擬南芥苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的研究進展

孫海燕，　全雪麗，　付　爽，　吳松權

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

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擬南芥苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的研究進展

孫海燕，全雪麗，付爽，吳松權*

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

摘要：苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化苯丙烷代謝途徑第1步反應的限速酶，廣泛地參與植物生長發(fā)育過程中的各種生理活動。本文概述了擬南芥PAL基因的分子生物學和生理學研究進展，主要包括PAL基因的結(jié)構、表達特性、調(diào)控機制及其參與的植物生理學的意義，為進一步闡明PAL基因的功能提供參考依據(jù)。

關鍵詞：擬南芥；苯丙氨酸解氨酶；表達；生理作用

苯丙烷代謝途徑是陸生植物生長和發(fā)育所必需的，是植物長期適應自然環(huán)境的結(jié)果[1-2]。苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1 5, PAL)催化L-苯丙氨酸(L-Phe)的非氧化脫氨基作用，生成肉桂酸，是生物合成苯丙烷類天然產(chǎn)物的第1步[3-4]，也是第1個被鑒定的植物“防御基因”[5]。也是苯丙烷類代謝途徑中研究最多的酶[6]。肉桂酸是植物生長、發(fā)育和環(huán)境適應所必需的各種苯丙烷類物質(zhì)的合成起始物[7]。苯丙烷類化合物是植物中大量酚類化合物的前體，包括木質(zhì)素、黃酮類、異黃酮類、香豆素、芪類和水楊酸等，它們在維持植物結(jié)構、抵御紫外線、形成花青素和植保素、保持花粉活力、信號轉(zhuǎn)導與交流等方面發(fā)揮著重要作用[1,5,8]。自1961年Koukol和Conn首次描述PAL以來，苯丙氨酸解氨酶得到了廣泛的研究[9]，它是控制苯丙烷途徑生物合成去向的關鍵酶和限速酶[7,10]。擬南芥是一種十字花科植物，廣泛用于植物遺傳學、發(fā)育生物學和分子生物學的研究，已成為一種典型的模式植物，該植物具有個體小、生長周期快、形態(tài)特征簡單、生命力強、基因組小、遺傳操作簡單等優(yōu)點[11-12]。通常PAL基因在植物中編碼小的基因家族[9]，苯丙氨酸解氨酶的同工酶負責苯丙烷途徑的不同分支途徑[10]，擬南芥有4個PAL同工酶，它們的表達受植物本身的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和環(huán)境脅迫所誘導[1-3,7-10]，本文主要介紹過去20多年來擬南芥植物4個PAL基因的分子生物學和生理學的研究進展，為進一步闡明PAL基因家族在擬南芥植物生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的功能提供參考依據(jù)。

1AtPAL的結(jié)構

Southern雜交[4]和基因組測序表明擬南芥基因組編碼4個不同的PAL基因[2-3,7,9]，分別是AtPAL1(AT2G37040)、AtPAL2 (AT3G53260)、AtPAL3 (AT5G04230),和 AtPAL4 (AT3G10340)[7]，分別定位于擬南芥5條染色體中的3條染色體上，AtPAL1定位于染色體Ⅱ，AtPAL2和AtPAL4定位于染色體Ⅲ，AtPAL3定位于染色體Ⅴ的端粒附近[9]。AtPAL編碼長度為2 100 bp左右，變化幅度為24～81 bp。其中，AtPAL1編碼長度為2 178 bp，AtPAL2編碼長度為2 154 bp，AtPAL3編碼長度為2 097 bp，AtPAL4編碼長度為2 124 bp。DNA序列分析表明，PAL基因家族分為2個亞族，AtPAL1和AtPAL2屬于1個亞族，AtPAL3和AtPAL4屬于另一個亞族，這種2+2方式可能是復制的結(jié)果，因為AtPAL1和AtPAL2一致性達90.4%，AtPAL3和AtPAL4一致性達83.5%。2個亞族間所含內(nèi)含子數(shù)目也不同，AtPAL1和AtPAL2中有1個內(nèi)含子，AtPAL3和AtPAL4中有2個內(nèi)含子，表明這2個亞族轉(zhuǎn)錄后加工的機制不同[9]。生物信息學分析表明，這4個AtPAL蛋白質(zhì)在氨基酸水平上具有≥74%的一致性[9]，所有AtPAL蛋白定位在細胞質(zhì)中并缺乏目標多肽序列[2]。

4個AtPAL的啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點上游500 bp處都存在所謂的PAL盒，AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3和AtPAL4分別具有4、3、1和4個PAL盒[13]。AtPAL1啟動子和AtPAL2啟動子存在4個盒1序列(或L盒)，而AtPAL3啟動子存在1個；AtPAL1啟動子存在3個盒2序列(或P盒)，而AtPAL2啟動子和AtPAL3啟動子各自存在1個；AtPAL1啟動子存在13個盒3(AC元件)序列，AtPAL2啟動子存在9個，而AtPAL3啟動子存在2個[5]。AtPAL4啟動子中存在A盒、H盒和G盒，但缺乏AC元件[14]。綜上所述，AtPAL1和AtPAL2不僅在結(jié)構上非常相似而且其啟動子元件也非常相似。

2AtPAL的基本特性

AtPAL原核表達分析表明，每1個AtPAL都具有獨特的催化活性[9]。AtPAL1, 2和4在低濃度(0.5～1 μg)時對L-苯丙氨酸(L-Phe)具有催化活性，而AtPAL3在高濃度(≥50 μg)時對L-Phe具有催化活性。4個酶最適pH值相近(8.4～9.2)，但所需的最佳反應溫度卻不同，相對于其它3個酶(46～48 ℃)，AtPAL3的最佳反應溫度較低(31 ℃)。AtPAL1，2和4對L-苯丙氨酸具有相似的米氏常數(shù)(64～71)，AtPAL2的催化效率最高。此外，AtPAL1，2和4對L-苯丙氨酸動力學曲線遵循典型的米氏方程。當L-酪氨酸(L-Tyr)為底物時，AtPAL1,2和4催化效率較低，而AtPAL3則沒有催化活性，因此，L-Phe才是AtPAL真正的生理學底物。這和預期結(jié)果一致，因為雙子葉植物PAL不能有效利用L-Tyr作為底物。順式和反式肉桂酸對AtPAL催化活性有不同的影響，因為順式肉桂酸是AtPAL1的競爭性抑制劑，而不是AtPAL2和AtPAL4的競爭性抑制劑，但是反式肉桂酸是AtPAL1,2和4的競爭性抑制劑[15]。

3AtPAL的表達特性

AtPAL的表達具有組織特異性和時空表達差異性。4個AtPAL在種子、幼苗、根、花序莖、葉、花以及角果中都表達，一般情況下AtPAL3表達水平較低[14]，且在幼苗及根中的表達水平最低[5]，在植物發(fā)育過程中，AtPAL1和AtPAL2表達方式非常相似，尤其是在根和花序莖中[4-5,7]。AtPAL1在幼苗發(fā)育早期[4,16]和成熟組織中激活，并且大量表達在根和葉的維管束組織中，但是在根尖或頂端分生組織中不表達[4]。AtPAL1在花的萼片、花藥和心皮中表達，但是在白色的無色素的花瓣中不表達[4]，而AtPAL2在花瓣和花藥中都不表達[7]。

4AtPAL的表達調(diào)控機制

AtPAL的表達調(diào)控機制復雜，它的表達不僅受到植物本身發(fā)育水平的調(diào)控，還受到非生物和生物因素的誘導。

4.1受植物本身發(fā)育水平的調(diào)控

AtPAL在擬南芥生長發(fā)育過程中的表達具有組織特異性，受發(fā)育的調(diào)控。AtPAL1在種植2 d的擬南芥幼苗中的表達量最高，之后隨著植物生長發(fā)育，表達量逐漸降低[4]。盡管AtPAL1的表達量比AtPAL2多，但它們在根、莖和葉中的表達方式卻相同，不過AtPAL3只在生長10 d的幼苗和成熟植物根中表達[5]。這應與基因結(jié)構有關，因為AtPAL1和AtPAL2啟動子區(qū)序列具有高度的相似性，而AtPAL3 啟動子區(qū)序列與AtPPAL1和AtPAL2啟動子區(qū)序列缺乏序列相似性[5]，且AtPAL1和AtPAL2編碼區(qū)的相似性大于它們與AtPAL3的相似性。在花序莖生長過程中(1～20 cm)，AtPAL1和AtPAL2的表達量持續(xù)增加；當花序莖逐漸生長到10 cm之后，AtPAL4的表達趨于穩(wěn)定；而AtPAL3的表達呈波動形式[14]。AtPAL2參與植株營養(yǎng)生長到生殖生長的整個過程中[7]；花芽發(fā)育中，AtPAL2在花芽發(fā)育初期到成熟階段都表達，而AtPAL1只在花芽發(fā)育的成熟階段表達[4,7]。另外，突變體分析表明，盡管AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3、AtPAL4四突變體雖然沒有完全喪失PAL活性(約為野生型的10%)，但是卻極度矮化和不育，特別是在幼苗發(fā)育早期，因此，完全破壞PAL基因很可能導致其致死。另外，在AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3三突變體和AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3、AtPAL4四突變體中沒有發(fā)現(xiàn)花粉粒，且這些突變體都是不育的，這與之前報道的反義抑制矮牽?；ㄋ幹悬S酮類合成引起的雄性不育類似[1]。因此，AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3三突變體和AtPAL1、AtPAL2、AtPAL3、AtPAL4四突變體中黃酮類含量大量減少是導致其雄性不育的原因。這些結(jié)果支持苯丙烷代謝途徑對植物生長和發(fā)育是必需的[1]。

4.2受非生物因素的誘導表達

擬南芥AtPAL受光、溫度、水、損傷、重金屬和營養(yǎng)元素缺乏等非生物因素的單獨或協(xié)同誘導，并存在時空表達特性。

在脅迫條件下，植物對環(huán)境壓力作出響應的同時完成各種生命活動。在分子水平上，脅迫應答和耐受基因的誘導表達有助于植物適應不利的環(huán)境條件[17]。光質(zhì)和光照都會影響AtPAL的表達。在轉(zhuǎn)錄水平上光增加了3周齡擬南芥植株的AtPAL1表達量[4,18]，白光處理緩慢積累了AtPAL1的轉(zhuǎn)錄，最高是在光照2～4 h[4]。雖然與暗培養(yǎng)相比光培養(yǎng)幼苗AtPAL1的表達量有所增加，但它們的表達趨勢卻一致，且培養(yǎng)3 d的幼苗表達量最高，表明無論是光培養(yǎng)還是暗培養(yǎng)，在發(fā)育的幼苗中AtPAL1的表達受到嚴格的時間調(diào)控[17]。藍光處理增加了暗培養(yǎng)白化苗與飽和紅光培養(yǎng)幼苗中AtPAL1的轉(zhuǎn)錄表達量[17,19]，雖然表達趨勢一致，但是藍光處理時培養(yǎng)3 d的幼苗中AtPAL1表達量高于培養(yǎng)7 d的幼苗[19]。此外，與藍光相比，紫外光更加促進了AtPAL1的表達[17]。有趣的是，光照強度還能引起對環(huán)境條件敏感的AtPAL1、AtPAL2雙突變體可育性的變化，因為光照強(120 μEm-2S-1)時AtPAL1 、AtPAL2雙突變體可育，光照弱(50 μ Em-2S-1)時AtPAL1 、AtPAL2雙突變體則不育[1]。低溫只誘導了葉中AtPAL1和AtPAL2的表達，并且受光和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，這可能與它們在轉(zhuǎn)錄起始位點上游330 bp內(nèi)光應答的SORLIP基序相關，因為AtPAL3和AtPAL4缺乏這種基序也不受低溫誘導[13,18]。面對不同種類的水分脅迫，AtPAL2的響應機制則不同，Nacl引起水分脅迫時，在葉中的表達量減少，根中的表達量增加；而PEG引起水分脅迫時，AtPAL2的表達則不受任何影響[1]。損傷和氯化汞脅迫處理，瞬時和大量地誘導了AtPAL1的轉(zhuǎn)錄表達[4]。缺氮處理時AtPAL1和AtPAL2的轉(zhuǎn)錄增加了2倍[10]。

4.3受生物因素的誘導表達

非致病菌對AtPAL1的影響遠大于致病菌，AtPAL1在非致病型寄生霉菌(Peronosporaparasitica)和非致病型西紅柿丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)的非親和互作中大量表達，而在致病型寄生霉菌(Peronosporaparasitica)和致病型西紅柿丁香假單胞菌親和互作中很少誘導表達[20-21]。葉與西紅柿丁香假單胞菌非親和互作中，2 d后在未接種的根中誘導了AtPAL2的表達，推測為遭受細菌侵害時，葉片會通過信號傳遞來誘導植株獲得系統(tǒng)性抗性；而葉與西紅柿丁香假單胞菌親和互作中，在葉中專性地瞬時(1 d)誘導了AtPAL2的表達，2 d后快速下降到起始水平，表明兩種西紅柿丁香假單胞菌株通過器官特異性的方式誘導了AtPAL2的表達[7]。這些都反應了面對不同的致病菌，AtPAL采取了不同的響應機制。

5生理學意義

擬南芥中AtPAL表達與苯丙烷類的合成密切相關，由苯丙烷類合成的木質(zhì)素不僅與植物的發(fā)育和結(jié)構適應相關，同時也抵御病原物微生物的侵染；苯丙烷類也是黃酮類、水楊酸、可溶性的苯丙烷類和芥子酸酯等化合物合成的前體，它們在擬南芥生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮了重要作用。

5.1木質(zhì)化作用

PAL是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶, 也是合成木質(zhì)素的關鍵酶。木質(zhì)素的形成可以增加細胞壁的厚度, 增加組織木質(zhì)化程度,形成病原菌入侵的機械屏障[6]，是植物維管束系統(tǒng)次生加厚細胞壁的主要結(jié)構復合物，對維持植物莖直立及傳導水、礦物質(zhì)和光合產(chǎn)物具有重要的作用[1]。在擬南芥生長發(fā)育過程中，木質(zhì)素的合成雖然與AtPAL4相關，但主要與木質(zhì)化組織中AtPAL1和AtPAL2組成型和協(xié)同表達相關[1,4,7]，而且AtPAL1或AtPAL2單突變體都沒有顯著地減少木質(zhì)素含量，表明AtPAL1和AtPAL2同工酶之間的互作保障了木質(zhì)素的生物合成，避免了對植物結(jié)構造成的不利影響[7,13]。

5.2參與植物色素的形成

為了防止紫外光造成的損傷，AtPAL1在幼苗中快速表達以積累花色素[4]，使植物具備一定的選擇優(yōu)勢[17]，而且花色素的積累受到嚴格的發(fā)育控制和光受體調(diào)節(jié)[2]。

5.3抵御病菌侵染

為了防止病菌感染[4.20-21]，AtPAL1以結(jié)構適應的方式逐步誘導，參與木質(zhì)素的生物合成[7]，木質(zhì)素不僅加厚了植物細胞壁使其抵御病菌水解酶的攻擊，同時，植物細胞之間通過自由基調(diào)節(jié)木質(zhì)素前體的聚合，從而木質(zhì)化病菌[20]。另外，AtPAL1也參與水楊酸的生物合成，在抑制寄生霉菌時水楊酸的作用遠大于木質(zhì)素抗性作用[20]。

5.4耐低溫

低溫脅迫時，AtPAL1和AtPAL2協(xié)同誘導，使植株可溶性的苯丙烷類、芥子酸酯和黃酮類增加以耐低溫[13,21]。此外，低溫脅迫時AtPAL1誘導具有光依賴性，與花青素的積累緊密相關，但是在擬南芥耐凍過程中不需要這些色素[18]。

6結(jié)論與展望

總之，AtPAL家族是擬南芥生長發(fā)育所必需，它們在植物生長、發(fā)育和環(huán)境響應時發(fā)揮著不同和冗余的雙重功能。目前的研究主要集中在AtPAL1和AtPAL2，今后應加強對AtPAL3和AtPAL4的研究。同時，更應該重視擬南芥4個PAL基因家族的不同成員與下游何種代謝支路形成何種代謝通道，以及這種代謝通道在何時、何部位形成何種代謝產(chǎn)物及其發(fā)揮的生理功能研究，以便調(diào)控PAL基因的表達，有目的地改變下游代謝產(chǎn)物的組成和含量。

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Research progress of Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene in Arabidopsis thaliana

(.*)

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Abstract：Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is the key rate-limiting enzyme of phenylpropanoids thatare widely involved in various physiological activities of plant growth and development. Summarized research progress of molecular biology and physiology of PAL gene of Arabidopsis thaliana，including its structure，expression characterization，regulatory mechanism and physiological function. It will provide a reference basis to clarify the function of PAL gene.

Key words:Arabidopsis thaliana；Phenylalanine ammonia-lyase；expression；physiological function

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7999(2016)01-0088-05

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.01.016

作者簡介：孫海燕(1991—)，女，吉林長春人，在讀碩士，研究方向為特種植物資源。吳松權為通信作者，E-mail:arswsq@ybu.edu.cn

收稿日期：2016-02-16基金項目：國家自然科學基金項目(21462044)