去氧乙烯基環(huán)己烯致雌鼠卵巢功能衰竭的動物模型研究進(jìn)展

耿利華, 談 勇

(南京中醫(yī)藥大學(xué), 南京 210023)

·綜 述·

去氧乙烯基環(huán)己烯致雌鼠卵巢功能衰竭的動物模型研究進(jìn)展

耿利華, 談 勇

(南京中醫(yī)藥大學(xué), 南京 210023)

卵巢功能早衰(premature ovarian failure, POF)是一種以卵巢功能提前衰退為主要特征的生殖系統(tǒng)疾病。POF發(fā)病率雖高,但早期發(fā)現(xiàn)并診斷為POF的患者甚少，限制了對疾病的研究，因此建立與人類相似的生殖內(nèi)分泌和組織學(xué)變化的POF模型對于POF發(fā)病機(jī)制的研究和進(jìn)一步的治療具有很大價值。實驗中可以通過多種方法成功制備POF動物模型。本文主要從去氧乙烯基環(huán)己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD)注射濃度的大小，注射時間的長短，利用不同日齡的雌鼠，不同物種，及與卵泡的募集、生長、發(fā)育和凋亡密切相關(guān)的眾多調(diào)控因子等方面綜述VCD誘導(dǎo)的卵巢功能衰竭模型的研究進(jìn)展。

去氧乙烯基環(huán)己烯(VCD); 卵巢功能早衰(POF); 研究進(jìn)展; 動物模型

目前臨床上還缺乏卵巢功能早衰(premature ovarian failure, POF)的明確診斷標(biāo)準(zhǔn), Pouresmaeili等[1]認(rèn)為婦女在40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng), 促性腺激素(folliele stimulating hormone，F(xiàn)SH)與黃體生成素(luteinizing hormone，LH)升高，雌激素(estrogens)與抑制素(inhibins)降低是POF的表現(xiàn)。廣義的POF是指高促性腺激素性閉經(jīng)，包括POF和卵巢不敏感綜合征。卵巢不敏感綜合征(insensitive ovary syndrome，IOS)是指原發(fā)性閉經(jīng)或30歲前繼發(fā)性閉經(jīng), 內(nèi)源性FSH升高, 卵巢內(nèi)有始基卵泡和竇狀卵泡存在, 但對外源性FSH不敏感，因此卵泡不能發(fā)育成熟[2,3]。POF是由于卵巢合成性激素功能低下或者不能合成,降低了對下丘腦-垂體軸的負(fù)反饋作用，導(dǎo)致FSH升高和雌激素降低的一種狀態(tài)?？梢詫?dǎo)致一系列生殖與健康問題，包括低雌激素所帶來的生殖功能問題、心理問題及非生殖問題，近10年來POF在育齡婦女中發(fā)生率有逐年升高且向低齡化的發(fā)展趨勢，對其診治的研究越來越受到重視[4]。所以建立與人類在生殖內(nèi)分泌和組織學(xué)變化方面相似的POF模型對于其發(fā)病機(jī)制的研究和進(jìn)一步的治療具有很大的臨床意義。

實驗中常用的動物模型具有各自的優(yōu)缺點, 但均是從單一方面模擬婦女POF，不能很好模擬婦女POF的生理性過程, 而近幾年來出現(xiàn)的4-乙烯基環(huán)己烯(VCD)誘導(dǎo)POF動物模型, 展現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢。

1 常用POF動物模型

1.1 卵巢摘除模型

人工摘除雌性育齡未妊娠鼠雙側(cè)卵巢。建模成功后，血清雌二醇(E2)含量顯著降低，子宮臟器系數(shù)降低，此模型成功地模擬了人類更年期時出現(xiàn)的較低雌激素水平，但未能模擬出人類更年期從無到有、從前到后的轉(zhuǎn)化過程。然而,大部分絕經(jīng)婦女保留了卵巢組織，去卵巢模型則缺乏由殘存卵巢組織分泌雄激素的能力，不能體現(xiàn)人類卵巢中雄激素對剩余卵巢組織的影響[5]。

1.2 基因敲除模型

該模型對闡述POF發(fā)生機(jī)制有重要作用，但是往往一種基因敲除模型只能解釋一個或幾個基因，而POF的發(fā)生不僅僅是一個基因的缺陷或突變所導(dǎo)致，因此不能完全解釋POF的病因，其后續(xù)治療等方面也有其局限性，同時此模型造模成本較高，相對難以推廣應(yīng)用。

1.3 半乳糖血癥模型

此模型是一種常染色體隱性遺傳疾病, 是由于半乳糖在代謝過程中，酶功能的缺陷而導(dǎo)致半乳糖代謝障礙和體內(nèi)半乳糖及其代謝產(chǎn)物在血和組織中堆積而引起的一種代謝功能紊亂的癥候群[6]。半乳糖血癥的發(fā)病率為1/60 000～1/40 000[7]。半乳糖血癥導(dǎo)致的POF臨床病例很少，缺乏實用臨床意義。

1.4 自身免疫性動物模型

將2～4日齡新生小鼠的胸腺切除后，與母鼠同籠喂養(yǎng)，造模成功時出現(xiàn)急性卵巢炎的表現(xiàn)和大量的卵泡被淋巴細(xì)胞浸潤與破壞，然后出現(xiàn)卵巢萎縮和抗卵細(xì)胞、抗(ZP)抗體[8]。此模型只是從免疫學(xué)方面來探討與POF的關(guān)系，不能夠模擬POF的逐步變化過程。

1.5 化療模型

實驗中化療藥物所致POF模型常用的藥物有紫杉醇、順鉑和環(huán)磷酰胺, 此模型主要研究醫(yī)源性因素對POF的影響, 也不能模擬婦女生理性的POF過程。

1.6 自然衰老模型

Chakraborty等[9]研究表明，17月齡左右的老年鼠雖已進(jìn)入無明顯動情周期狀態(tài)，但發(fā)情狀態(tài)持續(xù)存在。2年齡的老年鼠也仍然具有大量的初級卵泡，但是這與人類POF患者的卵巢內(nèi)幾乎沒有原始卵泡的狀態(tài)截然不同。

上述造模方法都是針對POF的不同病因而設(shè)，因此具有一定的局限性，只適用于不同類型POF的實驗研究。近年來，應(yīng)用VCD誘導(dǎo)POF動物模型，進(jìn)行了多方面研究。對本病發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)。

2 VCD誘導(dǎo)動物模型

VCD是4-乙烯環(huán)己烯 (4-vinylcyclohexene，VCH)的代謝產(chǎn)物,是由1,3-丁二烯的二聚體構(gòu)成, 而1,3-丁二烯是制造殺蟲劑、滅火劑、橡膠、塑料等的副產(chǎn)品。環(huán)境化學(xué)物質(zhì)VCD是一種新型的卵巢毒性物質(zhì), 可以理想地模擬出POF的生理過程。以下將從各個方面介紹VCD誘導(dǎo)POF模型的進(jìn)展。

2.1 卵泡凋亡

Hu Xiaoming等[10]研究表明VCD能激活原始卵泡和初級卵泡中與凋亡有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號通路，尤其是增加原始卵泡和初級卵泡中的前凋亡基因Bax、Bad的表達(dá)，增加線粒體膜上Bax/Bcl-xl的比值(Bcl-xl為抑制凋亡基因), 使細(xì)胞色素C(與細(xì)胞凋亡有關(guān))由線粒體向胞質(zhì)釋放，Caspase-3(屬于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶族的一分子，為凋亡效應(yīng)子)活性增強(qiáng)等,這些均證實了VCD所致的POF是通過加速卵泡凋亡即卵泡閉鎖的過程來實現(xiàn)。

Chabra等[11]報道, 暴露于VCH的工人抱怨有刺鼻氣味和頭痛, 暴露于VCD的工人稱其對皮膚有刺激性。因此推測暴露于VCH或VCD的人們可能就蘊含著潛在的健康危害。已有動物實驗[12-14]表明，VCD能選擇性地破壞雌鼠和靈長類動物的原始卵泡和初級卵泡,加速卵泡凋亡,最終引起雌鼠和靈長類動物POF。進(jìn)一步研究[15]表明VCD是直接作用于原始卵泡與初級卵泡的卵母細(xì)胞，加快卵泡閉鎖。

細(xì)胞凋亡(apotosis)是一個細(xì)胞自我破壞的程序性過程，出現(xiàn)在正常生理狀態(tài)或疾病中，在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程[16]。在正常情況下，卵泡顆粒細(xì)胞的分裂和凋亡現(xiàn)象一同發(fā)生, 當(dāng)顆粒細(xì)胞凋亡達(dá)10%以上時，則預(yù)示著該卵泡閉鎖[17]，提示細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的前提。由于出生時卵巢中始基卵泡的數(shù)目就已定, 卵泡閉鎖又是卵巢正常生理機(jī)能的重要一部分, 是其生理性除掉多余組織的一個過程，所以少量卵泡的閉鎖并不影響周圍卵泡的正常發(fā)育， 只有當(dāng)大量卵泡的閉鎖速度快于生理代謝速度時，才可能發(fā)生POF。

2.2 不同VCD注射濃度、時間及不同實驗對象

國外大量文獻(xiàn)報道VCD對卵巢的影響因注射濃度、注射時間、雌鼠的日齡和物種的不同而不盡相同。

Muhammad等[18]研究顯示，給平均129日齡SD大鼠連續(xù)15 d肌肉注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，與對照組比，一側(cè)卵巢原始卵泡和初級卵泡分別減少了80 %、76%; 而連續(xù)12～13 d肌肉注射VCD (160 mg·kg-1·d-1)，一側(cè)卵巢原始卵泡和初級卵泡分別減少了90%、99%,但對次級卵泡均沒有明顯影響。給平均154日齡SD大鼠，連續(xù)30 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，與對照組比，雙側(cè)卵巢原始卵泡和初級卵泡共減少了80%; 連續(xù)10～13 d腹腔注射VCD (160 mg·kg-1·d-1), 雙側(cè)卵巢原始卵泡和初級卵泡共減少了60%。前者與對照組比, 次級卵泡的數(shù)目減少。而后者次級卵泡數(shù)目并不低于對照組。給269日齡、28日齡SD大鼠連續(xù)30 d分別腹腔注射VCD(40 mg·kg-1·d-1),與對照組比, 269日齡大鼠原始卵泡與初級卵泡分別減少了48%和41.9%; 28日齡SD大鼠原始卵泡與初級卵泡分別減少了37.9%和19%; 同樣方法, 采用80 mg·kg-1·d-1VCD, 269日齡大鼠原始卵泡與初級卵泡分別減少了90.7%和87.5%; 28日齡大鼠原始卵泡與初級卵泡分別減少了81.4%和68.3%。研究表明，盡管VCD對不同日齡大鼠的小卵泡影響頗為相似，但269日齡成年鼠因開始實驗時其卵泡數(shù)目已明顯少于28日齡大鼠，所以VCD處理后，可以很明顯地看到卵泡數(shù)目下降。

Kao等[19]用28日齡雌性F344大鼠和B6C3F1小鼠分別腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)6 d、8 d、10 d、12 d后觀察，與對照組比，在注射 8 d的小鼠卵巢中，首先觀察到原始卵泡的閉鎖，而大鼠直到注射10 d后才觀察到原始卵泡的閉鎖。在注射12 d，兩種動物的初級卵泡與對照組比無統(tǒng)計學(xué)差異。在注射12 d后，才觀察到大鼠與小鼠的原始卵泡和初級卵泡數(shù)目均減少, 但小鼠原始、初級卵泡的減少量要多于大鼠。VCD對卵泡的損傷程度大鼠和小鼠相似，但對小鼠卵泡的損傷要早于大鼠，表明小鼠更易受到VCD的卵巢毒性影響。

Lohff等[20]用160 mg·kg-1·d-1VCD給28日齡B6C3F1雌性小鼠連續(xù)腹腔注射10 d和20 d，結(jié)果顯示，注射10 d后，與對照組比，小鼠卵巢中的原始卵泡和初級卵泡分別減少了93.2%、85.1%,注射10 d組小鼠達(dá)到POF平均需135 d, 注射20 d組小鼠平均只需52 d。

從以上實驗中可以總結(jié)出VCD所造POF模型用不同日齡的雌鼠，成年鼠所需VCD劑量少; 相同日齡的雌鼠，VCD注射的時間長，則造?？? 與大鼠比，小鼠更易于受到VCD的卵巢毒性影響; 不同VCD濃度，濃度越大則成模越快。

2.3 凋亡調(diào)控蛋白

卵巢中卵泡的募集、生長、發(fā)育與凋亡是眾多調(diào)控因子共同參與的結(jié)果，如Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、Caspases(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)-3、Caspases-6、Caspases-9等，VCD誘導(dǎo)大鼠POF的機(jī)制與以上因子密切相關(guān)。

Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白質(zhì)[21]。Bcl-2家族成員根據(jù)在細(xì)胞凋亡過程中的作用可以分為兩類: 一類是抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xl等; 另一類是促凋亡蛋白，包括Bax、Bad等[22]。根據(jù)Caspases在級聯(lián)反應(yīng)的上下游位置及功能的不同, 可以分為三類。Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9等位于級聯(lián)反應(yīng)的上游即為凋亡始動子; 位于級聯(lián)反應(yīng)的下游即為凋亡效應(yīng)子,包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡是通過線粒體途徑即細(xì)胞內(nèi)源性途徑介導(dǎo)的，凋亡刺激信號使Bax直接與線粒體膜結(jié)合,形成線粒體跨膜通道, 誘導(dǎo)線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放細(xì)胞色素C, 細(xì)胞色素C與凋亡促進(jìn)因子1、Caspase-9形成復(fù)合物，在dATP與ATP的作用下，活化

根據(jù)Caspases在級聯(lián)反應(yīng)的上下游位置及功能的不同，可以分為三類。Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9等位于級聯(lián)反應(yīng)的上游即為凋亡始動子;位于級聯(lián)反應(yīng)的下游即為凋亡效應(yīng)子，包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等。卵巢顆粒細(xì)胞凋亡是通過線粒體途徑即細(xì)胞內(nèi)源性途徑介導(dǎo)的，凋亡刺激信號使Bax直接與線粒體膜結(jié)合,形成線粒體跨膜通道，誘導(dǎo)線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放細(xì)胞色素C, 細(xì)胞色素C與凋亡促進(jìn)因子1、Caspase-9形成復(fù)合物，在dATP與ATP的作用下，活化Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等凋亡效應(yīng)子，使凋亡進(jìn)一步進(jìn)行下去[15]。其中Caspases的活化又促進(jìn)了這一過程，這樣對于凋亡的加速和凋亡信號傳遞有十分重要意義。

Hu等[10]給28日齡雌性F344大鼠連續(xù)15 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)。15 d后與對照組相比，Bad在小竇卵泡中表達(dá)量增加，Bcl-xl與Bax無差異; Bcl-xl在線粒體中的表達(dá)水平下降，在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)水平則增加。Bax蛋白在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分布與對照組比沒有差異。在細(xì)胞質(zhì)與線粒體中Bad蛋白分布都增加。Bax/Bcl-xl的比例在發(fā)生凋亡細(xì)胞的線粒體膜上升高。

可見VCD所導(dǎo)致大鼠卵泡細(xì)胞凋亡與蛋白Bad、Bax表達(dá)量的增加、Bcl-xL重新分布、Bax/ Bcl-xL的比值增加和細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。

Hu 等[23]另一項類似研究表明, 注射15 d后, 在直徑為25～100 μm小卵泡細(xì)胞質(zhì)中的Caspase-3的活性增加, 在小卵泡中Procaspase-3蛋白表達(dá)量增加了212%; 原始卵泡與小初級卵泡中的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中Caspase-3蛋白表達(dá)量增加, 小卵泡中Caspase-8的活性增強(qiáng), 而Caspase-9在注射1 d后小卵泡線粒體中的活性增加。

2.4 性激素、動情周期的觀察

VCD能夠選擇性地破壞雌鼠和靈長類動物的原始卵泡與初級卵泡，逐漸減少嚙齒類動物的卵泡,因此其甾體類固醇激素如E2、孕激素(P)、睪酮(T)等和評估卵巢儲備的FSH、LH、抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone, AMH)、抑制素B(inhibin B, INHB)等激素也將會受到影響。

Zhu等[24]給28日齡SD雌性大鼠連續(xù)14 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，停藥后30 d，F(xiàn)SH、LH升高，E2下降，類似于絕經(jīng)狀態(tài)。Reis等[25]給28日齡Wistar雌性大鼠連續(xù)15 d腹腔注射VCD (160 mg·kg-1·d-1)，停藥后60～70 d，P、T和雙氫睪酮(DHT)水平升高，而FSH、E2無變化。Mayer等[26]給28日齡F344雌性大鼠連續(xù)30 d腹腔注射VCD(80 mg·kg-1·d-1)，停藥后90 dFSH開始升高。

Lohff等[20]給28日齡B6C3F1雌性小鼠連續(xù)10 d腹腔注射VCD(160·kg-1·d-1)，停藥后34 d，F(xiàn)SH升高; 連續(xù)注射20 d，停藥后15 d，F(xiàn)SH升高。Lohff等[27]給28日齡C57B1/6雌性小鼠連續(xù)15 d腹腔注射VCD(160 mg·kg-1·d-1)，觀察了12個性周期。VCD組1～4個周期長短(平均5.8 d)、FSH水平與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異; 5～12個周期，VCD組周期比對照組平均延長10.9 d，同時FSH水平明顯升高; 1～12個周期, E2和孕酮(P4)水平無顯著變化。

3 VCD誘導(dǎo)POF模型的優(yōu)點

VCD所致POF動物模型與常用造模方法相比具有如下優(yōu)點: (1)能很好模擬生理性的POF，能夠動態(tài)模擬婦女POF的過程。它能選擇性破壞雌鼠卵巢中的小卵泡(原始卵泡和初級卵泡)，對大卵泡(次級卵泡和成熟卵泡)無直接影響。由于募集階段的小卵泡數(shù)目減少, 導(dǎo)致血清FSH、LH升高, E2下降, 卵泡耗竭而致POF, 它是一個逐步變化的過程。(2)它對性腺以外的其它器官幾乎無影響[28]。(3)VCD引起POF的機(jī)制是增加卵泡閉鎖的速度, 卵巢和子宮組織學(xué)檢查并未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。

制備良好的POF模型應(yīng)符合下列幾個條件[29]: (1)動情周期紊亂; (2)卵泡數(shù)目顯著減少; (3)血清FSH明顯升高，E2明顯降低。以上3點符合婦女POF疾病特征，反應(yīng)了POF所導(dǎo)致的卵巢損傷。VCD所造POF模型能夠很好地模擬婦女生理性的POF。能夠動態(tài)演示POF逐步變化的過程。因此利用VCD建立與人類相似的生殖內(nèi)分泌和組織學(xué)變化的POF模型對于POF發(fā)病機(jī)制的研究和治療藥物的開發(fā)具有非常重要的臨床意義。

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Research Progress on Premature Ovarian Failure Animal Model induced by Vinylcyclohexene Diepoxide

GENG Li-hua, TAN Yong
(Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

Premature ovarian failure(POF) is a reproductive system disease as the main characteristics of ovarian function decline in advance.Although the high morbidity, there are few patients found and diagnosed early,which limits the study of the disease. Accordingly establishing the POF animal model which is similar to anthropic reproductive endocrinology and histological changes is of great value to POF pathogenesis reseach and further treatment.In experiments, POF model can be prepared by many methods, but current animal models of POF fail to adequately replicate this particular stage in female life. The article states the research progress of POF model induced by 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) mainly on the diverse injection concentration, different injection time, disparate day age, distinct species and a large amount of regulatory factors which closely participated in follicular recruitment, growth and apoptosis.

4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD); Premature ovarian failure (POF); Research progress; Animal model

Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0404-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.018

2016-07-04

上海海天醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司(2015026)

耿利華(1989-), 女, 碩士研究生, 研究方向: 不孕癥。E-mail: 280582831@qq.com

談 勇。 E-mail: 574294491@qq.com