餐飲肉制品中沙門氏菌檢測的方法研究

周春紅李羽翡2

（1.甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 2.甘肅省食品檢驗研究院）

餐飲肉制品中沙門氏菌檢測的方法研究

周春紅1李羽翡2

（1.甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心 2.甘肅省食品檢驗研究院）

采用GB 4789.4－2010、SN0170-1992、ISO6579-2002 、VIDAS、VITEK、API20E六種方法對20個餐飲現(xiàn)做肉制品中沙門氏菌進行檢測，其結(jié)果: 6種方法均檢出沙門氏菌，但檢出率略有差別。相比較沙門氏菌在XLD 和BS培養(yǎng)基上生長較好，且BS培養(yǎng)基的選擇性高于其他培養(yǎng)基。API 20E在檢測步驟、時耗、效率上優(yōu)于三種標準方法，其與VITEK的檢測結(jié)果較為詳細。VIDAS在增菌后不需要分離純菌，只需50min 即可出結(jié)果，但陽性結(jié)果并不是最終結(jié)果，需結(jié)合其他檢驗方法確證。

沙門氏菌 方法 比較

前言

沙門氏菌是一類桿狀、不產(chǎn)芽孢、兼性厭氧的腸桿菌科革蘭陰性菌，大多可運動、在自然界分布廣泛，通過寄生于動物糞便及腸道內(nèi)容物來傳播，污染食品［1］。生鮮肉、蛋、乳制品最易受沙門氏菌污染。沙門氏菌病是導(dǎo)致食源性疾病的最主要病原體之一，而且是導(dǎo)致食源性疾病暴發(fā)的最主要原因［2-8］。近年來，關(guān)于沙門氏菌檢測的相關(guān)研究有很多［9-13］，但是歸納比較多個方法的文章還很欠缺，本文同時采用六種方法［14-17］對20個餐飲肉樣品進行處理，結(jié)合實際比較六種方法的優(yōu)缺點，對于沙門氏菌檢測研究具有指導(dǎo)意義。

1、材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 標準菌株: 鼠傷寒沙門氏菌ATCC49416

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑: BPW（緩沖蛋白胨水）、TTB（四硫黃酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)）、SC(亞硒酸鹽胱氨酸增菌液)、BS（亞硫酸鉍瓊脂）、XLD（木糖-賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂）、HE（Hektoen Enteric 瓊脂）、DHL（膽硫乳瓊脂）、TSI（三糖鐵培養(yǎng)基）、PCA（平板計數(shù)瓊脂）、NA (營養(yǎng)瓊脂)、沙門氏菌生化試鑒定套餐等均產(chǎn)自北京陸橋生物科技有限公司；丹麥SSI沙門氏菌血清（206種）；RVS肉湯、MKTTN肉湯、VIDAS專用SLM試劑盒、API 20E專用RAPID ID 32 E（腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條）及VITEK2 COMPACT GN 試劑卡由法國生物梅里埃公司提供。

1.1.3 樣品由不同餐飲點隨機抽取：椒麻雞(3),咸水鴨（3），醬鹵肉（6），手抓羊肉（4），牛腱子（4）

1.2 儀器設(shè)備

VIDAS（法國生物梅里埃公司）；VITEK 2 COMPACT（法國生物梅里埃公司）。

1.3 實驗方法

GB 4789.4－2010、SN0170-1992、ISO6579-2002均按方法規(guī)定的程序操作；VIDAS、VITEK、API20E按生物梅里埃公司相應(yīng)的沙門氏菌檢測方案進行。

1.4 測試步驟

1.4.1 GB4789.4-2010:無菌操作將25g(ml)樣品加入225mL緩沖蛋白胨(BPW)水，均質(zhì)后37℃培養(yǎng)18h，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，42℃培養(yǎng)24h。同時，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10 mLSC內(nèi)，37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后分別取增菌液1環(huán)，畫線于BS瓊脂平板和XLD(或HE)瓊脂平板，BS于37℃培養(yǎng)48h，XLD或HE培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24h，自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落后進行TSI、賴氨酸、NA、靛基質(zhì)、尿素(PH7.2)和KCN實驗。

1.4.2 SN0170-1992: 無菌操作將25g(ml)樣品加入225mL緩沖蛋白胨(BPW)水中，均質(zhì)后(pH調(diào)至6.8)于37℃培養(yǎng)4h，移取10mL，轉(zhuǎn)種于100 mLTTB內(nèi)，42℃培養(yǎng)20h。同時，另取10mL 前增菌液加入到100mLSC中，37℃，培養(yǎng)24h進行選擇性增菌。無菌操作，用直徑3mm的接種環(huán)分別挑取搖勻的培養(yǎng)液1環(huán)，畫線于表面無凝結(jié)水的BS和DHL平板各一個，于37℃培養(yǎng)24h，每個瓊脂平板至少應(yīng)挑選2個典型或可疑菌落進行TSI、賴氨酸、NA、靛基質(zhì)、尿素( pH7.2) 和KCN實驗。

1.4.3 ISO6579-2002：37℃培養(yǎng)18h的1mL BPW增菌液加入10mLRVS肉湯41.5℃培養(yǎng)24h；1mLBPW增菌液加入10mL MKTTN肉湯37℃分別培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后分別取增菌液1環(huán)，畫線于XLD瓊脂平板和HE瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，后挑取2個以上典型或可疑菌落后進行TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、吲哚實驗。

1.4.4 API20E方法：使用梅里埃/RAPID ID 32E（腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條），配制菌懸液后接種于試劑條，于37℃培養(yǎng)24h，由API LAB Plus軟件說明表判讀鑒定結(jié)果。

1.4.5 VIDAS方法:取樣、前增菌、增菌步驟同GB方法，后按照全自動食品致病菌檢測方案檢測步驟操作，先水浴加熱15min，冷卻后取500μL于沙門配套檢測試劑條SLM配套SPR管進行操作，50min后自動打印鑒定結(jié)果。

1.4.6 VITEK:配制0.5-0.63麥氏單位菌懸液，充填到GN卡內(nèi)，封口后放入測試槽內(nèi)，按儀作規(guī)程裝載卡片，6～10h后儀器自動生成鑒定結(jié)果。

2、結(jié)果

2.1 采用GB4789.4-2010進行實驗

在20個肉樣品中，禽肉檢出2例，羊肉中檢出1例，牛肉中未檢出，豬肉中檢出1例，檢出率20%，且經(jīng)生化及血清分析判斷為腸炎沙門氏菌。共有六種不同情況的菌落形態(tài)：

表1 不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征結(jié)果

BS瓊脂 無可疑菌落XLD瓊脂 無可疑菌落陽性對照5 BS瓊脂 棕褐色菌落有金屬光澤黃色菌落

將每個樣品自對應(yīng)的選擇性瓊脂平板上分別挑取3個典型菌落進行三糖鐵瓊脂斜面畫線及底層穿刺實驗:

表2 三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果

將每個樣品進行蛋白胨水、尿素、氰化鉀生化反應(yīng)實驗，結(jié)果見表:

表3 生化反應(yīng)結(jié)果

血清學(xué)鑒定在玻片上劃出2個區(qū)域，挑取待測菌后分別加多價菌體（O）抗血清、加多價菌體（H）抗血清和生理鹽水對照。充分搖動混合1min，對著黑色背景觀察結(jié)果:

表4 血清學(xué)鑒定結(jié)果

血清學(xué)分型：用O抗血清、H抗血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。用Vi抗原的鑒定用Vi因子血清檢查，均為陰性, 結(jié)果見表:

表5 O抗原、H抗原鑒定結(jié)果

菌型的判定：鑒定結(jié)果見表10根據(jù)血清學(xué)分型鑒定結(jié)果，按沙門氏菌屬抗原表判定結(jié)果見表:

表6 菌型判定結(jié)果

2.2 SN0170-92 法檢測結(jié)果

20個肉樣品中，禽肉檢出2例，羊肉中未檢出，牛肉中未檢出，豬肉中檢出1例，檢出率15%，TTB、SC增菌的樣品在DHL平板、BS平板上培養(yǎng)，鑒定結(jié)果如下：

表7 菌型、生化及血清判定結(jié)果

2.3 ISO6579-2002：

1.4.1 癥狀積分 陰道炎的癥狀主要有外陰瘙癢或紅腫、陰道充血、白帶增多或異味等。按照陰道炎的嚴重程度分為0～3分的等級，其中3分說明有嚴重的陰道炎癥狀，2分說明有中度的陰道炎癥狀，1分說明有輕微的陰道炎癥狀，0分說明無陰道炎癥狀。在治療前后，評價陰道癥狀的總積分，積分越高說明越嚴重[3]。

20個肉樣品中，禽肉檢出2例，羊肉中檢出1例，牛肉中未檢出，豬肉中檢出1例，檢出率20%。RVS/MKTTN增菌的樣品在XLD平板、HE平板上培養(yǎng)，鑒定結(jié)果如下：

表8 菌型、生化及血清判定結(jié)果

2.4 VIDAS 法

VIDAS 是利用酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)(ELIFA)原理，通過固相吸附器，包被針上有抗體包被，用已知抗體來捕捉目標生物體，所測得的熒光與標本中抗原的含量成正比。本實驗檢測完成后，結(jié)果由計算機自動分析判定，檢測閾值為0.23，本實驗絕大部分樣品值＜0.23，判定為沙門氏菌陰性；但個別樣品及陽性對照值＞0.23，判定為沙門氏菌陽性。本實驗20個肉樣品中，禽肉檢出2例，羊肉中檢出1例，牛肉中出1例，豬肉中檢出1例，檢出率25%。

2.5 API 20E 試條中的生化反應(yīng)結(jié)果

API 20E的鑒定結(jié)果見附表。API LAB軟件分析結(jié)果%id=99.9。本實驗20個肉樣品中，禽肉檢出2例，羊肉中檢出1例，牛肉中未檢出，豬肉中檢出1例，檢出率20%。

表9 API 20E 試條判定結(jié)果

2.6 VITEK

3、分析與討論

在20個肉樣品中，方法SN0170-1992檢出率3例，方法GB 4789.4－2010、ISO6579-2002 、VITEK、API20E檢出率4例，VIDAS檢出5例，但有1例樣品經(jīng)生化鑒定不是沙門氏菌屬。分析原因，推測SN0170-1992方法中前增菌時間短，且DHL培養(yǎng)基選擇性不強，所以漏檢。此外除VIDAS方法外其他方法均需純菌培養(yǎng)，在BS、XLD平板上挑菌時，由于個人經(jīng)驗習(xí)慣，也可能存在漏挑不典型菌落。VIDAS基于酶聯(lián)免疫技術(shù)原理，通過對菌體脂多糖和鞭毛蛋白抗原的鑒別區(qū)分菌種，因此不存在漏檢，但可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

沒有任何一種培養(yǎng)基可以保證所有食品基質(zhì)或各種沙門氏菌血清型正常生長，因此本文采用的幾個標準方法均是同時使用兩種或兩種以上培養(yǎng)基進行平行實驗，以減少假陰性結(jié)果。相比較，沙門氏菌在BS和XLD培養(yǎng)基上生長狀態(tài)比較好，且BS培養(yǎng)基的選擇性高于其他培養(yǎng)基。沙門氏菌標準檢驗方法檢測過程復(fù)雜、周期長，需要多種試劑，成本較低，對檢測者要求有豐富的檢測經(jīng)驗。

VITEK儀器成本高，比傳統(tǒng)方法節(jié)省約三分之一的時間，其與API20E生化實驗上做到了微型化和集約化，檢測結(jié)果更精確，步驟簡單、時耗少、效率高；API20E基于半自動操作，成本低，易推廣。VIDAS在50min左右可完成沙門氏菌的測定。檢測快速、靈敏度、全自動、高通量，適合于大批量致病性微生物的快速篩選，但成本高，且陽性樣品需確證，不能直接判定并定量。以下是幾種方法的比較：

表10 六種方法的比較

結(jié)果顯示，沙門氏菌在餐飲肉制品中污染比例較高，占20%，且禽肉中檢出比例最高。推測原因是沙門氏菌的二次污染引起。盡管食品經(jīng)過清洗、熱處理大部分微生物已被滅活后才使用，但即食食品在加工過程中與受污染器械、餐具、帶菌人員接觸，或成品后與生鮮食品、帶菌肉類混合儲存等環(huán)節(jié)均可能再次染菌。

食品樣品檢驗數(shù)量大，檢驗流程復(fù)雜，檢驗周期長一直是影響檢驗效率低的重要原因，在重大餐飲保障任務(wù)或節(jié)假日餐飲安全任務(wù)中為了保證全面、大規(guī)模的篩查應(yīng)當先進行檢品陽性初篩，這樣不僅提高檢驗效率，還防止漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。通過判斷，避免食品安全事故發(fā)生，提高食品監(jiān)管部門應(yīng)急處置突發(fā)事件的能力，將可能波及人員范圍、事件影響程度降低到最低點，切實保障廣大人民群眾的利益，為餐飲食品監(jiān)管提供科學(xué)、有效的依據(jù)；為加強食品安全的公共教育和宣傳,增強全社會的食品安全意識,促進食品安全誠信體系建設(shè)奠定基礎(chǔ)［18-19］。

［1］Ray B，Bhunia A． 基礎(chǔ)食品微生物學(xué)［M］．4 版．江漢湖，譯． 北京: 中國輕工業(yè)出版社，2014: 264-270．

［2］吳雙志，劉洋，胡鋒，等．2011-2013 年牡丹江市食品中沙門氏菌的分布調(diào)查［J］．醫(yī)學(xué)動物防制，2015，31( 9):1005-1007．

［3］尹明遠，張曉燕，艾乃吐拉，等．2010-2012年新疆烏魯木齊地區(qū)零售生肉中沙門菌污染情況調(diào)查［J］．中國食品衛(wèi)生雜志，2014，26(2):172-175．

［4］張文宇，杜雄偉，岳威威．大連地區(qū)食源性沙門氏菌耐藥性檢測［J］．畜牧獸醫(yī)科技信息，2014(2):35-36．

［5］孫吉昌，游興勇，曾艷兵，等．2009年至2011年江西省食品中沙門菌污染狀況調(diào)查［J］．實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012,(2):126-129.

［6］琪木格．八類食品中沙門氏菌污染狀況分析［J］．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2012，44（2）：F3．

［7］吳林海，王建華，朱淀，等．中國食品安全發(fā)展報告: 2013［M］．北京: 北京大學(xué)出版社，2013: 2-500．

［8］陳玲，張菊梅，楊小鵑，等．南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型［J］．微生物學(xué)報，2013，53( 12) : 132-1333．

［9］山珊，牛瑞江，賴衛(wèi)華，等.免疫磁珠法富集沙門氏菌的優(yōu)化及應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2013( 13) : 153-156.

［10］杜雄偉，李葉，冮潔，等.肉制品中沙門氏菌invA 基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.食品工業(yè)科技，2013，12:68-70，80.

［11］李杜娟.食品沙門氏菌檢測方法的發(fā)展［J］.河南科技，2011( 5) : 69-70.

［12］俞慕華，鞠長燕，陳輝，等.能力驗證實驗中沙門菌分離與鑒定［J］.中國衛(wèi)生工程學(xué)，2012( 5) : 424-426.

［13］張賢群(譯) ，李震(校)．美國和歐洲的沙門氏菌污染控制經(jīng)驗:成功與改進［J］．國外畜牧學(xué): 豬與禽，2014，34( 11): 43-44．

［14］食品安全國家標準．沙門氏菌檢驗，GB4789.4-2010[S]．

［15］中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準.出口食品沙門氏菌屬(包括亞利桑那菌)檢驗方法,SN0170-1992[S].中國標準出版社出版，1992.

［16］法國生物梅里埃公司. VIDAS 全自動食品致病菌檢測方案［M］.上海長源科學(xué)技術(shù)有限公司，2002，1: 1-4.

［17］ISO 6579-2002 ［S］. Microbiology of Food and Animal Feeding stuffs-Horizontal Method for the Detection of Salmonella spp，2002，2.Comparison.

［18］胡建國．我國餐飲業(yè)食品安全現(xiàn)狀及控制方法與措施［J］．輕工科技，2012，(9)：131-135．

［19］徐瀟，甘辛，崔生輝，等．我國餐飲服務(wù)食品中致病菌污染及檢驗現(xiàn)狀分析［J］．中國藥事，2012，(6)：545-547．

Comparison of the Detection Results of Salmonella in Restaurant Meat Samples by 6 Kinds of Methods

Salmonella was tested in twenty restaurant meat samples by GB4789.4-2010、SN0170-1992、ISO6579-2002 、VIDAS、VITEK and API20E respectively. Every methods can detect salmonella in meat sample but detect rate is slightly different. It was proved that Salmonella grew better on XLD and BS while BS had better selectivity than others. API 20E need less time and is efficient than other standard analysis methods. VIDAS don't need to separate pure bacteria and just need 50 min to have the results. The positive result of VIDAS is not the final result and the result need to be confirmed by other analysis methods.

Salmonella Methods Comparison

甘肅省自然科學(xué)基金項目（1606RJZA210 ）