擴(kuò)增而擴(kuò)增，我們就得到了能大量表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞克隆，將rhTGF－β1的表達(dá)量由常規(guī)的μg/L級(jí)別提高到mg/L．此外，本研究采用的純化工藝［7］獲得的純化樣品了純度＞97%，得率＞25%，且經(jīng)質(zhì)譜、蛋白N端測(cè)序鑒定和活性檢測(cè)，結(jié)果均符合TGF－β1質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)．

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Expression，Purification and Bioactivity Assay of Recombinant Human Transforming Growth Factor-β1 in CHO/dhfr－Cell

LIU Chunfeng1，ZHANG Ning2，ZHOU Ting2，WANG Shiyuan2，CHEN Qingxi1

( 1．School of Life Science，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2．Xiamen Amoytop Biotechnique Company，Xiamen 361022，China)

Abstract:By CHO/dhfr(－)efficient expression，recombinant human transforming growth factor－β1 was conducted in a 14 L cell fermentation tank，and the expression quantity reached 3 mg/L．The purity of rhTGF－β1 was more than 97% with column chromatography method，and the yield was above 25%．Additionally，MALDI－TOF MS and N－terminal protein sequence analyzer were used to analyze its molecular weight and N－terminal sequence，and the activity was determined using MV－1－Lu( NBL－7) cell growth inhibition assay．The results showed that rhTGF－β1 activity was more than 3．2×107IU/mg．This study realized the efficient expression of rhTGF－β1 in CHO/dhfr(－)，and the purified rhTGF－β1 sample by our methods were conformed to the standard of "China pharmacopoeia"，which provided the basis for industrialized production of rhTGF－β1．

Key words:transforming growth factor－β1; expression; purification

*通信作者:chenqx@ xmu．edu．cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃( 863計(jì)劃) ( 2007AA021604)

收稿日期:2015－01－09錄用日期: 2015－02－14

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．012

中圖分類號(hào):Q 356．1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0438－0479( 2016) 01－0067－05

引文格式:劉春鳳，張寧，周婷，等．重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在CHO/dhfr－細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和純化［J］．廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，55( 1) : 67－71．

Citation: LIU C F，ZHANG N，ZHOU T，et al．Expression，purification and bioactivity assay of recombinant human transforming growth factors－β1 in CHO/dhfr－cell［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2015，55( 1) : 67－71．( in Chinese)