斑馬魚在發(fā)育毒理學中應用的安全性評估

歐陽鳳

（河南工學院 河南新鄉(xiāng) 453003）

斑馬魚在發(fā)育毒理學中應用的安全性評估

歐陽鳳

（河南工學院 河南新鄉(xiāng) 453003）

目前，斑馬魚胚胎已經被廣泛應用于發(fā)育毒理學研究領域，并取得顯著的研究成果。在胚胎發(fā)育的致畸、致死原因中，以血管、心臟和神經發(fā)育的研究最為廣泛。斑馬魚在血管、心臟和神經發(fā)育這幾個領域研究中的應用處于起步階段，本文主要分析總結斑馬魚胚胎在血管、心臟和神經發(fā)育毒理學研究中的應用。

斑馬魚 胚胎發(fā)育 毒理學 應用

在發(fā)育毒理學研究領域中，小鼠、爪蟾、斑馬魚等都是較為常用的動物。雖然小鼠在現代遺傳學研究中發(fā)揮出重要作用，但由于小鼠的胚胎位于母體子宮深處，因此在研究中無法實現發(fā)育過程的動態(tài)觀察。爪蟾是胚胎學研究的良好對象，但由于繁殖較慢，其應用存在時間限制。這就表明上述模型動物不適用于發(fā)育毒理學的研究。斑馬魚由于個體小、周期產卵，且產卵周期短、產卵量高、卵大、體外受精、體外發(fā)育等特點被廣泛應用于胚胎學、發(fā)育生物學、分析生物學、毒理學等領域的研究中，被喻為是較為理想的研究型脊椎動物，具有很高的科研價值和應用前景。對于發(fā)育早期胚胎發(fā)育的研究，斑馬魚的應用具有顯著優(yōu)勢，有利于促進有關早期胚胎發(fā)育調控事件的研究進展。

1　斑馬魚的生物學特征

斑馬魚俗稱花條魚、藍條魚、斑馬擔尼魚，隸屬鯉科、短擔尼魚屬。斑馬魚起源于印度，是一種小型的熱帶魚類，染色體數目為50，成體長約3～4cm，孵出后約3個月能夠成熟。成熟的雌魚每隔一周可產幾百粒卵子。卵子均為體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育同步，且速度快，良好發(fā)育的溫度為25～31℃［1］。細胞培養(yǎng)是獲得毒理機制信息的有效途徑，其缺陷是無法反映體內細胞的自然環(huán)境。采用生物有機體配合基因功能操作，能夠快速有效地獲得毒性機制。如果運用哺乳動物作為模型，則會增加研究成本，不利于大規(guī)模的實驗研究，在此情況下斑馬魚顯現出巨大的優(yōu)勢。斑馬魚胚胎的透明性和體外發(fā)育是其最大優(yōu)勢，有利于對胚胎毒性和畸形效應的動態(tài)研究。在德國，斑馬魚胚胎已經成為水質監(jiān)測的標準模式生物，取代傳統(tǒng)運用成魚進行毒理學試驗的研究，充分發(fā)揮出斑馬魚的應用價值。

2　斑馬魚作為毒理模式動物的優(yōu)勢

相比于哺乳動物胚胎，斑馬魚胚胎作為發(fā)育毒理學的模式動物具有以下優(yōu)勢：

2.1胚胎取材方便

性成熟的斑馬魚在光刺激的環(huán)境下能夠影響其交配行為，主要利用適當的調節(jié)光周期，或合理控制雌魚和雄魚的接觸時間，就能有效控制斑馬魚的產卵時間，其中一尾雌魚平均一次能夠產100～300枚卵，在這種高產量下一天可以獲得足夠的斑馬魚胚胎，目前還沒有一種哺乳動物具有如此高的排卵量。受精卵的保存主要采用96孔板，有效節(jié)約保存成本和空間，這位大量的試驗研究提供方便的取材，促進高通量研究的順利進行。

2.2胚胎發(fā)育迅速

斑馬魚的良好發(fā)育溫度為25～31℃，在此環(huán)境下受精后，胚胎會于40min后完成首次分裂，接著每15min逐漸完成每一次的分裂。經24小時胚胎中斑馬魚的腦室、眼睛、耳朵等器官及細胞均能顯著呈現出來，這1小時的發(fā)育相當于人類1個月的胚胎發(fā)育［2］。

2.3易于觀察操作

斑馬魚的胚胎主要在體外發(fā)育，胚胎具有較高的透明度，這種特點方便對其發(fā)育過程及影響因素的觀察。試驗研究可以動態(tài)觀察胚胎發(fā)育的過程，例如運用示蹤標記的方法動態(tài)觀察某個基因的時空表達情況。斑馬魚受精卵的直徑約為1mm，這為顯微注射和細胞移植等操作提供有利條件，除此以外，在后期胚胎上還能夠運用基因調控技術、全胚胎表達圖譜和胚胎原位雜交技術等，為多個系統(tǒng)的發(fā)育、功能和疾病研究提供模型。

3　斑馬魚在發(fā)育毒理學中應用

3.1斑馬魚胚胎在血管發(fā)育毒理學研究中的應用

血管發(fā)生和血管生成是斑馬魚血管發(fā)育的兩個重要過程，其中血管發(fā)生是指內皮細胞前體進行分化，并初步形成血管；血管發(fā)育是指初步形成的血管內皮細胞逐漸發(fā)芽，并形成新的毛細血管。血管內皮生長因子（VEGF）主要作用于血管內皮細胞，并對血管生長調控起到良好作用。目前研究主要集中于對斑馬魚VEGF-A的試驗研究，VEGF-A具有促進斑馬魚胚胎血管發(fā)生、生長、造血等作用。

首先，斑馬魚能夠在短時間內形成完整的循環(huán)系統(tǒng)，縮短試驗所需時間，提高研究效率。其次，斑馬魚在剛開始發(fā)育時期能夠充分運用氧氣的被動擴散完成呼吸，不需要任何功能性的心血管系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，這相比與哺乳動物其胚胎的成活率更高，這就表明斑馬魚胚胎更加適合研究心血管系統(tǒng)早期發(fā)育缺陷和發(fā)育關鍵基因功能等。第三，斑馬魚可以作為外源化學物導致心血管系統(tǒng)畸形研究的模式動物。例如在乙醇的血管發(fā)育毒性研究領域，研究發(fā)現［3］給予斑馬魚胚胎乙醇，胚胎底索分泌的Ang-1和Radar等血管生成因子顯著減少，從而影響DA的形成穩(wěn)定性，這表明乙醇會影響斑馬魚底索的發(fā)育。第四，斑馬魚胚胎的血管發(fā)育毒性研究對于臨床藥物安全性的評價具有顯著意義。例如在抗血管生成藥物的助溶劑研究中，分別采用二甲基亞砜、丙酮、甲醇、異丙醇有機溶劑處理斑馬魚胚胎，結果顯示，二甲基亞砜、丙酮適宜濃度小于等于0.1%，甲醇適宜濃度小于等于1%，異丙醇并不能適用于斑馬魚的抗血管生成，有利于抗腫瘤藥物有機助溶劑的篩選。另一項研究證實了抗癌藥物力達霉素對斑馬魚胚胎血管生成具有顯著的抑制作用。最后，斑馬魚血管具有透明性，能夠動態(tài)觀察胚胎中血流動力學參數，便于觀察斑馬魚發(fā)育的整個過程，這對于獲取毒理學實驗數據具有顯著優(yōu)勢。例如研究給予斑馬魚胚胎不同濃度的咪唑安定，其中1mg·L-1的咪唑安定對胚胎血管發(fā)育無影響，10mg·L-1用量會引起體節(jié)間和尾部血管的發(fā)育受到抑制，20mg·L-1用量會造成發(fā)育停滯，這為咪唑安定藥物對血管毒性作用提供研究依據。

3.2斑馬魚胚胎在心臟發(fā)育毒理學研究中的應用

斑馬魚在發(fā)育過程中首先發(fā)揮作用的器官就是心臟，心臟控制循環(huán)功能。斑馬魚心臟的發(fā)育過程主要包括初始分化、出現心跳、血液循環(huán)、出現新光卷曲、心臟功能發(fā)育完全這幾個階段。心臟發(fā)育是一個復雜的過程，需要細胞增殖、遷移、分化及相互作用，還需要多個基因的表達和調控。斑馬魚胚胎心臟可以作為化學物毒性的靶器官，主要利用斑馬魚心臟的透明性進行動態(tài)觀察，也被廣泛應用于中藥的安全性評估、環(huán)境中有機污染物的心臟發(fā)育毒性的研究中。

首先，斑馬魚胚胎心臟應用于中藥的安全性評價。例如一項研究［4］將斑馬魚胚胎作為模型動物，研究中藥雷公藤紅素的心臟毒性，結果顯示，雷公藤紅素的毒性作用主要表現為心臟線性化、心膜出血、心區(qū)細胞堆積等不良反應，且斑馬魚的心率呈現下降趨勢。另一項研究給予斑馬魚中藥桔梗總苷，研究結果顯示斑馬魚的心率逐漸減緩，離子通道中的基因表達水平也顯著降低。其次，斑馬魚胚胎廣泛應用于環(huán)境持久性POPs的心臟發(fā)育毒性評價中。研究已經證實，“福美雙”殺菌劑的毒性主要表現在會引起心囊水中和心率下降，心臟發(fā)育毒性會隨著計量的變化而變化。一項研究［5］運用斑馬魚胚胎研究多環(huán)芳烴（PAHs）毒性，結果顯示多環(huán)芳烴的毒性表現具有多樣性，不同種類的PAHs的心臟發(fā)育毒性是不同的，但靶器官均為心血管系統(tǒng)。其中BAP的毒性作用主要表現為心動過緩、心包水腫、心肌細胞CYP1A顯著升高等，BKF的毒性作用表現為心包水腫、循環(huán)缺陷、房室回流受阻等，BEP的毒性標志為較低的CYP1A信號，其余無顯著心臟毒性和畸形發(fā)生。第三，斑馬魚胚胎應用于納米材料的心臟發(fā)育毒性研究中。一項研究給予斑馬魚胚胎納米銀、納米金和納米鉑處理，納米銀和納米鉑材料的毒性主要表現為心率降低，納米銀還會造成心臟畸形、循環(huán)障礙等，而納米金在處理實驗下沒有發(fā)現顯著的毒性作用，這將為環(huán)境保護提供參考數據。

3.3斑馬魚胚胎在神經發(fā)育毒理學研究中的應用

斑馬魚胚胎時期能夠觀察到一些運動行為，例如游動、逃避反射等，這些運動行為伴隨發(fā)育進程逐漸產生。其神經發(fā)育的過程重要表現為胚胎出現持續(xù)性的肌肉收縮、對于頭部刺激能夠快速轉動尾巴、對于機械刺激能夠游動、游動速度達到最大、對觸覺表現出成熟的逃避反射，這些行為學發(fā)育特點是神經發(fā)育毒性研究的重要參考。

有于斑馬魚胚胎具有顯著的透明性，因此其模型動物主要適用于常規(guī)檢測方法中，并將細胞、分子及遺傳學等方法相結合，對神經發(fā)育毒性進行研究和評價。國外研究運用7種化學物質研究斑馬魚胚胎的神經發(fā)育毒性，發(fā)現斑馬魚行為學是一種較為簡單并能夠分析神經整合功能的方法，逐漸形成多種實驗模型。國內一項研究［6］觀察二氫葉酸還原酶基因對斑馬魚胚胎顱腦發(fā)育情況的影響，結果發(fā)現對顱腦發(fā)育產生較大的影響。另一項研究表明，下調原鈣粘附蛋白18（PCDH18）基因對斑馬魚的神經系統(tǒng)發(fā)育產生影響，其中PCDH18a和PCDH18b均參與中樞神經系統(tǒng)發(fā)育的全過程。國外研究還運用斑馬魚胚胎作為重金屬、農藥等環(huán)境毒物對神經系統(tǒng)毒理機制的研究模型，研究發(fā)現，將斑馬魚胚胎早期暴露與鎘環(huán)境中，會引起小腦發(fā)育不全，毒性病理基礎為小腦畸形和中后腦分界不清晰等；鉛污染在斑馬魚胚胎神經發(fā)育中也具有顯著的毒性，可以引起游動或行動遲緩等，這都將為金屬鎘對哺乳動物神經發(fā)育的毒性研究提供參考依據。除此以外，面對當前日益研究的環(huán)境污染問題，斑馬魚胚胎能夠廣泛應用于重金屬、有機農藥等毒性研究中，為高等脊椎動物的生長環(huán)境研究提供有效幫助，為環(huán)境監(jiān)測發(fā)揮出積極作用。

4　結語

斑馬魚由于自身明顯的優(yōu)勢，已經逐漸成為發(fā)育毒理學研究中廣泛應用的脊椎動物模型，并有效促進發(fā)育毒理學研究進展的加快。本文從血管、心臟和神經發(fā)育系統(tǒng)出發(fā)，分析總結斑馬魚胚胎在實驗研究中的應用。但斑馬魚模型也存在一定的局限性，這是由于斑馬魚胚胎、幼魚和成魚之間存在差異，在化學篩選過程中要在不同生長階段進行藥物實驗，因此會造成結果的不明確；其次，斑馬魚具有親水性和親脂性，無法吸收疏水性小分子化合物，因此在篩選化學物時要注意斑馬魚皮膚問題，加強實驗驗證的準確性和科學性，促進斑馬魚在發(fā)育毒理學應用的安全性。

［1］于力群，王厚鵬，朱作言，等.生長激素/催乳素家族配體和受體成員在斑馬魚早期胚胎中的表達比較和交叉活性分析［J］.水生生物學報，2014（5）：809-818.

［2］于學慧，張世棟，張承梅. 發(fā)育生物學的理想動物模型——斑馬魚［J］.中國實驗動物學雜志，2001（3）：172-175.

［3］Asharani P V，Yi L，Zhiyuan G，et al.Comparison of the toxicity of silver，gold and platinum nanoparticles in developing zebrafish embryos.［J］.Nanotoxicology，2011（1）：43-54.

［4］李運彩，張松林，白芳銘，等.氯代苯和烷基酚類化合物斑馬魚毒性的定量構效關系分析［J］.南方水產，2010（3）：19-23.

［5］嚴麗鋒，顧愛華.利用斑馬魚胚胎進行發(fā)育毒理學研究的進展［J］.東南大學學報：醫(yī)學版， 2012， 31（3）：346-350.

［6］王蕊， 殷浩文.斑馬魚胚胎發(fā)育中適宜的毒理學指標分析［J］. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學，2004，21（2）：88-89.

R114

A

1674-2060（2016）05-0086-02

歐陽鳳（1976—），女，重慶人，碩士研究生，講師，研究方向：動物資源保護與利用。